Research Article
Questo protocollo stabilisce una pipeline integrata multi-omica (trascripto e proteoma) combinata con screening farmacologico in rete per identificare motori molecolari e bersagli terapeutici per la disfunzione endoteliale nelle complicazioni diabetiche.
La disfunzione endoteliale è un fattore chiave della malattia renale diabetica (DKD), ma i suoi meccanismi molecolari sistemici rimangono incompletamente decodificati. Abbiamo ipotizzato che l'analisi integrata multi-omica potesse mappare i danni endoteliali indotti dall'iperglicemia e identificare terapie riutilizzabili. È stata applicata una pipeline computazionale riutilizzabile per integrare profili trascrittomi/secretomici provenienti da cellule endoteliali iperglicemiche e reni diabetici. Questo ha identificato 534 geni/proteine comunemente sovraregolate. L'arricchimento funzionale ha rivelato l'attivazione del rimodellamento della matrice extracellulare, della comunicazione intercellulare e delle vie di infiammazione. La validazione cross-database ha raffinato 278 mediatori ad alta fiducia e l'analisi delle reti di interazione proteina-proteina ha individuato dieci geni hub. Utilizzando la farmacologia di rete, abbiamo analizzato una libreria di farmaci approvati, identificando diversi composti candidati (ad esempio, bruceantin, idelalisib) che potrebbero colpire questa rete. Inoltre, la regolazione dei fattori di trascrizione e simulazioni esemplari di aggancio molecolare (ad esempio, idelalisib con CTCF/BRD4) fornivano ipotesi meccanicistiche per la validazione sperimentale. In conclusione, questo studio stabilisce un quadro multi-omico riutilizzabile che delinea i meccanismi patogeni endoteliali nella DKD e nomina candidati farmaci riutilizzabili, offrendo un approccio strategico per la scoperta meccanicistica e terapeutica.
Il diabete, come sfida sanitaria globale, ha colpito 529 milioni di persone in tutto il mondo nel 2021, con proiezioni che indicano che influenzerà 1,31 miliardi di persone entro il 2050. Oltre al controllo glicemico, le complicazioni a lungo termine sono la principale fonte di morbilità, mortalità e riduzione della qualità della vita. Queste includono complicazioni microvascolari (ad esempio, malattia renale diabetica (DKD), retinopatia, neuropatia) e complicazioni macrovascolari (ad esempio, aterosclerosi accelerata). In modo cruciale, la DKD colpisce dal 30%-40% dei pazienti diabetici, rappresentando la principale causa di malattia renale terminale (ESRD) a livellomondiale 2. Il profondo peso di queste complicanze sottolinea un bisogno urgente e insoddisfatto di nuove terapie che mirino ai loro meccanismi sottostanti.
Le cellule endoteliali (EC), che costituiscono il rivestimento interno di tutti i vasi sanguigni, sono i guardiani fondamentali della salute vascolare. La disfunzione endoteliale indotta dall'iperglicemia agisce come un fattore centrale della vascolopatia diabetica e dei danni agli organi 3,4. Livelli elevati di glucosio innescano una cascata di risposte maladattive all'interno delle EC, comprendendo biodisponibilità disregolata dell'ossido nitrico (NO), aumento della secrezione di endotelina-1 (ET-1), aumento dell'espressione delle molecole di adesione (ad esempio, VCAM-1, ICAM-1), aumento dello stress ossidativo dovuto alla generazione eccessiva di specie reattive dell'ossigeno (ROS) (ad esempio, tramite NADPH ossidasi) e infiammazione persistente a basso grado 3,4. Collettivamente, queste alterazioni guidano una vasodilatazione compromessa, un aumento della permeabilità vascolare, l'adesione e l'infiltrazione dei leucociti, stati pro-trombotici e, infine, la rimodellazionevascolare 5. All'interno della microvascolatura renale, il danno endoteliale glomerulare interrompe la barriera di filtrazione, favorisce l'albuminuria e contribuisce direttamente all'accumulo della matrice extracellulare (ECM), alla glomerulosclerosi e alla fibrositubulointerstiziale 5,6. La successiva attivazione delle cellule renali residenti, unita all'afflusso di cellule infiammatorie, stabilisce un circolo vizioso che amplifica la lesionerenale 5,7. In modo cruciale, gli studi clinici dimostrano che i marcatori della disfunzione endoteliale sistemica sono fortemente correlati con l'insorgenza e la progressione dell'albuminuria e con la diminuzione del tasso di filtrazione glomerulare (GFR) nei pazientidiabetici 6,7,8, sottolineandone la rilevanza diretta per gli esiti delle malattie umane. Nonostante la sua riconoscenza centrale, una comprensione completa a livello di sistema della precisa riprogrammazione trascrizionale e secretoria indotta dall'iperglicemia cronica nelle EC — in particolare le alterazioni che guidano il rimodellamento della CAM, fondamentale per la fibrosi renale — rimane incompletamente caratterizzata, limitando l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici meccanicici per la DKD e altre complicazioni vascolaridiabetiche 7,8.
La profonda complessità molecolare alla base della disfunzione endoteliale nel diabete rappresenta una sfida formidabile per gli approcci terapeutici tradizionali a bersaglio singolo. È qui che la biologia computazionale e la bioinformatica emergono come strumenti indispensabili, permettendo l'integrazione e l'estrazione di dataset omiche diversificate e ad alta dimensione per dare priorità ai hub causali all'interno delle reti patologiche e identificare strategie terapeutichemulti-targeting 9. In modo critico, gli approcci convenzionali monomodali (ad esempio, solo trascrizione/proteoma o screening farmacologico) spesso trascurano l'interazione critica tra strati molecolari (ad esempio, espressione genica, dinamica proteica, risposta farmacologica), fallendo nel catturare i fattori sinergici o gli effetti fuoribersaglio 10,11. La pipeline integrata multi-omica supera queste limitazioni profilando contemporaneamente dati trascrittomici, secretomici e farmacologici all'interno dello stesso sistema, ottenendo una visione olistica del meccanismo della malattia. La farmacologia di rete, gli algoritmi di predizione ligando/target e il docking molecolare in silico permettono l'esplorazione sistematica di librerie di farmaci approvate, accelerando il riposizionamento o la scoperta di composti capaci di contrastare firme patologichecomplesse 3. Questo cambiamento di paradigma offre un potenziale particolare per identificare terapie che mirano alla disregolazione endoteliale e le sue devastanti conseguenze microvascolari, come la DKD, offrendo il potenziale per una maggiore efficacia e profili di effetti collaterali ridotti. L'integrazione di analisi trascrittomiche/secretomiche di cellule endoteliali esposte all'iperglicemia ha identificato 534 molecole comunemente sovraregolate. L'arricchimento funzionale ha implicato il rimodellamento della matrice extracellulare, lo stress ossidativo e l'infiammazione nella patogenesi precoce della DKD. L'analisi cross-database ha dato priorità a 278 target ad alta fiducia, raffinati tramite reti PPI di geni hub. Lo screening farmacologico di rete dei farmaci approvati ha previsto 85 composti candidati (inclusi brefeldin-A, bruceantin, paracetamolo e idelalisib) che prendevano di mira questi hub. La previsione dei fattori di trascrizione in silico e l'attracco esplorarono i meccanismi. Questo lavoro delinea i motori endoteliali della DKD, stabilisce una pipeline di scoperta computazionale e fornisce candidati terapeutici per la validazione. In definitiva, si prevede che questa pipeline promuova programmi di scoperta terapeutica per le complicanze diabetiche.
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Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti con l'approvazione del Comitato per la Ricerca e l'Etica Animale dell'Istituto di Ricerca Medica di Hebei Yiling (numero di approvazione: N2024082). Consulta la Tabella dei Materiali per i materiali sperimentali e gli strumenti utilizzati in questo studio. Il personale deve indossare rigorosamente dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati quando maneggia reagenti pericolosi come TRIzol (irritante per la pelle/occhi, contenente fenolo) e inibitori proteasi (potenziali sensibilizzatori respiratori/cutanei). Segregare i rifiuti biologici/liquidi in sacchetti autoclavabili e i rifiuti chimici pericolosi in contenitori designati per lo smaltimento istituzionale di pericoli. Decontamina i consumabili prima di smaltirli.
Modellazione dei topi della nefropatia diabetica
I maschi di db/db e db/m (12 settimane) sono stati mantenuti in condizioni specifiche prive di patogeni (SPF) a 22 ± 2 °C e 56% ± 5% di umidità con cicli chiaro/scuro di 12 ore e accesso ad libitum a cibo/acqua. Dopo un periodo di acclimatazione di 1 settimana, ai topi sono stati assegnati casualmente identificatori numerici e assegnati a gruppi sperimentali. I topi db/db sono stati nutriti con una dieta ad alto contenuto proteico per 6 settimane per stabilire la DKD. La modellazione di successo è stata confermata da un rapporto albumina-creatinina urinaria (UACR) significativamente elevato rispetto ai controlli db/m, con UACR >30 mg/g che fungeva da biomarcatore funzionale principale per laDKD 12 precoce.
Modellazione delle cellule endoteliali ad alto livello di glucosio
Le Cellule Endoteliali Glomerulari Renali Umane (HRGEC) sono state preparate in condizioni standardizzate. Gli HRGEC sono stati coltivati in un mezzo di glucosio normale (NG, 5,5 mM D-glucosio) o ad alto contenuto di glucosio (HG, 30 mM D-glucosio) e mantenuti in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% diCO2. Le cellule sono state esposte ininterrottamente all'HG o coltivate in condizioni di controllo per 24 ore prima delle analisi a valle. Il controllo osmotico (HM, contenente 5,5 mM di D-glucosio con 24,5 mM mannitolo) deve essere incluso. Tutte le condizioni dovrebbero soddisfare criteri rigorosi di fitness cellulare: la vitalità è rimasta ≥85%, i livelli di apoptosi sono rimasti sotto il 15%, gli aumenti ROS dell'HG rispetto all'HM non hanno superato il 20% e il rilascio di LDH è rimasto sotto il 10%, convalidando l'integrità cellulare prima delle analisi a valle.
Raccolta di media condizionati
I mezzi condizionati (CM) sono stati raccolti utilizzando un protocollo standardizzato per l'analisi delsecretoma 13 con modifiche. Dopo 24 ore di stimolazione ad alto contenuto di glucosio (30 mM D-glucosio), glucosio normale (5,5 mM D-glucosio) o controllo osmotico (5,5 mM D-glucosio + 24,5 mM mannitolo), gli HRGEC sono stati lavati con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere le proteine sieriche residue. Le cellule sono state rifornite con mezzo endoteliale basale senza siero e senza fenolo rosso e incubate per 12 ore a 37 °C con il 5% di CO₂ per accumulare i fattori secreti.
Il CM veniva prelevato utilizzando tubi di centrifugazione pre-raffreddati. Sequenzialmente, l'elaborazione del campione veniva eseguita come descritto di seguito.
Principale chiarificazione: La CM è stata trasferita in tubi conici senza RNasi/DNasi e centrifugata a 3.000 x g per 10 minuti a 4 °C. I detriti a pallini sono stati scartati.
Inibizione della proteasi: Entro 2 minuti dalla chiarificazione primaria, è stato aggiunto un cocktail inibitore proteasi privo di EDTA a una concentrazione finale 1x (1:50) contenente 1x inhibitori della fosfatasi.
Concentrazione: Il soprantantante è stato immediatamente caricato in filtri centrifugi PBS pre-risciacqui (MWCO da 3 kDa) e centrifugato a 4.000 x g per 90 minuti a 4 °C per ottenere una concentrazione di 10x.
Precisazione secondaria: Il concentrato veniva trasferito in tubi microcentrifughe pre-raffreddati e centrifugato a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Veniva raccolto il soprantantante, evitando aggregati a pellet.
Conservazione: Aliquote di 50 μL sono state prodotte in crioviali sterili a basso legame proteico. Le fiale sono state congelate rapidamente in azoto liquido entro 30 minuti dal completamento del raccolto. Le fiale venivano conservate a -80 °C (senza cicli di congelamento-disgelo).
I lotti di CM sono stati sottoposti a test per endotossine (<0,25 EU/mL). Il protocollo di incubazione senza siero non ha mostrato induzione da stress (validato da immunoblot HSP70/CHOP). La resa della proteina CM è normalizzata in conteggio cellulare/DNA vitale al momento del raccolto. Rigore di elaborazione mantenuto: tecnica sterile per tutta la struttura; ≤finestra di 30 minuti dal raccolto al congelamento; Bilanciamento della temperatura del rotore confermato.
Test CCK-8 di cellule tubulari renali trattate con mezzo condizionato
Per valutare l'impatto funzionale del secretoma endoteliale sulla vitalità delle cellule tubolari renali, è stato eseguito un test CCK-8 sulla linea cellulare epiteliale tubulare prossimale renale umana HK-2 trattata con MC derivata dalle cellule endoteliali glomerulari renali umane (HRGEC), in conformità con i protocolli stabiliti. Le cellule HK-2 sono state coltivate in un mezzo DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS). Per il saggio, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzi a una densità di 5 x 10³ celle per pozzo. La carniciazione sierotica delle cellule è stata effettuata per 12 ore in un mezzo contenente lo 0,5% di FBS immediatamente prima del trattamento per la muco cervica.
La CM è stata applicata con una massa proteica totale normalizzata uguale. Le aliquote di CM congelate sono state scongelate a 37 °C in un bagno a secco (<5 min) e chiarite tramite centrifugazione a 10.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Le cellule HK-2 (100 μL/pozzo) sono state trattate con HG-CM, NG-CM o HM-CM, normalizzate a contenuti di proteine/DNA corrispondenti. Sono stati preparati in totale 3 repliche biologiche per condizione (con 3 repliche tecniche ciascuna). I campioni sono stati incubati a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24 ore. La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando il Kit di Conteggio delle Cellule-8. Per farlo, sono stati aggiunti 10 μL di soluzione di CCK-8 a ciascun pozzo e incubati per 1-4 ore a 37 °C. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche. La fattibilità è stata calcolata come:
Vitalità (%) = [(A_sample - A_blank) / (A_baseline_control - A_blank)] x 100
Rilevamento dello stress ossidativo
I livelli di malondialdeide cellulare (MDA) sono stati quantificati, uno dei principali prodotti finali della perossidazione lipidica di membrana, tramite il test TBA. I lisati cellulari (1 x 107 celle) sono stati chiariti centrifugando a 10.000 x g per 15 minuti, e poi 0,02 mL di soprantantante sono stati inseriti in tubi campione insieme a 0,02 mL di standard MDA. Alla aliquota sono stati aggiunti 0,02 mL di clarificante e 0,6 mL di reagente acido. I campioni/standard sono stati trattati con 0,2 mL dell'agente cromogenico (tubi di controllo: sono stati aggiunti 0,2 mL di acido acetico al 50%). Dopo sigillare, miscelare e incubare a 100 °C per 40 minuti, i campioni sono stati raffreddati e poi centrifugati a 9569 x g per 10 minuti. Il sovrantantante è stato trasferito su micropiastre a 250 μL per la misurazione OD₅₃₂.
Profilazione trascritomica
L'RNA totale è stato isolato utilizzando il reagente TRIzol seguendo il protocollo del produttore. La quantità e la purezza dell'RNA sono state valutate rispettivamente con uno spettrofotometro e un analizzatore di frammenti. Per la costruzione della libreria di sequenziamento sono stati utilizzati solo campioni di RNA di alta qualità con RNA Integrity Number (RIN) > 7.0.
L'mRNA poliadenilato (poly(A)+) è stato arricchito da due cicli di selezione basata su sfere magnetiche oligo(dT). L'mRNA purificato è stato frammentato in 200-300 nucleotidi utilizzando un kit di frammentazione a base di magnesio a 94 °C per 5-7 minuti. La sintesi del cDNA a primo filamento è stata effettuata con trasscrittasi inversa, seguita dalla sintesi del cDNA a seconda catena utilizzando la polimerasi del DNA I e RNasi H di E. coli in presenza di dUTP (per consentire la specificità del filamento). I passaggi successivi includevano la riparazione delle estremità, il taglio a coda A, la ligazione degli adattatori e la selezione delle dimensioni tramite perle magnetiche. Prima dell'amplificazione per PCR, il secondo filamento incorporato in dUTP veniva digerito con l'enzima UDG.
È stata costruita una libreria specifica per fili con una dimensione media dell'inserto di 400 ± 50 bp usando PCR nelle seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 98 °C per 1 minuto; 14 cicli di denaturazione a 98 °C per 10 secondi, ricottura a 60 °C per 30 secondi ed estensione a 72 °C per 30 secondi; e un'estensione finale a 72 °C per 5 minuti. Il sequenziamento a estremità accoppiata a 150 bp è stato effettuato su una piattaforma Illumina, con una profondità di sequenziamento di ≥40 milioni di letture per campione (Q30 > 85%).
Analisi bioinformatica dei dati trascritomici
Il controllo qualità delle letture grezze è stato effettuato utilizzando FastQC (v0.11.8) e l'allineamento al genoma di riferimento GRCh38.p13 con HISAT2 (v2.2.1). La quantificazione delle trascrizioni e l'assemblaggio per campione venivano eseguiti utilizzando StringTie (v2.1.6) con parametri predefiniti. Tutti i trascriverti assemblati sono stati uniti da singoli campioni per ricostruire un trascrittoma completo utilizzando il software gffcompare (v0.12.6; gffcompare è uno strumento standalone, non parte di StringTie, e la sua versione è corretta alla versione stabile comune). L'analisi differenziale dell'espressione è stata effettuata con DESeq2 (v1.38.3) utilizzando soglie di |log2 fold change (FC)| > 1 e tasso di false discovery (FDR) < 0,05. Gli effetti batch venivano corretti tramite il pacchetto variancePartition.
Analisi proteomica del secretoma
La CM è stata raccolta da HRGECs coltivati in condizioni di controllo NG, HG o HM utilizzando un metodoprecedentemente descritto 13 con modifiche per l'analisi del secretoma. Le cellule sono state lavate con PBS dopo la stimolazione e incubate in un mezzo senza siero per 12 ore. Il CM è stato raccolto e centrifugato a 3.000 x g per 10 minuti (4 °C).
Quantità uguali di peptide da ciascun campione venivano miscelate e poi diluite con il solvente A (5% ACN, pH 9,8) e iniettate nella colonna. La frazionazione della miscela peptidica è stata effettuata utilizzando una colonna 3,5 μm 4,6 x 150 300Extend-C18 sul Binary Rapid Separation System. L'eluzione gradiente è stata eseguita a una portata di 0,3 mL/min: dal 5% al 21% del solvente B (97% ACN, pH 9,8) in 38 minuti, dal 21,5% al 40% del solvente B in 20 minuti, dal 40% al 90% del solvente B in 2 minuti, al 90% del solvente B per 3 minuti e al 5% del solvente B equilibrato per 10 minuti. I picchi di eluzione sono stati monitorati a 214 nm e le frazioni sono state raccolte ogni minuto. Le frazioni sono state combinate secondo cromatogrammi dei picchi di eluzione. Furono raccolte in totale 10 frazioni, che furono poi liofilizzate.
Le fasi mobili A (100% acqua, 0,1% acido formico) e B (80% acetonitrile) sono state preparate, e i campioni di peptidi essiccati sono stati ricostituiti con acido formico allo 0,1% e centrifugati a 20.000 x g per 10 minuti. La separazione è stata effettuata utilizzando un sistema di fase liquida UHPLC. I campioni sono stati alimentati su una colonna HPLC ES906 (150 mm) con un gradiente di 8 minuti a 2,5 μL/min, separati con il seguente gradiente effettivo: 0-4 minuti, fase B mobile al 4% che aumenta linearmente fino al 25%; 4-6,9 min, fase B mobile in aumento lineare dal 25% al 35%; 6,9-7,3 min, fase B mobile in aumento lineare dal 35% al 99%; 7,3-8,0 min, mantenuto la fase mobile B al 99%. I peptidi separati in fase liquida furono trasferiti a uno spettrometro di massa per l'acquisizione della modalità DIA. I parametri principali erano impostati come segue: energia di collisione normalizzata 25%, stato di carica predefinito 2, risoluzione 240.000, scansione ogni 0,6 s, intervallo di scansione 380-980 m/z, spettrometria di massa AGC 500%. Le scansioni a frammentazione degli ioni venivano registrate con un tempo massimo di scansione di 3 ms e utilizzavano 300 finestre di scansione 2-T, che variavano da 380 a 980 m/z.
Il DIA-NN (https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x, versione 1.9.1) veniva utilizzato per analizzare i dati DIA con un metodo senza libreria. I dati MS/MS sono stati ricercati con sequenze proteiche, che sono state scaricate dal database Uniprot con le seguenti impostazioni: enzima: Tripsina/P; Massimo scollature mancate: 2; modifica fissa: carbamidometil (C); modifiche variabili: ossidazione (M) e acetile (proteina N-term); tolleranza di massa precursore: 20 ppm; tolleranza di massa dei frammenti: 0,05Da. I risultati sono stati filtrati con l'1% di FDR, e solo quei gruppi proteici sono stati utilizzati nell'analisi a valle che soddisfacevano questo criterio di filtrazione.
Analisi dell'arricchimento funzionale degli omics (GO, KEGG e GSEA)
Analisi di arricchimento funzionale sono state condotte su insiemi filtrati di geni differenzialmente espressi (trascrittomica) e proteine (proteomica del secretoma), seguendo pipeline bioinformatiche consolidate. Gli identificatori venivano mappati usando Org.Hs.eg.db. L'arricchimento GO (processi biologici, funzioni molecolari, componenti cellulari) è stato eseguito tramite clusterProfiler. Benjamini-Hochberg ha aggiustato il valore p < 0,05, e la riduzione della similarità semantica (cutoff=0,7) è stata applicata per condensare i termini. L'analisi del percorso KEGG è stata effettuata utilizzando KEGG REST API (has, rilascio 2023). Il test ipergeometrico è stato utilizzato con la correzione di Yekutieli FDR. La visualizzazione della topologia dei percorsi è stata effettuata con Pathview. GSEA è stato applicato utilizzando un approccio basato sul rango con la classificazione dei geni segnale-rumore. È stato effettuato un test di arricchimento contro le collezioni MSigDB (HALLMARK, C2, C5; v2023.2) e con firme endoteliali diabetiche curate. La significanza è stata valutata dopo 1000 permutazioni fenotipiche (FDR < 25%).
Analisi della rete di interazione proteina-proteina
Per identificare i regolatori molecolari principali all'interno del pool di candidati patogeni, è stata effettuata la costruzione di reti PPI e l'analisi topologica utilizzando un flusso di lavoro computazionale integrato. I 278 geni candidati sono stati inviati al database STRING (v12.0; Homo sapiens; le fonti di evidenza includevano database sperimentali, di co-espressione e curate; una soglia di fiducia nell'interazione (punteggio combinato) >0,7 per i vantaggi ad alta fiducia; e nessuna ulteriore inflazione interattoriale. I risultati sono stati importati in Cytoscape (v3.9.1) e l'analisi della topologia di rete è stata effettuata utilizzando plugin MCODE (v1.5.2) e CytoHubba (v0.4.1). Successivamente, la rete è stata ottimizzata visivamente in base al grado di connessione dei nodi, in modo che i nodi con alta connettività siano di colore più scuro, di dimensioni maggiori e più prominenti nell'etichetta.
Sviluppo di un set genico bersaglio per la malattia renale diabetica
I criteri per gli mRNA/proteine co-upregolati sono stati definiti come segue: trascrittoma (FDR < 0,05 e |log2FC| > 1) e secretoma (FDR < 0,01 e |log2FC| > 1,5). I nomi di proteine e geni sono stati normalizzati usando UniProt e convertiti in un formato unificato (Simbolo Genico). Un set di geni target per la malattia renale diabetica è stato costruito integrando geni associati alla malattia da diversi database pubblici, inclusi GeneCards (Versione 5.25, termine di interrogazione: Nefropatie Diabetiche, data consultata luglio 2025), il Comparative Toxicogenomics Database (CTD; https://ctdbase.org/, termine di ricerca: Nefropatie Diabetiche, data di accesso luglio 2025) e Open Targets Platform (https://platform.opentargets.org/, Versione 0.13.8, termine di interrogazione: Nefropatie Diabetiche, data di accesso luglio 2025)13, 14, 15. Questo è stato designato come il set completo di riferimento per la malattia renale diabetica. L'intersezione tra mRNA/proteine co-regolate al rialzo e questo insieme genico è stata identificata per analisi a valle.
Rilevamento delle proteine CCL2
Per quantificare il CCL2, una piastra a 96 pozzi è stata rivestita con anticorpo di cattura (100 μL/pozzo) e incubata a 4 °C durante la notte. Il giorno successivo, la piastra è stata lavata con 2x con buffer e bloccata con diluente ELISA (200 μL/pozzo) per 1 ora a RT. Una curva standard a 7 punti veniva preparata tramite diluizioni seriali 2 volte dello standard S1, quindi i campioni (100 μL/pozzo) venivano aggiunti e incubati per 2 ore a 400 giri/min. Dopo il lavaggio 5 volte, è stato aggiunto e incubato un anticorpo di rilevazione (100 μL/pozzo) per 1 ora a 400 giri/min, seguito da aggiunta e incubazione di soluzione enzimatica (100 μL/pozzo) per 30 minuti a 400 giri/min. I campioni sono stati sviluppati con substrato TMB (15-30 min, RT). La reazione si è fermata con acido (100 μL/pozzo), e l'assorbanza è stata rilevata a 450 nm (riferimento opzionale a 620 nm). I passaggi chiave includono lavaggi rigorosi, incubazioni a tempo e diluizioni standardizzate per garantire la riproducibilità.
Riposizionamento dei farmaci
I composti terapeutici sono stati previsti utilizzando la seguente piattaforma: LINCS L1000 Characteristic Direction Signatures Search Engine (L1000CDS2; https://maayanlab.cloud/L1000CDS2). Questa piattaforma impiega il metodo MODZ e l'analisi della direzione caratteristica per identificare piccole molecole o combinazioni di composti capaci di invertire o imitare le firme di espressione genicadi ingresso 16. I farmaci candidati sono stati identificati come quelli che invertono la disregolazione dei geni renali espressi differenzialmente utilizzando questa piattaforma. I composti sono stati classificati in base ai loro punteggi di inversione nelle linee cellulari renali per rene selezionato nella colonna tissutale, e i candidati con il punteggio più alto sono stati sottoposti a un aggancio molecolare per valutare le loro affinità di legame con i principali bersagli proteici.
Screening del fattore di trascrizione co-regolatorio
Il database hTFtarget è stato interrogato per il lego co-regolatore dei TFs al set genico. Il database hTFtarget è stato analizzato per identificare le relazioni geniche target tra fattori di trascrizione umani (TF) analizzando computazionalmente dataset ChIP-Seq su larga scala su cellule, tessuti e condizioni diverse. La pipeline integrativa combinava segnali di picco ChIP-Seq con un contesto epigenetico per individuare il legame TF nei promotori/potenziatori, spiegando esplicitamente la dinamica regolatoria spaziotemporale. Come dimostrato da Zhang et al., ha servito come piattaforma multidimensionale che consente l'esplorazione di bersagli TF o regolatori genici, la visualizzazione dei dati ChIP-Seq, l'indagine della cooperatività TF e la previsione dei siti di legame17.
Pipeline computazionale e analisi per l'aggancio molecola di piccole molecole e proteine
AutoDock Vina 1.2.018 è stato utilizzato per condurre un'analisi di docking molecolare delle interazioni di legame tra i principi attivi e i fattori di trascrizione BRD4, CTCF, EP300 e SPI1. Le strutture cristalline di BRD4 (PDB ID: 7REK), CTCF (PDB ID: 5K5I), EP300 (PDB ID: 5NU5) e SPI1 (PDB ID: 8E3K) sono state ottenute dal Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)19,20. Le strutture a piccole molecole in formato SDF sono state scaricate dal database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 21, convertite in formato MOL2 usando Open Babel 2.4.1 e minimizzate l'energia con PyRx 0.8. La pre-elaborazione delle proteine veniva effettuata rimuovendo molecole d'acqua, aggiungendo atomi di idrogeno, calcolando le cariche di Gasteiger e convertendole in formato PDBQT (richiesta per AutoDock Vina). È stata adottata una strategia di attracco semi-flessibile, che definisce la posizione e le dimensioni della griglia di aggancio in base ai siti di legame dei liganti co-cristallizzati in ciascuna proteina. MA9-086 funge da ligando di controllo positivo per BRD4 e XDM-CBP per EP300. Per CTCF e SPI1 (prive di liganti positivi noti), sono state identificate potenziali tasche di legame tramite analisi strutturale utilizzando la piattaforma online Proteins Plus (https://proteins.plus/). I parametri della griglia di attracco erano impostati come segue (coordinate e dimensioni in Å lungo gli assi x, y e z): BRD4 centrato a (-11,907, -8,617, -3,973) con una dimensione di scatola (18,387, 18,387, 18,387); Centro CTCF a (15.165, 4.854, 6.388) e dimensione della scatola (17.25, 20.25, 9.75); Centro EP300 a (39.781, 5.326, 9.998) e dimensione della scatola (16.516, 16.516, 16.516); SPI1 centro a (3,155, -3,853, 0,668) e dimensione della scatola (17,25, 25,5, 10,5). Durante l'attracco, l'intervallo energetico è stato impostato a 3, il parametro di esaussione a 8 e la distanza della griglia a 0,375 Å. La stabilità del legame è stata valutata a partire dall'energia di legame, dove valori più bassi indicano conformazioni più stabili e una probabilità di interazione più elevata, con una soglia di <-5 kcal/mol definita come forte attività di legame22,23. Infine, le modalità di interazione tra composti e recettori sono state identificate tramite PyMOL.
Analisi statistica
I dati sono presentati come media ± SEM. I test statistici sono stati selezionati in base alla normalità (Shapiro-Wilk) e all'omogeneità della varianza (test di Levene). Test t non accoppiati (due gruppi) o ANOVA unidirezionale con test post hoc LSD (≥3 gruppi) sono stati utilizzati per confronti tra gruppi. Un p < 0,05 è stato definito come una soglia di significatività. I grafi venivano generati con GraphPad Prism 9.0.
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Dimostrazione dell'impatto patogeno del secretoma endoteliale iperglicemico sui tubuli renali
Questo studio è iniziato con la convalida dell'effetto patogeno del secretoma endoteliale iperglicemico. Il mezzo condizionato da cellule endoteliali glomerulari umane iperglicemiche (HG-CM) ha significativamente compromesso la vitalità delle cellule epiteliali dei tubuli prossimali umani (HK-2) rispetto ai gruppi di co...
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Questo studio stabilisce la disfunzione del secretoma endoteliale indotta dall'iperglicemia come un fattore critico della lesione renale diabetica attraverso approcci integrati multi-omici e computazionali. Dimostrazione che la citotossicità mediata dal secretoma verso i tubuli renali coincide con una disregolazione sistematica di 534 fattori derivati dall'endotelio che convergono nel rimodellamento della matrice, nello stress ossidativo e nelle vie del nucleo dell'infiammazione nella pa...
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32200644), dal Progetto Science and Technology Program dell'Hebei (246W2501D, 252W7716D) e dalla Yanzhao Golden Platform (A20240022).
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Kit ELISA CCL2 | Thermo Fisher Scientific | #88-7399-88 | |
| Inibitore CCR2 | Merck Millipore | #227016 | |
| Kit di test di vitalità cellulare | Seven Biotechnology | CCK-8, SC119-01 | |
| Sequenziatore di DNA | Illumina | NovaSeq 6000 | |
| Sistema di Cromatografia Liquida ad Alte Prestazioni | Thermo Fisher Scientific | UltiMate 3000 Binary RSLC | |
| Mezzo di coltura HRGEC | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd. | 1001 | |
| Cellule Endoteliali Glomerulari Renali Umane (HRGEC) | Shanghai Zhongqiao Xinzhou Biotecnologia | PRI-H-00038 | |
| Mezzo Completo delle Cellule Tubolari Tubolari Epiteliali Umane | Procell | CM-H193 | |
| Cellule Epiteliali Tubolari Renali Umane (HK2) | Procell | CP-H193 | |
| Maschi di topi db/db e db/m (4 settimane) | Hangzhou Ziyuan Biotech Co., Ltd. | SCXK 20190004 | |
| Spettrometro di massa | Thermo Fisher Scientific | Astrale | |
| Lettore di assorbimento a microplacche | Dispositivi molecolari | SpectraMax iD5 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi (senza EDTA) | Roche | cOmplete, #5056489001 | |
| Reagente di estrazione di RNA | Thermo Fisher Scientific | TRIzol, #15596026 | |
| Analizzatore di Qualità dell'RNA | Tecnologie Agilent | Analizzatore di frammenti 5300, M5311AA | |
| Strumento di Quantificazione dell'RNA | Thermo Fisher Scientific | Qubit 3.0, Q33216 | |
| Kit di rilevamento ROS | Thermo Fisher Scientific | #EEA019 | |
| Dispositivi centrifugi a ultrafiltrazione (MWCO da 3 kDa) | Merck Millipore | Amicon Ultra-4 |
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