Utilizzando il machine learning integrato tra più coorti, abbiamo costruito una firma prognostica IMRG robusta per il glioma. L'IRAIN è marcatamente sottoregolato, inversamente legato al grado e alla sopravvivenza, e sopprime la segnalazione IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5, limitando proliferazione, migrazione e angiogenesi. I risultati indicano IRAIN e IMRG come biomarcatori e bersagli terapeutici.
Articolo di ricerca
L'IRAIN a RNA non codificante lungo guida la riprogrammazione immunometabolica nel glioma tramite l'asse IGF1R-JAK-STAT-BIRC5
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il glioma è una malignità aggressiva con opzioni terapeutiche limitate e una prognosi scadente. La sua progressione è strettamente legata alla riprogrammazione metabolica e all'evasione immunitaria, sottolineando la necessità di identificare i regolatori molecolari che integrano questi processi. Qui, abbiamo stabilito una firma prognostica robusta del gene immunometabolico correlato (IMRG) e chiarito il ruolo dell'IRAIN non codificante lungo nella regolazione dell'immunometabolismo del glioma attraverso l'asse IGF1R-JAK-STAT-BIRC5. Sono stati analizzati dati trascrivomici e clinici provenienti dalle coorti TCGA, CGGA (693/325) e GEO (GSE43378). L'espressione differenziale e l'analisi pesata della rete di co-espressione genica (β = 8) hanno garantito una topologia priva di scala, e un framework di validazione incrociata leave-one-out che combina dieci algoritmi di apprendimento automatico ha prodotto 101 modelli prognostici. La firma ottimale di 17 geni IMRG è stata validata in tutte le coorti e ha previsto indipendentemente la sopravvivenza complessiva. I test funzionali hanno dimostrato che la sovraespressione di IRAIN inibiva IGF1R, soppressava la fosforilazione di JAK2/STAT3 e riduceva il BIRC5, promuovendo così l'apoptosi e riducendo l'angiogenesi. Bassa espressione di IRAIN correlata a Treg immunosoppressori e macrofagi M2 e a punteggi elevati di microambiente tumorale, suggerendo un fenotipo immunoevasivo. Questi risultati stabiliscono IRAIN come un regolatore chiave della riprogrammazione immunometabolica del glioma e convalidano la firma IMRG come uno strumento prognostico affidabile, evidenziando la via IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 come un ponte meccanicistico che collega la disregolazione immunitaria e metabolica nel glioma e offre potenziali bersagli per la terapia di precisione.
Introduzione
Il glioma rappresenta la malignità primaria più comune del sistema nervoso centrale e rimane tra i tumori umani più letali nonostante i progressi in neurochirurgia, radioterapia e chemioterapia. I gliomi di alto grado, in particolare il glioblastoma multiforme (GBM), sono caratterizzati da rapida proliferazione, infiltrazione diffusa e inevitabile ricorrente 1,2. Recentemente, sono emersi diversi approcci terapeutici efficaci, come interventi chirurgici, immunoterapia echemotherpia 3. La sopravvivenza mediana rimane di circa 14-18 mesi, anche con la terapia massima, sottolineando la necessità di nuove strategie terapeutiche e biomarcatoriprognostici 4.
L'interazione tra il microambiente tumorale (TME) e le cellule tumorali guida in modo critico la crescita aggressiva e l'eterogeneità molecolare dei gliomi. Numerosi costituenti immunitari, tra cui microglia, cellule precursori neuronali, vascolari e cellule immunitarie adattative, sono coinvolti in modo intricato nella modellazione della TME 5,6,7. Negli ultimi anni si sono assistiti a notevoli progressi nell'immunoterapia, inaugurando un'era trasformativa nell'oncologia. Tuttavia, il blocco dei checkpoint immunitari (ICB) e altri approcci immunoterapeutici hanno mostrato solo un successo limitato nelglioma 8. Il fallimento dell'immunoterapia in questo contesto deriva da diverse caratteristiche intrinseche del microambiente del glioma: in particolare, basso carico mutazionale tumorale, marcata eterogeneità intratumorale, scarsa permeabilità della barriera emato-encefalica, riduzione della regolazione delle principali molecole del complesso di istocompatibilità e scarsa infiltrazione delle celluleT 9,10,11,12.
Ogni numero di evidenze suggeriscono che il microambiente tumorale (TME), che presenta disfunzioni metaboliche, sia caratterizzato da condizioni acide, privazione di nutrienti e accumulo di metaboliti che sopprimono le risposte immunitarie. Questa condizione porta successivamente alla disfunzione delle cellule immunitarie che infiltrano i tumori e riduce l'efficaciadell'immunoterapia 13. Contemporaneamente, le cellule immunitarie all'interno della TME subiscono cambiamenti metabolici dipendenti dal contesto che dettano la loro differenziazione e le funzioni degli effettori. Ad esempio, le cellule T attivate dipendono dalla glicolisi per una rapida proliferazione, mentre le cellule T regolatorie (Treg) e i macrofagi associati al tumore (TAM), in particolare il sottotipo M2, dipendono dalla fosforilazione ossidativa e dal metabolismo degli acidi grassi per mantenere la loro attivitàimmunosoppressiva 14,15.
Pertanto, integrare le firme immunitarie e metaboliche offre un quadro razionale per classificare meglio i gliomi e prevedere la prognosi del paziente. Gli RNA non codificanti lunghi (lncRNA) sono recentemente emersi come regolatori versatili dell'architettura della cromatina, della trascrizione genica e della modifica post-trascrizionale. Diversi LNa sono stati implicati nella patogenesi del glioma, influenzando proliferazione, invasione e modulazioneimmunitaria 16. Tra questi, il trascritto antisense impresso IRAIN (IGF1R antisense imprinted non-protein coding RNA) ha attirato l'attenzione per il suo ruolo nella regolazione del gene del recettore del fattore di crescita simile all'insulina (IGF1R) tramite interazioni con la cromatina cis-agente, che si è dimostrato essere ridotto e ridurre il controllo della competizione cis, specialmente nelle cellule tumorali come il cancro al seno, le linee cellulari leucemiache, cancro della laringea e leucemia mieloide acuta, che porta direttamente a una regolazione all'alza diIGF1R 17,18,19. Poiché la segnalazione IGF1R attiva le vie JAK-STAT e PI3K-AKT a valle — entrambe centrali per la crescita tumorale e la regolazioneimmunitaria 20,21 — alterazioni nell'espressione di IRAIN possono influire criticamente sull'immunometabolismo tumorale. Tuttavia, il ruolo dell'IRAIN nel glioma e il suo potenziale impatto sul panorama immunometabolico non sono ancora stati chiariti. Affrontare questa lacuna di conoscenza potrebbe fornire una comprensione meccanicistica su come gli RNA non codificanti coordinino l'adattamento metabolico e l'evasione immunitaria nel glioma.
In questo studio, abbiamo combinato dati trascrittomici multi-coorte con validazione sperimentale per esplorare la regolazione immunometabolica nel glioma. Utilizzando framework integrati di apprendimento automatico tra le coorti TCGA, CGGA (693/325) e GEO (GSE43378), abbiamo identificato una firma prognostica robusta di 17 geni immunometabolici legati (IMRG) capace di stratificare la sopravvivenza del paziente tra i dataset. Successivamente ci siamo concentrati su IRAIN come potenziale regolatore a monte di questa rete, data la sua interazione prevista con l'asse di segnalazione IGF1R-JAK-STAT. I test funzionali hanno rivelato che la sovraespressione di IRAIN sopprime la proliferazione del glioma e l'angiogenesi inibindo l'espressione di IGF1R e la fosforilazione a valle di STAT3, con conseguente riduzione dell'espressione della proteina anti-apoptotica BIRC5 (nota anche come Survivin). Questi risultati complessivamente supportano un modello operativo in cui IRAIN funziona come un ponte meccanicistico che collega la regolazione immunitaria e la riprogrammazione metabolica nel glioma. Ipotizziamo che l'espressione disregolata dell'IRAIN favorisca la progressione tumorale disturbando questo equilibrio, favorendo così un microambiente immunosoppressore e conferendo resistenza alla terapia.
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Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono tessuti umani rispettavano le linee guida istituzionali e la Dichiarazione di Helsinki e sono state approvate dal Consiglio di Revisione Istituzionale dell'Università Medica del Fujian (Approvazione n. 2021KYB089). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima dell'acquisizione del tessuto.
Analisi dell'espressione genica e della sopravvivenza
I dati di sequenziamento dell'RNA e le relative informazioni cliniche sono stati ottenuti da molteplici database pubblici. 1) Coorte TCGA: i dati RNA-seq (FPKM) per 175 campioni di glioblastoma multiforme (GBM) e 534 campioni di glioma di basso grado (LGG) sono stati scaricati dal The Cancer Genome Atlas (https://portal.gdc.cancer.gov/); 2) Controlli normali: I profili di espressione di 211 tessuti cerebrali normali e 662 tessuti glioma sono stati scaricati dal database UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/); 3) Validazione esterna: I dati delle coorti di CGGA693 e CGGA325 sono stati ottenuti dall'Atlante del Genoma Cinese del Glioma (http://www.cgga.org.cn); 4) Dataset GEO: Il dataset GSE43378, contenente dati di espressione e clinici per 50 campioni di glioma, è stato scaricato dall'Omnibus di Espressione Genica (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Tutti i dati grezzi di conteggio sono stati convertiti in trascrizioni per milione (TPM) e trasformati inlogaritario 2. Per i dataset già normalizzati, sono state esaminate matrici di espressione per garantire distribuzioni comparabili. I geni con valori di TPM < 1 su oltre l'80% dei campioni sono stati esclusi. Le informazioni cliniche mancanti (età, stato IDH, codelezione 1p/19q, metilazione MGMT) sono state rimosse tramite filtraggio completo-case. Gli effetti batch tra i dataset sono stati aggiustati utilizzando l'algoritmo ComBat implementato nel pacchetto R sva. I valori di espressione sono stati standardizzati tramite trasformazione z-score all'interno di ogni dataset. Le analisi di sopravvivenza sono state effettuate utilizzando i pacchetti R survival e survminer. I pazienti sono stati dicotomiati in gruppi ad alta e bassa espressione secondo il livello mediano di espressione di IRAIN. Sono state generate curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier e la significatività statistica è stata valutata dal test log-rank. I rapporti di rischio (HR) e gli intervalli di confidenza (IC) al 95% sono stati stimati utilizzando modelli di regressione dei rischi proporzionali di Cox.
Definizione di insiemi genici immunitari e metabolici
I geni immunocorrelati (IRG, n = 2.483) sono stati ottenuti dal database ImmPort (https://www.immport.org/shared/), e i geni metabolici correlati (MRG, n = 948) sono stati ottenuti dal Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/). L'insieme combinato di questi geni è stato definito come geni immunometabolici correlati (IMRG). Queste liste geniche servivano come riferimento per le successive analisi di espressione differenziale e reti.
Espressione differenziale e analisi della rete di coespressione genica pesata
Geni differenzialmente espressi (DEG) tra cervello normale e tessuti glioma sono stati identificati utilizzando il pacchetto R package. I dati di espressione sono stati dotati di un modello lineare seguito da una moderazione bayesiana empirica. Geni con |log₂ cambiamento di piegatura| > 1,5 e il tasso di false scoperte (FDR) < 0,05 sono stati considerati espressi in modo significativamente differenziale. L'analisi pesata della rete di co-espressione genica (WGCNA) è stata condotta utilizzando il pacchetto R WGCNA. I campioni outlier sono stati esclusi tramite clustering gerarchico. La potenza di soglia morbida è stata impostata su β = 8 per ottenere un indice di adattamento a topologia senza scala (R2 ≥ 0,85) mantenendo al contempo un'adeguata connettività media. Sono state costruite matrici di sovrapposizione topologiche (TOM) e i geni sono stati raggruppati in moduli con una dimensione minima di 50 utilizzando l'algoritmo di taglio dinamico dell'albero. Gli autogeni del modulo sono stati correlati con tratti clinici, e il modulo più fortemente associato al glioma (Pearson's r > 0,7, P < 1×10-10) è stato selezionato per l'identificazione del genio hub.
Costruzione di modelli prognostici basati su machine learning
Un framework completo di validazione incrociata leave-one-out (LOOCV) che integra dieci algoritmi di apprendimento automatico è stato applicato per costruire e valutare modelli prognostici. In totale, sono stati implementati 101 flussi di lavoro combinatori utilizzando la coorte TCGA come dataset di addestramento. I geni immunometabolici associati al prognoso (IMRG) sono stati identificati per la prima volta tramite regressione di Cox univariata (P < 0,05). Il modello ottimale è stato determinato massimizzando l'indice medio di concordanza di Harrell (C-index) su tre dataset di validazione (CGGA693, CGGA325 e GSE43378). Il modello RSF-Enet risultante (α = 0,3) ha dimostrato la più alta performance predittiva e ha mantenuto una generalizzazione robusta tra le coortiindipendenti 22.
TME e infiltrazione immunitaria
Per caratterizzare in modo completo il panorama immunogenomico, abbiamo adottato un approccio analitico multilivello. Innanzitutto, i livelli di infiltrazione immunitaria e stromica sono stati quantificati utilizzando l'algoritmoESTIMATE 23. L'espressione differenziale delle principali molecole di checkpoint immunitari, inclusi PDCD1, CTLA4 e LAG3, è stata poi valutata tramite analisi basata su limma, e le correlazioni tra i geni dei checkpoint sono state visualizzate utilizzando matrici di correlazione. Profili di mutazione somatica da 903 campioni di glioma nella coorte TCGA sono stati utilizzati per calcolare i punteggi del carico mutazionale tumorale (TMB), dell'instabilità dei microsatelliti (MSI) e della disfunzione e esclusione immunitaria tumorale (TIDE) per prevedere potenziali risposte all'immunoterapia. I pazienti sono stati successivamente stratificati in quattro gruppi prognostici secondo lo stato combinato della TMB (alto/basso) e i punteggi di rischio (alto/basso), e gli esiti di sopravvivenza sono stati confrontati tramite l'analisi di Kaplan-Meier.
Analisi dell'arricchimento funzionale
Le analisi di arricchimento delle vie di Gene Ontology (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sono state condotte utilizzando il pacchetto clusterProfiler R. I risultati dell'arricchimento con valori P aggiustati < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. I processi biologici sovrarappresentati, i componenti cellulari e le funzioni molecolari sono stati visualizzati utilizzando dot plot e bar plot. Le reti di interazione proteina-proteina (PPI) sono state costruite utilizzando il database STRING (≥ 0,4) e visualizzate in Cytoscape. I moduli funzionali all'interno della rete PPI sono stati identificati utilizzando l'algoritmo MCODE. Le reti di interazione genico-gene e co-espressione sono state ulteriormente analizzate utilizzando GeneMANIA (https://string-db.org; punteggio di fiducia ≥ 0,4) e visualizzate in Cytoscape. I moduli funzionali all'interno della rete PPI sono stati identificati utilizzando l'algoritmo MCODE. Le reti di interazione gene-gene e co-espressione sono state ulteriormente analizzate utilizzando GeneMANIA (https://genemania.org), che integra informazioni su interazioni fisiche e genetiche, vie condivise e modelli di co-espressione per dedurre potenziali associazioni funzionali.
Campioni clinici
Tessuti gliomica freschi (n = 6) e tessuti cerebrali non tumorali adiacenti (n = 6; localizzati ad almeno 3 cm dal margine tumorale e istilogicamente confermati come privi di tumore) sono stati prelevati da pazienti sottoposti a resezione primaria del glioma presso l'Ospedale Affiliato di Zhangzhou dell'Università Medica del Fujian. Nessuno dei pazienti aveva ricevuto chemioterapia o radioterapia prima dell'intervento. Tutte le diagnosi patologiche sono state verificate indipendentemente da due neuropatologi secondo la classificazione 2021 dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) sui tumori del sistema nervoso centrale. Immediatamente dopo l'escissione chirurgica, i campioni di tessuto venivano risciacquati con soluzione salina fosfatata (PBS) fredda come ghiaccio per rimuovere il sangue residuo, congelati bruscamente in azoto liquido (-196 °C) e conservati a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.
Linee cellulari e coltura cellulare
Le linee cellulari di glioblastoma umano SHG44, U251, A172 e T98G, così come cellule gliali umane normali (HEB), sono state prelevate da depositi autenticati e confermate libere da contaminazione da micoplasmi prima dell'uso. Le cellule sono state mantenute nel Modified Eagle's Medium (DMEM, alto livello di glucosio) di Dulbecco, integrate con siero fetale bovino al 10% (FBS), 2 mM di L-glutamine e 1% di penicillina-streptomicina, a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂. Le cellule venivano passate ogni 4-5 giorni raggiungendo l'80-90% di confluenza. Per stabilire la sovraespressione di IRAIN-e-e-controllo e controllare le linee cellulari, le cellule sono state trasdotte con vettori lentivirali che trasportano il trascrizione IRAIN a lunghezza intera o un vettore vuoto come controllo. I cloni stabili sono stati selezionati usando puromicina (2 μg/mL) per 14 giorni. L'efficienza della sovraespressione è stata confermata tramite PCR di trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) prima dei test a valle.
Saggio di proliferazione delle cellule 3- (4,5-dimetiltiazolo-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT)
Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzi a una densità di 1 × 104 cellule per pozzo in 100 μL di mezzo di coltura completo. A 24, 48 e 72 ore dopo la semina, 20 μL di soluzione MTT (5 mg/mL in soluzione salina tamponata con fosfato) sono stati aggiunti a ciascun pozzo e incubati per 4 ore a 37 °C. Il soprantantante fu quindi rimosso e aggiunti 150 μL di dimetilsolfosido (DMSO) per dissolvere i cristalli di formazan. Il piatto è stato agitato delicatamente per 10 minuti per garantire una solubilizzazione completa. L'assorbanza è stata misurata a 490 nm utilizzando uno spettrofotometro a microplacche. Le letture di base provenienti da pozzi vuoti sono state sottratte. La vitalità cellulare è stata calcolata rispetto al gruppo di controllo a 24 ore (impostato come 1,0). Tutti gli esperimenti sono stati condotti con sei repliche tecniche e tre repliche biologiche indipendenti. I dati sono espressi come media ± deviazione standard (SD), e la significatività statistica è stata determinata tramite un test t a due code.
Citometria a flusso per l'apoptosi (Annessina V - colorazione fitc/pi)
Le cellule sono state seminate al 60-70% di confluenza e trattate per 24 ore nelle condizioni indicate. Le cellule galleggianti e aderenti sono state raccolte utilizzando tripsina priva di EDTA, combinate e lavate due volte con PBS gelato. I pellet cellulari sono stati risospesi nel tampone di legame Annexin V (10 mM HEPES pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mMCaCl 2) a 1 ×10 6 cellule/mL. Per ogni campione, sono stati incubati 100 μL di sospensione con 5 μL di Annexin V-FITC e 5 μL di iodio di propidio (PI; 50 μg/mL) al buio per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'aggiunta di 400 μL di tampone di legame, i campioni venivano mantenuti sul ghiaccio e analizzati entro 1 ora su un citometro a flusso (eccitazione di 488 nm; 530/30 nm per FITC e >585 nm per PI). Sono stati inclusi controlli appropriati a singola colorazione e fluorescenza meno uno per compensazione. Sono stati registrati almeno 10.000 eventi per campione. I dati sono stati analizzati tramite gating di quadranti: popolazioni vive (Annexin V⁻/PI⁻), apoptotiche precoci (Annexin V⁺/PI⁻), apoptotiche tarde (Annexin V⁺/PI⁺) e necrotiche (Annexin V⁻/PI⁺). Sono state riportate percentuali di cellule apoptotiche precoci + tarde (media ± DS, n = 3).
PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)
L'RNA totale è stato isolato utilizzando un reagente acido fenolico-guanidinio secondo il protocollo del produttore. La purezza dell'RNA è stata verificata tramite spettrofotometria (A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1), e l'integrità è stata confermata tramite elettroforesi su gel (numero di integrità dell'RNA ≥ 7). Un microgrammo di RNA totale è stato trattato con DNasi I e trascritto inversamente in una reazione da 20 μL utilizzando esameri casuali e primer oligo(dT). La reazione è stata eseguita a 25 °C per 10 minuti, 50 °C per 30 minuti e 85 °C per 5 minuti. La PCR quantitativa è stata eseguita in un sistema da 10 μL contenente 5 μL di 2× SYBR Green Master Mix, 0,3 μM ciascun primer e 1 μL di cDNA (≈equivalente a 20 ng di RNA). Le condizioni di ciclo termico erano di 95 °C per 5 minuti, seguite da 40 cicli a 95 °C per 15 secondi e 60 °C per 30 secondi, seguita da un'analisi della curva di fusione da 65 °C a 95 °C in incrementi di 0,3 °C. Tutte le reazioni venivano eseguite in triplice, insieme a controlli no-template e minus-RT. I valori di Ct > 35 o SD replicate tecnicamente > 0,5 sono stati esclusi. L'espressione relativa veniva calcolata utilizzando il metodo 2⁻ΔΔCt, con GAPDH come controllo interno. Sono stati riportati valori medi ± SD di tre repliche biologiche indipendenti e le differenze tra gruppi sono state analizzate utilizzando un test t a due code.
Analisi del western blot
Le cellule sono state lisate su ghiaccio in tampone RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% desossicolato di sodio, 0,1% SDS) integrato con inibitori di proteasi e fosfatasi. I lisati sono stati incubati per 30 minuti sul ghiaccio con vortici intermittenti e liberati tramite centrifugazione a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Le concentrazioni proteiche sono state misurate tramite test BCA, regolate a 1-2 μg/μL e mescolate 1:3 con tampone di Laemmli a 4× (tampone finale 1× contenente 100 mM DTT). I campioni sono stati denaturati a 95 °C per 5 minuti. Quantità uguali di proteine (50 μg) sono state risolte al 12% di SDS-PAGE a 100 V per 90 minuti e trasferite elettro-trasferite alle membrane PVDF a 250 mA per 90 minuti. Le membrane sono state bloccate con il 5% di latte scremato in TBST (0,1% Tween-20) per 1 ora a temperatura ambiente (o 5% di BSA per le fosfoproteine) e incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro IGF1, IGF1R, JAK2, p-JAK2 (Y1007/1008), STAT3, p-STAT3 (Y705), BIRC5 e β-actin (diluizione tipica 1:1000, β-actin 1:5000). Dopo tre lavaggi da 10 minuti in TBST, le membrane sono state incubate con anticorpo secondario coniugato con HRP (1:5000) per 1 ora a temperatura ambiente, lavate nuovamente e sviluppate utilizzando substrato chemiluminescente. Le intensità delle bande sono state quantificate con ImageJ, normalizzate a β-actina o proteina totale, ed espresse come media ± SD da tre esperimenti indipendenti.
Immunocitochimica
Le cellule coltivate su vetri sterili sono state risciacquate due volte con PBS e fissate nel paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi PBS, le cellule sono state permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,2% per 10 minuti, bloccate con albumina sierica bovina al 5% (BSA) per 1 ora e incubate durante la notte a 4 °C con anticorpo anti-CD31 primario (diluizione 1:200 in 1% di BSA). Dopo tre lavaggi PBS, le cellule sono state incubate con anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor (diluizione 1:500) per 1 ora al buio, controcolorate con DAPI (1 μg/mL, 5 min) e montate in mezzo antifade. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza con impostazioni identiche di esposizione e guadagno. La percentuale di area CD31 positiva è stata quantificata in cinque campi non sovrapposti selezionati casualmente per campione utilizzando il software ImageJ. Questo saggio è stato eseguito su modelli cellulari piuttosto che su sezioni di tessuto.
Analisi statistica
Sono state effettuate analisi statistiche utilizzando la versione 4.3.0 di R insieme ai suoi pacchetti associati. Per confrontare le variabili categoriche è stato utilizzato il test chi-quadrato, mentre le variabili continue sono state valutate utilizzando il test della somma dei rangi di Wilcoxon o il test T. La valutazione delle variabili continue è stata effettuata tramite il coefficiente di correlazione di Pearson. Le analisi di sopravvivenza sono state condotte utilizzando il pacchetto di sopravvivenza, che includeva la modellizzazione dei rischi proporzionali di Cox e la generazione di curve di Kaplan-Meier, con soglie ottimali di stratificazione stabilite dal pacchetto survminer e dalla formula Riskscore = 
. Il pacchetto CompareC veniva utilizzato per valutare gli indici C di varie variabili. La curva caratteristica operativa del ricevitore (ROC), volta a prevedere variabili categoriche binarie, veniva generata utilizzando il pacchetto pROC. Inoltre, l'area dipendente dal tempo sotto la curva ROC (AUC) per le metriche di sopravvivenza è stata analizzata utilizzando il pacchetto timeROC. Tutti i test statistici sono stati condotti con un approccio a due lati. Un livello di significatività di P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Risultati
L'IRAIN è sottoregolato nel glioma ed è associato a caratteristiche clinicopatologiche avverse
Il processo di analisi è illustrato nella Figura 1. L'espressione di IRAIN è stata valutata per la prima volta tramite qRT-PCR in astrociti primari, tessuti gliomici e linee cellulari gliomatiche. I livelli di IRAIN sono stati nettamente ridotti sia nei tessuti gliomatici di basso che di alto grado e in tutte e quattro le linee cellulari del glioma (SHG44, A172, U251 e T98G) ris...
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Discussione
Il glioma rimane una delle malignità più letali del sistema nervoso centrale, caratterizzata da una profonda eterogeneità intratumorale e resistenza alla terapia convenzionale. Nonostante la resezione chirurgica combinata con chemioradioterapia, recidiva e mortalità rimangono elevate, e la sopravvivenza mediana dei pazienti, in particolare di quelli con glioblastoma, ha mostrato miglioramenti limitati negli ultimidecenni 4,24. Ev...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo tutti i partecipanti e ricercatori coinvolti nel progetto Genotype-Tissue Expression (GTEx) e nei database TCGA, CGGA per aver condiviso i dati disponibili. Questo lavoro è stato supportato dal Progetto Provinciale di Tecnologia Sanitaria del Fujian (2024GG01010154) e dal Progetto di Scalata Doctoral Workstation dell'Ospedale di Zhangzhou (PDA202306). Il finanziatore ha fornito fondi per la nostra ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di apoptosi Annexin V-PI | Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USA | NA | Utilizzato per valutare l'apoptosi |
| Kit di apoptosi AnnexinV-PI | Biotecnologia del Sud | 10010-02 | Utilizzato per la valutazione dell'apoptosi tramite citometria a flusso. |
| Anti-IGF1, Anti-IGF1R, Anti-JAK2, Anti-STAT3, Anti-Survivin, Anti-β-actin | Abcam | ab182408, ab108596, AB109085, AB76424, AB8227 | Anticorpi utilizzati per l'analisi Western Blot delle vie di segnalazione. |
| BiocManager | CRAN | 1.30.25 | Installare e gestire i pacchetti Bioconductor in R & ge; 3.6. |
| Sistema Bio-Rad CFX96 | Bioconduttore | 1.5.1 | Accesso programmatico alla proteina STRING– Interazioni proteiche. |
| Caret | CRAN | 0.4 | ROC/AUC dipendente dal tempo per i modelli di sopravvivenza. |
| Atlante del Genoma del Glioma Cinese (CGGA) | NA | CGGA693 e CGGA325 | Utilizzato per la concorrenza e la validazione del modello |
| Clusterprofiler | Bioconduttore | 2.18.0 | Analizza i file MAF; calcolare il carico mutazionale tumorale (TMB) e il paesaggio mutazionale. |
| Corrplot | CRAN | 3.5.0 | Graficazione generale (boxplot, violin plot, scatter, linee di tendenza). |
| Coxboost | CRAN | 7.3-60 | stepAIC per la selezione del modello Cox passo a passo. |
| Data.Table | CRAN | readr2.1.5 | Lettura rapida di file delimitati; robusta maneggevolezza UTF-8. |
| Dose | Bioconduttore | 3.17.0 | Annotazione genetica umana (Entrez, Ensembl, mappe SYMBOL). |
| Dynamictreecut | CRAN | 1.73 | Analisi della rete di coespressione genica pesata; pickSoftThreshold, TOM, rilevamento moduli. |
| Bordatore | Bioconduttore | 3.56.2 | Espressione differenziale (voom/modelli lineari); Wilcoxon/Bayes empirico; Input per vulcani/heatmap. |
| Enarrichimento | Bioconduttore | 3.26.2 | Arricchimento dell'Ontologia delle Malattie e aiuti GSEA (usati con clusterProfiler). |
| Flashclust | CRAN | 1.63-1 | Taglio adattivo dei rami per il rilevamento dei moduli WGCNA. |
| GBM | CRAN | 1.12 | Componenti principali supervisionati per l'analisi della sopravvivenza. |
| Omnibus sull'Espressione Genica (GEO) | NA | GSE43378 | Utilizzato per la concorrenza e la validazione del modello |
| GEOquery | Bioconduttore | NA | Scarica e analizza dataset GEO. |
| Ggplot2 | CRAN | 1.0.12 | Heatmap pronte per la pubblicazione delle firme espressive. |
| Glmnet | CRAN | 3.3.1 | Foresta di sopravvivenza casuale per risultati giusti e censurati. |
| Anticorpi secondari anti-coniglio marcati con perossidasi di rafano | Abcam | ab6721 | Anticorpi secondari per la rilevazione nel Western Blot. |
| Linee cellulari di glioblastoma umano (SHG44, U251, A172, T98G) | Collezione Americana di Colture Tissutali | NA | Linee cellulari umane di glioblastoma per la ricerca sul glioma. Le cellule sono state coltivate in DMEM + 10% FBS, 2 mM L-glutammina. |
| Igraph | CRAN | 10.0.1 | Accedi ai set geni MSigDB (ad esempio, MRG metabolici); Cornici ordinati e comodi. |
| Software Image J | Media Cybernetics, USA | 152 | Utilizzato per la visualizzazione |
| Vettore lentivirale che codifica lncRNA-IRAIN | GeneChem, Shanghai, Cina & nbsp; | NA | Vettori lentivirali utilizzati per la trasfezione di glioma e cellule HEB per stabilire cloni stabili. |
| Limma | Bioconduttore | 3.48.0 | Correzione batch (ComBat) e analisi delle variabili surrogate. |
| Maftools | Bioconduttore | 1.52.0 | Harrell' s Indice di concordanza (C index) e utility di confronto per la sopravvivenza. |
| Un sacco | CRAN | 4.1-8 | Modelli Cox penalizzati: lasso, cresta e rete elastica. |
| Msigdbr | CRAN | 0.0.5 | Supporta i metodi delle macchine vettoriali per i dati di sopravvivenza. |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | Utilizzato per sami di proliferazione cellulare. |
| Cellule gliali normali (HEB) | Collezione Americana di Colture Tissutali | NA | Linea cellulare gliale umana normale per studi di confronto. Coltivato in DMEM + 10% FBS. |
| Org.Hs.Eg.Db | Bioconduttore | 4.8.3 | Arricchimento GO/KEGG e GSEA; supporta molteplici tipi di ID. |
| Pheatmap | CRAN | 2.0.0 | Grammatica della data science; Include DPLYR, Tidyr, Purrr, GGPLOT2 per gestire e pianificare. |
| Plsrcox | CRAN | 1.5 | Boosting basato sulla probabilità per i modelli Cox. |
| Membrane PVDF | Millipore | IPVH00010 | Membrane utilizzate per il trasferimento proteico dopo SDS-PAGE. |
| Randomforestsrc | CRAN | 6.0-94 | Ricampionamento unificato (incluso LOOCV), griglia di tuning e pipeline di modello. |
| Readr | CRAN | NA | Recupera matrici/fenotipi da UCSC Xena (ad esempio, hub TCGA/GTEx). |
| Gel SDS-Page (12%) | Bio-Rad | 185-5096 | Sistema utilizzato per la PCR quantitativa. |
| Stringdb | Bioconduttore | 1.20.3 | Visualizzazione per i risultati dell'arricchimento (dotplot, cnetplot, ridgeplot). |
| Superpc | CRAN | 1.7.7 | Regressione parziale dei minimi quadrati adattata ai modelli di Cox. |
| Survcomp | Bioconduttore | 3.42.4 | Conta la normalizzazione e la stima della dispersione quando necessario (opzionale, complementa limma voom). |
| Sopravvivenza | CRAN | 1.01-2 | Clustering gerarchico veloce usato dalla WGCNA (opzionale). |
| Sopravvivenza | CRAN | 2.2.2 | Modellazione di regressione amplificata generalizzata (gradient boosting). |
| Survminer | CRAN | 3.8-3 | Modelli di rischio proporzionale Cox; Kaplan– Curve Meier. |
| TCGAbiolinks | Bioconduttore | T9039 | Accesso programmatico ai dati TCGA; Scarica/prepara dati di espressione e clinici. |
| Il Programma dell'Atlante del Genoma del Cancro (TCGA) | NA | https://www.cancer.gov/tcga; 175 GBM e 534 LGG | Utilizzato per la concorrenza e la validazione del modello |
| Tidyverse | CRAN | 1.17.6 | Manipolazione dei dati ad alte prestazioni per matrici/tabelle di grandi dimensioni. |
| Timeroc | CRAN | 0.5.0 | Visualizzazione KM e rendering della tabella del rischio. |
| TRIZOL | Invitrogen | 15596026 | Reagente per l'estrazione di RNA dalle cellule. |
| UCSC Xena | NA | https://xenabrowser.net/datapages/ | Utilizzato per la concorrenza e la validazione del modello |
| Ucscxenatools | Bio-Rad | 4561044 | Utilizzato per la separazione delle proteine nell'analisi del Western Blot. |
| WGCNA | CRAN | 0.95 | Matrici di correlazione per geni di checkpoint e relazioni tra le caratteristiche. |
Riferimenti
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