1. Materiali sperimentali
C. oleifera Le foglie 'Dabieshan 1' venivano raccolte in tre fasi chiave dello sviluppo: la fase giovanile, intorno ai 2 anni; Il soggetto progredisce in una fase di fruttificazione precoce intorno ai 6 anni, raggiungendo infine il suo periodo di massimo fruttificazione a circa 10 anni. Tutte le piante di C. oleifera nelle tre fasi di sviluppo sopra elencate sono state piantate utilizzando piantine coltivate in contenitore della stessa specifica di C. oleifera 'Dabieshan 1'. Le proprietà fisiche e chimiche del suolo nei terreni forestali di C. oleifera sono state mostrate nella Tabella 1.
2. Panoramica del sito di raccolta
Materiali sperimentali sono stati raccolti da Heping Town, situata nel cuore della provincia di Anhui. La contea di Shucheng si trova nella regione centrale della provincia, appartenente all'area periferica dei Monti Dabie. Le coordinate sono 31°11′N, 116°47′E, con un'altitudine media di 90 m. Il suolo è classificato come giallo-marrone. La regione presenta un modello climatico monsonico subtropicale umido, che mantiene una temperatura media annua di 15,6 °C e registra tipicamente circa 1.100 mm di precipitazione all'anno, gode di circa 1.969 ore di sole all'anno e un periodo senza gelate di 224 giorni.
3. Raccolta e pretrattamento dei campioni
I campioni sono stati selezionati durante il periodo pre-fioritura (fine settembre). Per ogni fase di sviluppo, sono state selezionate le piante di C. oleifera con crescita simile, costante e forte. Da ogni pianta veniva rimossa la terza foglia dall'alto verso il basso, che consisteva in germogli primaverili a crescita moderata provenienti dalle direzioni est, ovest, sud e nord della parte esterna della corona di C. oleifera . I campioni sono stati contrassegnati con lettere e numeri seriali: YAT1, YAS2 e YAT3 per le foglie di C. oleifera nello stadio giovanile, il soggetto progredisce verso una fase di fruttificazione precoce e il periodo di fruttificazione di picco, rispettivamente. Questi venivano raccolti e conservati in azoto liquido. Cinque alberi campionari casuali da ogni stadio sono stati selezionati come una replica biologica, e tre repliche biologiche sono state create in tutte le fasi. Gli esemplari selezionati furono riportati lo stesso giorno in laboratorio e conservati a -80 °C.
4. Determinazione dell'indice fisiologico
Il contenuto di zucchero solubile è stato determinato dal metodo colorimetrico dell'anthrone21. Il contenuto di carbonio organico è stato determinato tramite il metodo di titolazione del solfato di dicromato di potassio- solfato ferroso 22. Il contenuto di proteine solubili è stato ottenuto con il metodo Coomassie brilliantblue 23. La concentrazione totale di azoto è stata quantificata dal metodo di Kjeldahl22.
5. È stato effettuato l'isolamento dell'RNA completo, seguito dalla costruzione di una libreria complementare di DNA (cDNA) e dal successivo sequenziamento
L'RNA totale è stato estratto dalle foglie di C. oleifera in diverse fasi utilizzando il kit di estrazione dell'RNA vegetale. La concentrazione totale di RNA è stata determinata da uno spettrofotometro visibile ultravioletto a spettro completo. L'integrità e la chiarezza dell'RNA sono state determinate da un analizzatore biologico. Dopo la costruzione e la validazione della libreria cDNA, il sequenziamento trascrittomico è stato condotto utilizzando una piattaforma di sequenziamento ad alta produttività sequence-by-sequencing. La procedura di sequenziamento produceva letture individuali, ciascuna coprendo 100 coppie dibasi 24, 25 e 26. I risultati dell'allineamento dei processi di sequenza sono stati sottoposti ad analisi statistica utilizzando il softwareRSEM 27. I geni di espressione differenziale (DEG) in varie fasi dello sviluppo di C. oleifera sono stati identificati utilizzando il software di analisi differenzialeDESeq 28,29.
6. Assemblaggio de novo e annotazione UniGene
SeqPrep http://github.com/jstjohn/SeqPrep) e Sickle (http://github.com/najoshi/sickle) sono stati utilizzati per filtrare i dati grezzi, inclusa la rimozione di sequenze di bassa qualità e adattatori contaminati. Successivamente, le letture pulite ottenute da ogni campione venivano assemblate utilizzando il softwareTrinity 30,31. Tutti i trascriverti assemblati sono stati sottoposti all'allineamento BLASTX contro lo Swiss-Prot, cluster di gruppi ortologi per genomi completi eucariotici e database KEGG in ordine sequenziale. Un tipico valore E di soglia (valore E <10−5) veniva impostato per recuperare le loro annotazioni di funzione. Il KEGG è stato applicato per analizzare le vie metabolichecorrelate 32.
7. Annotazione funzionale dei geni e analisi genica espressa differenzialmente
Le abbondanze geniche e isoforme sono state analizzate statisticamente utilizzando il softwareRSEM 27. È stato fissato un cut-off (P < 0,05, FDR < 0,01, |log2FC|>1) per identificare i geni espressi differenzialmente (DEG). Il numero atteso di frammenti per kb di trascrizione per milione di frammenti mappati (FPKM) è attualmente il metodo più utilizzato per stimare i livelli di espressionegenica 28. Sono stati calcolati i valori FPKM di tutti i geni delle tre diverse fasi di crescita e sviluppo (YAT1, YAS2 e YAT3). È stata condotta un'analisi gerarchica di clustering per esaminare i livelli differenziali di espressione genica. Nel frattempo, la via KEGG è stata preparata per identificare DEG significativamente arricchite nelle vie metaboliche a P corretta da Bonferroni ≤ 0,05 rispetto all'intero trascrinome usandoKOBAS 29.
8. Metodi analitici
I dati sono stati presentati utilizzando Excel per calcolare valori medi e deviazioni standard. L'analisi della varianza (ANOVA) è stata utilizzata per l'analisi statistica tramite il software SPSS, mentre il test a più intervalli di Duncan è stato utilizzato per valutare differenze significative nel contenuto di nutrienti tra le tre fasi. Successivamente, differenze significative tra i gruppi sono state determinate tramite confronti multipli post-hoc con il metodo della Minima Differenza Significativa (LSD). Grafici e tabelle venivano generati utilizzando il software Origin per visualizzare i risultati sperimentali e analitici. Non è stata indicata alcuna significatività statistica con 'ns' (P > 0,05). Le differenze statisticamente significative erano indicate rispettivamente con '*' (P < 0,05), '**' (P < 0,01), '***' (P < 0,001) e '****' (P < 0,0001).