Articolo metodologico

Caratterizzazione della secrezione di vescicole extracellulari derivate da adipociti utilizzando un modello murino con reporter CD63-GFP in vivo e in vitro

DOI:

10.3791/69670

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5 dicembre 2025

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1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Il protocollo utilizza una linea di topo reporter CD63-GFP specifica per adipociti per visualizzare e quantificare la secrezione di vescicole extracellulari derivate dagli adipociti (EV) e dimostrare la loro assorbimento da parte delle cellule progenitrici, rivelando una via paracrina all'interno del tessuto adiposo.

Abstract

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Gli adipociti sono sempre più riconosciuti come cellule endocrine attive che secernono quantità sostanziali di EV arricchiti di proteine, lipidi e acidi nucleici. Tuttavia, i meccanismi che regolano la secrezione degli EV e la dinamica del rilascio degli EV in diversi contesti biologici non sono pienamente compresi. Per colmare questa lacuna, abbiamo generato una nuova linea specifica per adipociti per il CD63-GFP reporter mouse in cui l'espressione del CD63 marcato con GFP è guidata dal promotore dell'adiponettina, consentendo l'etichettatura selettiva e il tracciamento degli AdEV in vivo. Utilizzando questo modello del reporter, abbiamo esaminato la secrezione di AdEV e la loro somministrazione agli APC all'interno dei tessuti adiposi. L'imaging confocale e la citometria del flusso hanno rivelato che gli AdEV sono attivamente assorbiti dagli APC, evidenziando un meccanismo precedentemente sottovalutato di comunicazione paracrina all'interno del microambiente adiposo.

Per integrare gli studi in vivo , è stato istituito un sistema in vitro , che consente il monitoraggio diretto della secrezione di EV da adipociti differenziati. Le APC sono state isolate da tessuti adiposi bianchi sottocutanei dei topi reporter e indotte a differenziarsi in adipociti maturi. In queste cellule, i segnali CD63-GFP sono stati osservati come punti discreti e si sono arricchiti nella membrana plasmatica quando la secrezione di EV è stata inibita, compatibile con l'accumulo di vescicole al momento del rilascio bloccato. In condizioni normali di crescita, gli EV secreti nel mezzo di coltura venivano concentrati e successivamente purificati tramite cromatografia a esclusione dimensionale, consentendo analisi funzionali e biochimiche a valle.

Questa piattaforma può essere applicata a APC derivati da altri depositi adiposi, come il tessuto adiposo bianco e marrone epididimale, oppure differenziandoli in adipociti specifici per deposito, permettendo così confronti della secrezione EV tra diversi tipi di adipociti.

Insieme, questi approcci introducono uno strumento genetico robusto e un sistema in vitro complementare per analizzare la dinamica della secrezione e del targeting dell'AdEV. Questi progressi fanno luce sulla comunicazione cellulare intra-adiposa e gettano le basi per comprendere l'influenza metabolica più ampia degli AdEV nella salute e nelle malattie.

Introduzione

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Il tessuto adiposo è sempre più riconosciuto come un organo endocrino dinamico con ruoli chiave nell'omeostasi energetica di tutto ilcorpo 1,2,3,4,5. Oltre alla sua funzione classica come deposito di stoccaggio lipidico, gli adipociti regolano la sensibilità sistemica all'insulina e le alterazioni della massa adiposa - sia in eccesso che in carenza - sono collegate alla resistenza all'insulina e alle malattiemetaboliche 6,7,8,9. Un meccanismo proposto per contribuire a questa capacità regolatoria è la comunicazione intercellulare tramite fattori secreti. Sebbene le adipochine siano ben consolidate come segnali endocrini chiave dal tessutoadiposo 10,11,12,13,14,15,16,17,18, gli adipociti rilasciano anche un numero consistente di vescicole extracellulari (EV), particelle legate alla membrana contenenti lipidi, proteine, acidi nucleici e metaboliti. Se i veicoli elettrici secreti dagli adipociti (AdEV) contengano anche glicani, come altri tipi di VE, non è ancorachiaro 19,20,21,22,23,24. Gli adipociti sono stati dimostrati una fonte principale di EV, poiché circa l'80% dei microRNA esosomici circolanti proviene da adipociti in modelli murini, come dimostrato con topi knockout Dicer specifici per adipociti sotto condizionibasali 25. I ruoli degli AdEV nel metabolismo, nell'infiammazione, nella sensibilità all'insulina e nell'adipogenesi sono stati riportati, ma rimangono incompletamentecompresi 26,27,28,29. Altre funzioni potenziali, in particolare nella mediazione della diafonia con altri tipi cellulari e organi, sono ancora in gran parte sconosciute. L'abbondanzadi 26 EV suggerisce che potrebbero svolgere ruoli importanti sia nella segnalazione locale che sistemica, ma il significato biologico e i meccanismi d'azione degli AdEV sono in gran parte inesplorati. Questa lacuna di conoscenza evidenzia la necessità di metodi robusti e specializzati per studiare la secrezione e la funzione dell'AdEV.

Per colmare questa lacuna, abbiamo generato topi CD63-GFP specifici per adipociti (AdipCD63-GFP) incrociando topi Adiponectin-Cre con topi Stopfl/fl/CD63-GFP (ceppo #:036865, JAX). Sono stati utilizzati i fratelli di cucciolata StopFL/FL/CD63-GFP, che non hanno espresso CD63-GFP in assenza di Cre, come controlli. Il ceppo reporter CD63-GFP è stato utilizzato con successo per tracciare EV specifici per tipo cellulare in vivo, inclusi EV derivati da endoteliali eneuroni 30,31. Poiché l'adiponettina è espressa solo negli adipociti maturi e non nelle cellule progenitrici degli adipociti (APC)32,33, e CD63 è un marcatore degli EVs34, i EV GFP+ rilevati nella circolazione e nei tessuti possono essere specificamente identificati come AdEV. Pertanto, in questo studio, i VE GFP+ rilevati all'interno degli APC sono interpretati come AdEV assorbiti da queste cellule progenitrici. Questo sistema reporter consente il monitoraggio diretto del rilascio delle vescicole e delle potenziali interazioni con il bersaglio in vivo e in vitro, consentendo lo studio degli AdEV in altri tipi cellulari di tessuto adiposo. È importante sottolineare che gli AdEV sono particolarmente ricchi di lipidi rispetto a quelli di altri tipi cellulari, rendendoli più galleggianti, fragili e difficili da recuperare con i metodi tradizionali diultracentrifugazione 35,36,37. Alte forze centrifughe possono danneggiare queste vescicole o causare perdite e contaminazioni significative del campione, complicando l'analisi a valle. Per superare queste limitazioni, abbiamo ottimizzato un flusso di lavoro che combina molteplici passaggi di centrifugazione a bassa velocità con cromatografia a esclusione di dimensioni, che minimizza lo stress di taglio, preserva l'integrità delle vescicole e migliora purezza e resa, consentendo una quantificazione accurata e studi funzionali. Insieme, il sistema CD63-GFP e questa pipeline di isolamento ottimizzata forniscono un approccio accessibile e riproducibile per indagare la secrezione e la funzione di AdEV nella diafonia del tessuto adiposo e nella regolazione metabolica sistemica.

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Protocollo

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In conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali dell'Albert Einstein College of Medicine, i maschi sono stati alloggiati in gruppo a 22 °C con umidità relativa del 30-70% in un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di oscurità, forniti ad libitum di accesso a cibo e acqua, e mantenuti su uno sfondo C57BL/6J.

1. Rilevamento in vivo degli AdEV secreti tramite l'acquisizione da parte degli APC

  1. Preparazione del tampone
    1. Buffer di digestione: Prepara DMEM tamponato con HEPES aggiungendo 0,5 mL di 1 M HEPES e 0,5 g di albumina sirica bovina povera di acidi grassi (BSA) a 50 mL di DMEM. Mescola finché non si scioglie.
    2. Lavaggio tampone: Prepara PBS con 2,5 mM di acido etilendiaminatetraacetico (EDTA) e siero fetale bovino (FBS) al 4%.
    3. Prepara Liberasi e DNasi 1 stock a 5 mg/mL e a 5 KU/mL. Conserva a -20 °C. Scongelare immediatamente prima dell'uso.
  2. Raccolta e digestione del tessuto adiposo inguinale
    NOTA: I topi di controllo AdipCD63-GFP e CD63-GFP di quattro mesi sono stati eutanasiati tramite inalazione di anidride carbonica.
    1. Espelle i tessuti adiposi con tecnica sterile e inserisci 1 g di tessuto in 0,5 mL di tampone digestionale, tritando finemente i tessuti con forbici sterili in pezzi non più grandi di 1 mm.
    2. Sospendere il tessuto tritato in 10 mL di tampone digerito contenente 0,5 mg/mL di Liberasi e 50 U/mL di DNasi 1.
    3. Incubare a 37 °C su uno shaker orbitale (100 giri/min) per 30-60 minuti. Mescola delicatamente il tessuto invertendo il tubo alcune volte durante l'incubazione. Quando la soluzione appare torbida e non rimangono frammenti di tessuto visibili, la digestione è considerata completa.
  3. Isolamento degli APC
    1. Diluire la sospensione con due volumi del buffer di digestione e invertire delicatamente il tubo 3-4 volte.
    2. Passa attraverso un filtro sterile da 100 μm per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito.
    3. Centrifuga il filtrato a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
    4. Scartare la parte adipocita soprandanante e etichettare il pellet come frazione stromale vascolare (SVF).
    5. Prepara un tampone fresco di lisi di globuli rossi a 1× (RBC) con acqua sterile. Lisa i globuli rossi nel SVF incubandoli sul ghiaccio per 5 minuti, protetti dalla luce.
    6. Aggiungi due volumi di tampone di lavaggio, poi filtra centrifuga a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
    7. Seguire il protocollo di isolamento del progenitore del tessuto adiposo (topo), risospendere la SVF in 80 μL di tampone (PBS, pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) per grammo di tessuto.
    8. Aggiungere 20 μL di cocktail di depletion dei progenitori non adipociti per grammo di tessuto.
    9. Mescola e incuba per 15 minuti a 2-8 °C al buio.
    10. Fai passare il campione attraverso la colonna LS e raccogli il flow-through.
    11. Centrifugare il flusso (negativo per CD31, CD45, Ter119) a 300 × g per 5 minuti a 4 °C per ottenere gli APC per lo studio.
  4. Rilevamento degli AdEV secreti tramite l'assorbimento di APC tramite microscopia confocale
    1. Seminare 250 μL di APC isolati (1 × 104 cellule/mL) da topi AdipCD63-GFP o CD63-GFP su vetrine a 8 pozzi rivestite di collagene e permettere alle cellule di attaccarsi per circa 6 ore.
    2. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 minuti per preservare le strutture cellulari e EV per l'immagini.
      NOTA: In questi sani, i segnali GFP segnano gli AdEV, e la loro rilevazione all'interno degli APC tramite microscopia confocale indica l'assorbimento degli AdEV da parte di queste cellule progenitrici.
    3. Lavare le vetri tre volte con PBS, montare con un mezzo antifade e catturare i segnali GFP utilizzando un microscopio confocale dotato di un obiettivo a immersione in olio del 63×. Acquisire immagini come stack della serie z con una dimensione di passo di 0,5 μm, utilizzando un laser da 488 nm per l'eccitazione GFP e rilevando l'emissione a 500-550 nm.
  5. Rilevamento degli AdEV secreti tramite assorbimento di APC tramite citometria a flusso
    1. Conta gli APC e diluisce il colorante di vitalità (ad esempio, Zombie) 1:1000 in 1X PBS. Sospendere le cellule a 1 × 106 ogni 100 μL. Incubare per 20 minuti sul ghiaccio, protetto dalla luce.
    2. Lava le celle una volta con il wash buffer. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Sospendere le cellule in un tampone di colorazione brillante a 1 × 106 celle per 100 μL.
    4. Bloccare il legame non specifico con il reagente bloccante del recettore Fc (ad esempio, anti-CD16/CD32) 1:100 sul ghiaccio per 10 minuti.
    5. Pre-spin dell'anticorpo Sca-1 a 6.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Poi aggiungi 1 μL dell'anticorpo Sca-1 al tubo APC e incuba per 20 minuti sul ghiaccio, mantenendo il tubo coperto con un foglio di alluminio.
    6. Lavare due volte con 1 mL di tampone di lavaggio, centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
    7. Sospendere le cellule nel wash buffer intorno a 1 × 106 cellule ogni 500 μL per la classificazione della citometria di flusso. Acquisire dati per le celle Sca1+ e GFP+ su un citometro a flusso spettrale equipaggiato con un laser viola da 405 nm (filtro 450/50 nm per Pacific Blue) e un laser blu da 488 nm (filtro 530/30 nm per GFP). Analizza i campioni utilizzando il software in esecuzione dello strumento, con celle Sca1+ gategate, e il sottoinsieme GFP+ all'interno di questa popolazione analizzato, come mostrato nella Figura 2.

2. Rilevamento e analisi degli AdEV secreti in vitro

  1. Differenziazione degli APC in adipociti maturi
    NOTA: Tutte le colture sono mantenute a 37 °C, 8% di CO2 , salvo diversa indicazione.
    1. Giorno 0: Coprire i piatti con gelatina allo 0,2% per 30 minuti a temperatura ambiente (RT), aspirare e seminare APC appena isolati in DMEM/F12 + 15% FBS + 1% Penicillina/Streptomicina (P/S) + 0,1% Primocina per raggiungere il 100% di confluenza prima della differenziazione.
    2. Giorno 1-8: Sostituire con il mezzo di differenziazione adipogenica MesenCult (50 mL totali: 45 mL di base + 5 mL di integratore + 0,5 mL di GlutaMAX + 50 μL di Primocina), cambiare con un nuovo mezzo di differenziazione al giorno 4.
    3. Giorno 9: Lavare gli adipociti due volte con PBS, poi sostituire con un mezzo maturo per la coltura degli adipociti (DMEM +1% BSA + 0,2% Primocina) e mantenere per 16 ore.
  2. Isolamento e purificazione dell'AdEV
    1. Far passare la coltura di adipociti da 15 mL generata sopra, prima attraverso un filtro da 40 μm e poi attraverso uno da 30 μm.
    2. Centrifuga il filtrato a 500 × g per 5 minuti, poi 2.000 × g per 10 minuti per rimuovere le celle residue e i detriti.
    3. Far passare il filtrato attraverso un filtro da 0,8 μm, poi concentrare il mezzo da 15 mL a 0,5 mL utilizzando un'unità di ultrafiltrazione a taglio da 100 kDa (volume di campione di 15 mL) centrifugando a 4.000 × g per 15 minuti.
    4. Carica il campione sulle colonne di cromatografia di esclusione di dimensione (SEC) con un collettore automatico di frazioni e raccogli le frazioni F1-8.
    5. Concentrarsi le frazioni EV raccolte utilizzando un'unità di ultrafiltrazione a taglio di 100 kDa (volume campione di 4 mL) e procedere alla verifica del contenuto EV di ogni frazione tramite western blot, strumento di analisi di tracciamento nanoparticellare e microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
  3. Validazione, quantificazione e valutazione di dimensioni/morfologie di AdEV
    1. Analisi del Western blot dei marcatori EV
      1. Concentrare ogni frazione da 400 μL a 25 μL, poi aggiungere 50 μL di tamponamento per il saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) integrato con inibitori di proteasi e fosfatasi. Denatura i campioni aggiungendo un tampone di carico 2× dodecil solfato di sodio (SDS) e risolvendo proteine su un gel tris-glicina al 4-12%.
    2. Analisi della dimensione, concentrazione e qualità degli EV utilizzando uno strumento di analisi del tracciamento delle nanoparticelle.
      1. Prima dell'analisi, diluire i campioni EV con PBS sterile filtrato a 0,1 μm in un rapporto 1:1000, assicurandosi che la concentrazione delle particelle rientri nel range ottimale di rilevamento (circa 107-10 9 particelle/mL). Mescola delicatamente i campioni diluiti per evitare la formazione di bolle.
      2. Carica il campione nello strumento dotato di una telecamera scientifica complementare a semiconduttore metallico (sCMOS) ad alta sensibilità, un modulo laser verde da 532 nm e una soglia di rilevamento di 10 nm (fino a 1.000 nm)/ 10da 6 a10 9 particelle/mL.
      3. Esegui imaging e quantificazione utilizzando la suite software NS Xplorer, che applica un algoritmo dinamico di concentrazione basato sul volume di osservazione.
    3. Esame della morfologia degli EV tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
      1. Inviare 50 μL di EV, raccolti prima della concentrazione, all'impianto centrale per la colorazione negativa degli EV. Applicare i veicoli elettrici su griglie in rame da 400 mesh solo a carbonio, pulite al plasma e pulite al plasma.
      2. Dopo una breve adsorbzione, risciacqua le griglie con acqua distillata, colora negativamente con acetato di uranyle all'1% (w/v) e rimuovi la macchia in eccesso con carta filtrante prima di asciugare all'aria. Poi, immagini delle griglie usando un microscopio elettronico a trasmissione operato a 120 KV.

3. Informazioni sulla sicurezza e sui rifiuti

  1. Maneggiare paraformaldeide e acetato di uranile in una cappa con dispositivi di protezione individuale (DPI), poiché entrambi sono tossici. Raccogliere i rifiuti di acetato di uranyle in contenitori pericolosi etichettati.
  2. Trattare tutti i campioni biologici come potenzialmente infettivi e smaltire i materiali secondo le politiche e i protocolli di biosicurezza istituzionali approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC).

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Risultati

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Utilizzando questo protocollo di rilevamento degli AdEV tramite l'assorbimento di APC tramite microscopia confocale, abbiamo isolato le APC dai tessuti adiposi inguinali di topi AdipCD63-GFP e Stopfl/fl/CD63-GFP e le abbiamo colorate con DAPI per la visualizzazione dei nuclei. Esaminate con microscopia confocale, le APC di topi Stopfl/fl/CD63-GFP non hanno mostrato punti GFP rilevabili (Figura 1A). Al contrario, le APC isolate da topi AdipCD63-GFP hanno mostrato numeros...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo descritto colma una lacuna metodologica importante fornendo un sistema robusto e riproducibile per isolare e caratterizzare gli AdEV e la loro adozione da parte degli APC. Rispetto agli EV provenienti da altre fonti, gli AdEV sono più ricchi di lipidi e galleggianti, rendendo le tecniche classiche di isolamento EV basate su ultracentrifugazione menoefficienti 35. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli pubblicati per la purificazione dell'AdEV dipe...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno alcun interesse finanziario da dichiarare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo l'Einstein Flow Cytometry Core per FACS e l'Analytical Imaging Facility per tutte le analisi delle immagini. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni DK128839 del National Institutes of Health e da P30CA013330 di supporto al centro oncologico NCI.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5 M EDTA, pH 8,0FisherAM9260GDiluizione 500x
10x PBSFisher Scientific70-013-032Diluizione 1000x con acqua
1 M HEPESGibco15630080Diluizione 1000x
Kit di isolamento del progenitore del tessuto adiposo, topoMiltenyi biotec30-106-639Pronto all'uso
Filtro centrifugo Amicon Ultra, MWCO da 100 kDaSigmaUFC9100Volume di campione di 15 mL
Filtro centrifugo Amicon Ultra, MWCO da 100 kDaSigmaUFC9100Volume di campione di 4 mL
BSASigmaA6003Pronto all'uso
Anticorpo di CalnexinaCalnexinaab22595Diluizione 1000x
Anticorpo CD63abcamab217345Diluizione 500x
CD81Tecnologia di segnalazione cellulare10037sDiluizione 500x
Corning  BioCoat  Diapositiva della Cultura Collagen ISigmaCLS354630Pronto all'uso
Corning  Filtro cellulareSigmaCLS43175040 & mu; m dimensione dei pori
Corning  Filtro cellulareSigmaCLS431752100 & mu; m dimensione dei pori
Anticorpo COX IVTecnologia di segnalazione cellulare4844Diluizione 1000x
DMEMGibco11965092Pronto all'uso
DMEM/F-12, integratore GlutaMAXThermofisher10565018Pronto all'uso
Dnase 1SigmaD4513Stock 5 KU/mL a -20 ° C
Integratore GlutaMAXGibco35050061Diluizione 100x
Halt & trade; Cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi (100X)Thermofisher78444Pronto all'uso
Anticorpo HSP70abcamab181606Diluizione 1000x
Invitrogen eBioscience 10X RBC Lysis Buffer (Multi-specie)Fisher Scientific50-112-9743Diluizione 10x in acqua
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPFisher ScientificNC2042225Pronto all'uso
Microscopio confocale LEICA STELLARIS 8Microscopi LeicaN/A
Liberase TM Grado di RicercaSigmaLIBTM-ROScorta 5 mg/mL a -20 ° C
Filtro a siringa Millex MCESigmaSLAA0250,8 μ m dimensione dei pori
NanoSight ProMalvern PanalyticalN/A
Novex Tris-Glycine Mini Protein Gels, 4– 12%,ThermofisherXP04120BOXPronto all'uso
Tampone campione Novex Tris-Glicina SDS (2x)ThermofisherLC2676Pronto all'uso
Anticorpo anti-topo Ly-6A/E (Sca-1) Blu del PacificoBioLegend108119Diluizione 25x
Soluzione di paraformaldeide (16%)Fisher Scientific50-980-487diluire al 4% con PBS
pluriStrainer S / 30 & micro; m (Filtro cellulare)Fisher ScientificNC092245930 & mu; m dimensione dei pori
Soluzione Ponceau SSigmaP7170-1LPronto all'uso
PrimocinInvivogenNC9141851Diluizione 500x
Reagente Antifade ProLong Gold con DAPITecnologia di segnalazione cellulare8961SPronto all'uso
Anticorpo anti-topo purificato CD16/32BioLegend101301Diluizione 100x
RIPA buffer Fisher ScientificPI89900Diluizione 10x in acqua
Citometro a flusso spettrale (Aurora 3)Cytek BiosciencesN/A
Anticorpo sintassina 4Sistemi sinaptici110042Diluizione 5000x
Tecnai 20 (Microscopio Elettronico a Trasmissione)FEIN/A
Tergeo-EMPIE Scientific LLCN/A
Anticorpo Vinculinaabcamcirca 18508Diluizione 5000x

Riferimenti

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