Articolo metodologico

Migliorare gli schermi CRISPR-Cas9 nelle cellule CAR T: un metodo raffinato per la preparazione delle librerie

DOI:

10.3791/69721

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2 gennaio 2026

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1Hemato-Oncology Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 2Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer (CIBERONC), 3Computational Biology and Translational Genomics Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 4Cancer Center Clinica Universidad de Navarra (CCUN), 5Data Science and Artificial Intelligence Institute (DATAI), Universidad de Navarra, 6Hematology and Cell Therapy Department, Clinica Universidad de Navarra, IdiSNA

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato di screening knockout CRISPR-Cas9 per le cellule CAR T primarie. Riducendo il trasferimento del gDNA tramite la digestione enzimatica e il pulldown delle cassette sgRNA, questo approccio minimizza gli artefatti PCR, garantendo una rilevazione accurata degli sgRNA e un'identificazione robusta dei bersagli genici funzionali.

Abstract

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Le terapie con i recettori dell'antigene chimerico (CAR) con cellule T hanno dimostrato un'efficacia notevole in diverse neoplasie ematologiche, tuttavia il loro successo non è stato completamente replicato nei tumori solidi. Inoltre, anche nei tumori ematologici, la ricaduta dopo l'infusione di cellule CAR T continua a compromettere gli esiti a lungo termine. Queste sfide evidenziano l'urgente necessità di sviluppare strategie che migliorino l'efficacia, la persistenza e la superazione della resistenza mediata da tumori e microambienti. Le piattaforme di screening a ripetizioni palindromiche brevi raggruppate regolarmente interspaziate (CRISPR)-Cas9 offrono un approccio potente per identificare sistematicamente i geni che regolano la funzione delle cellule CAR T. Collegando le perturbazioni genetiche agli esiti fenotipici, questi saghi permettono la scoperta di vie che controllano attivazione, proliferazione, formazione della memoria e citotossicità. I flussi di lavoro standard prevedono la trasduzione di un numero consistente di cellule con una singola libreria di RNA guida (sgRNA), l'editing mediato da Cas9, la selezione delle cellule modificate e l'amplificazione PCR di cassette sgRNA dal DNA genomico (gDNA) prima del sequenziamento. Tuttavia, l'amplificazione PCR con grandi quantità di gDNA presenta sfide significative e spesso non riesce ad amplificare e recuperare selettivamente gli sgRNA. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato di screening knockout CRISPR-Cas9, che abbiamo testato sulle cellule CAR T umane primarie. Il metodo qui incorpora un passaggio intermedio durante la preparazione della libreria sgRNA che riduce il trasferimento del gDNA tramite la digestione enzimatica e il pulldown selettivo della cassetta sgRNA, aumentando così l'efficienza della prima amplificazione PCR. Questa modifica ci ha permesso di recuperare informazioni sullo sgRNA attraverso i nostri schermi delle cellule CAR T, che erano rimasti sfuggenti nei nostri precedenti tentativi utilizzando i tradizionali protocolli di amplificazione PCR a 1 e 2 passi. In conclusione, questo flusso di lavoro ottimizzato facilita la preparazione della libreria di screening CRISPR in campioni difficili e consente l'identificazione dei determinanti genetici chiave che possono essere mirati per migliorare l'efficacia terapeutica.

Introduzione

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L'immunoterapia ha rivoluzionato il trattamento del cancro, offrendo strategie innovative per sfruttare e modulare il sistema immunitario. Tra questi, la terapia con le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) è emersa come uno degli approcci più trasformativi. Questa terapia prevede l'ingegneria genetica delle cellule T del paziente ex vivo con un recettore sintetico progettato per riconoscere uno specifico antigene tumorale, aumentando così l'attivitàantitumorale 1. Le cellule CAR T hanno mostrato un successo notevole nelle neoplasie ematologiche, con esiti che vanno da remissioni di breve durata a una prolungata sopravvivenza senza malattia con tossicità minima nei pazienti che ricevevano terapie mirate al CD19o BCMA2. Ad oggi, la FDA ha approvato sette prodotti a base di cellule CAR T per tumoriematologici 3. Nonostante questi progressi, persistono limiti significativi. Le sfide sorgono dal prodotto stesso delle cellule T CAR, spesso influenzate dal processo di produzione o dalla fitness delle cellule T del paziente, che possono essere compromesse dalla progressione della malattia, terapie precedenti o dall'età. I meccanismi di resistenza intrinseca al tumore, come la riduzione degli antigeni, possono anch'essi comprometternel'efficacia 4. Inoltre, il microambiente tumorale immunosoppressivo rappresenta una barriera aggiuntiva che limita gravemente la persistenza e la funzione delle cellule CAR T, in particolare nei pazienti con tumoresolido 5. Di conseguenza, è urgente migliorare sia l'efficacia iniziale che a lungo termine delle terapie con cellule CAR T.

L'avvento dell'editing genico CRISPR-Cas9 ha fornito potenti strumenti per dissezionare la funzione genica attraverso approcci di screening su larga scala. In questi saggi, le cellule vengono trasdotte con una libreria di RNA a guida singola (sgRNA), tipicamente fornita da vettori lentivirali, garantendo un sgRNA per cellula e un'integrazione genomica stabile. Dopo l'editing e la selezione mediati da Cas9 delle cellule trasdotte, viene estratto DNA genomico (gDNA) e le cassette sgRNA vengono amplificate tramite PCR per la preparazione della libreria. Il sequenziamento ad alta produttività consente quindi la quantificazione delle distribuzioni di sgRNA tra diversi fenotipi, identificando così geni che regolano positivamente o negativamente il processo sotto lo studio6.

Lo screening CRISPR è stato ampiamente applicato per esplorare la biologia delle cellule T e, più recentemente, per migliorare le prestazioni delle cellule CAR. Gli screening a livello genomico hanno identificato regolatori dei processi fondamentali delle cellule T, inclusi attivazione, proliferazione e differenziazione. Ad esempio, FAM49B è stato identificato come regolatore della segnalazione del recettore delle celluleT 7, mentre SOCS1, TCEB2, RASA2 e CBLB si sono dimostrati essenziali per la proliferazione dopo la stimolazione8. Oltre a queste vie fondamentali, lo screening CRISPR ha anche elucidato geni coinvolti nella memoria e nell'esaurimento delle cellule T. Gli studi in vivo hanno identificato Fli1 come candidato per migliorare le risposte degli effettori senza disturbare i precursori della memoria o dell'esaurimento9, e il rimodellatore della cromatina Arid1a come regolatore la cui perdita riduce l'esaurimento delle celluleT 10. I regolatori della differenziazione di tipo T helper 2 (Th2) sono stati caratterizzati con questo approccio11. Utilizzando una libreria sgRNA personalizzata che mira a 25 chinasi, p38 è stato riscontrato favorire l'espansione, la formazione della memoria e la protezione dallo stress ossidativo egenomico 12. Analogamente, il knockout con REGNASI-1 nelle cellule T CD8+ ha conferito un fenotipo effettore a lunga durata che ha migliorato il controllo tumorale nei modelli13 di melanoma e leucemia. Ulteriori screening genomici hanno identificato Dhx37 come regolatore dell'attivazione e citotossicità delle celluleT 14, mentre LTBR e altri geni sono stati convalidati come potenziatori della funzione delle cellule T in CAR T e γδ T15. Più recentemente, lo screening CRISPR è stato applicato direttamente nelle cellule CAR T, rivelando nuovi bersagli come PRODH2, un enzima coinvolto nel metabolismo della prolina che aumenta l'attività antitumoraleCAR T 16, e TLE4 e IKZF2, la cui inattivazione ha migliorato l'efficacia di CAR T nei modellidi glioblastoma 17.

Un passaggio fondamentale negli schermi CRISPR è proprio l'amplificazione selettiva delle cassette sgRNA da quantità estremamente elevate di gDNA, una sfida difficile da aggirare dato l'enorme numero di cellule utilizzate negli screening CRISPR. L'amplificazione PCR da quantità così elevate di DNA trasportato presenta diverse sfide tecniche, tra cui il sovraffollamento molecolare che limita la diffusione fisica di DNA e molecole di polimerasi, il legame aspecifico transitorio degli innetti e della polimerasi al fondo del DNA, l'amplificazione fuori bersaglio che porta all'esaurimento dell'innesco, o il sequestro di Mg2+ da parte della dorsale del DNA fosfato, tra le altre sfide18, 19, 20, 21. Questi spesso portano a fallimenti e/o polarizzazioni PCR. Per mitigare questi problemi, sono state proposte diverse strategie, tra cui separare l'amplificazione dello sgRNA dall'aggiunta dell'adattatore in due passaggiPCR 22, l'uso dell'arricchimento bersaglio con oligos biotinilati e la cattura a sferamagnetica 23,24, o la progettazione di plasmidi con siti di restrizione ai lati della cassetta sgRNA per l'arricchimentodel frammento 25.

In questo studio, presentiamo un protocollo ottimizzato di screening knockout CRISPR-Cas9 per le cellule CAR T primarie umane. La libreria CRISPR utilizzata è Brunello Kinome 1, una libreria che contiene 3052 sgRNA unici lunghi 20nt che prendono di mira 763 geni chinasi umani (4 sgRNA per bersaglio). Le cellule T sono state isolate tramite selezione magnetica positiva CD4+ e CD8+ dalla frazione arricchita con cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) di campioni di sangue provenienti da donatori sani. All'attivazione con anti-CD3 e anti-CD28, le cellule T sono state infecciolate con la libreria di screening CRISPR, quindi trasdotte con il lentivirus CAR. Le cellule sono state espanse, poi nucleofettate per introdurre la proteina Cas9. Le cellule portanti CRISPR sono state selezionate con puromicina e le cellule T CAR-positive sono state selezionate. Dopo l'estrazione, il DNA genomico è stato digerito con enzimi di restrizione (RE) e i frammenti contenenti sgRNA sono stati ritrassi dalla cattura con sonda biotina e streptavidina. Successivamente, gli sgRNA venivano amplificati e indicizzati selettivamente tramite due PCR consecutive, e le librerie risultanti venivano sequenziate. Incorporando un passaggio intermedio per ridurre il trasferimento del gDNA, siamo riusciti a recuperare e amplificare selettivamente il nostro sgRNA di interesse, il che ci permette di studiare il ruolo delle chinasi nelle cellule T CAR.

Protocollo

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Questo protocollo è stato eseguito in conformità con le linee guida dell'Universidad de Navarra. Tutti i soggetti hanno fornito un consenso scritto e informato. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Isolamento e attivazione delle cellule T

  1. Isolamento PBMC
    1. Prelevare campioni di sangue dai donatori su tubi di acido etilendiaminetetraacetico (EDTA), trasferire i campioni di sangue su tubetti conici da 50 mL e diluire il sangue con PBS (diluizione 1:1).
    2. Aggiungere 15 mL di mezzo a gradiente di densità sul fondo di un tubo conico da 50 mL (densità per PBMC: 1,07). Poi, aggiungi con cura 25 mL di sangue diluito sullo strato medio a gradiente di densità (la velocità più lenta del controller della pipetta). Centrifuga per 30 minuti a 800 × g senza freno.
    3. Raccogli l'anello/strato dei PBMC con una pipetta Pasteur in un tubo conico da 50 mL e aggiungi PBS a un volume totale di 50 mL da lavare. Centrifuga a 650 × g per 8 minuti. Scartate il soprannatante.
      NOTA: Controlla la torbidità del sovrandante per essere sicuro che non ci siano cellule lì. In caso di dubbio, dividere la sospensione in due volte il numero originale di tubi conici da 50 mL, aggiungere PBS fino a 50 mL e centrifugare nuovamente.
    4. Risospendere 50 mL di PBS. Contare con acridina arancione-propidio ioduro (AOPI) in un contatore cellulare. Centrifuga a 650 × g per 8 minuti.
  2. Selezione magnetica CD4 e CD8
    1. Preparare il buffer di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS): PBS, EDTA 2,5 μM, BSA 0,5% e filtrare fino a 0,2 μm.
    2. Sospendere i PBMC in 80 μL di buffer FACS sterile ogni 10 ×10 6 celle e aggiungere 10 μL di microsfere CD4 e 10 μL di microsfere CD8 ogni 10 ×10 6 cellule. Incubare 20 minuti a 4 °C.
    3. Aggiungi 10 mL di tampone FACS e centrifuga per 8 minuti a 650 × g. Scartate completamente il soprannativante.
    4. Risospendere in 500 μL ogni 1 ×10 8 celle di FACS Buffer in un tubo conico da 15 mL.
      NOTA: Una corsa può ospitare 200 x 106 celle.
    5. Usa il programma Possel per l'isolamento di AutoMac (classificatore di celle magnetiche ad alta velocità).
    6. Aggiungi fino a 10 mL di PBS, conti con AOPI in un contatore a celle fluorescenti e centrifuga a 650 × g per 8 minuti.
    7. Sospendere cellule 1 x 106/mL in un substrato di crescita per cellule T contenente 3% di siero umano (HS), 1% di penicillina/streptomicina (P/S), 625 IU/mL di interleucina (IL)-7, 85 IU/mL di IL-15. Aggiungi 10 μL di reagente di stimolazione delle cellule T ogni 1 mL e mescola bene. Placcare 2 mL per pozzo in una piastra da 24 pozzi (p24w) e incubare per 24 ore a 37 °C.

2. Produzione di cellule CAR T e screening CRISPR

  1. Spinfezione della biblioteca e trasduzione CAR
    1. Aggiungi la quantità corrispondente di libreria CRISPR di lentivirus (ad esempio, libreria Brunello Kinome 1). Vedi Tabella Supplementare 1), determinata in un saggio di titolazione e 8 μg/mL polibrene.
    2. Spinfetta tramite centrifugazione a 700 x g per 1 ora e 30 minuti a 32 °C.
    3. Sostituire il substrato con un nuovo substrato di crescita delle cellule T contenente 3% di HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 (cellula finale = 106 cellule/mL).
    4. Dopo 6 ore, aggiungere la quantità corrispondente di vettore lentivirale CAR a una molteplicità di infezione (MOI) di 3 e incubare per 4 giorni.
  2. Elettroporazione Cas 9
    1. Raccogli le cellule CAR T, lava una volta con PBS e conta le cellule con AOPI in un contatore fluorescente.
    2. Preparare Cas9 da 4 μM in tampone di elettroporazione.
    3. Risospendere le cellule T CAR a 50 μL ogni 5 × 106 cellule. Mescola e aggiungi con attenzione 50 μL di sospensione a celle in ogni pozzo di una striscia cuvette multipozzetto senza formare bolle. Poi, usando una punta a pipetta, rimuovi eventuali bolle e fai scorrere la punta lungo i bordi del pozzo.
      NOTA: Se un pozzo in una cuvetta rimane senza campione, aggiungi lo stesso volume di tampone di elettroporazione. Questo è un passaggio critico: se la macchina rileva una differenza di bolla o volume, darà un errore.
    4. Usa il programma ESPANDI CELLULA T 3 in cellule CAR nucleofetti.
    5. Lascia le cellule nelle cuvette in incubatrice a 37 °C per 40 minuti.
    6. Risospendere le cellule nucleofettate in un mezzo di crescita delle cellule T contenente 3% di HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 (cellula finale = 106 cellule/mL) e incubare a 37 °C per 3 giorni.
  3. Selezione della puromicina
    1. Conta con AOPI in un contatore a cellule fluorescenti.
    2. Regolare a 1 x 106 cellule/mL con un mezzo di crescita per cellule T contenente IL7 e IL15.
    3. Aggiungi puromicina (2,5 μg/mL) al substrato.
    4. Contare le cellule ogni 2 giorni per 6 giorni e regolare a 1 x 106 cellule/mL con un mezzo di crescita cellulare contenente 3% di HS, 1% P/S, 625 IU/mL di IL-7, 85 IU/mL di IL-15 e 2,5 μg/mL di puromicina.
    5. Controlla la percentuale di CAR.
  4. Classificare le popolazioni di cellule CAR T e conservare campioni (pellet a cellule secche) a -80 °C.

3. Isolamento del gDNA

NOTA: Evitare perdite cellulari o gDNA durante il processo, poiché ciò potrebbe compromettere la rappresentatività degli sgRNA. Punta a una copertura sgRNA di almeno 500 volte.

  1. Estrai il gDNA dai campioni utilizzando il kit di estrazione di cellule e tessuti. Elute due volte per massimizzare il recupero del gDNA.
    NOTA: Non utilizzare più di 4 x 106 cellule per colonna per recuperare il gDNA in modo più efficiente.
  2. Misura la concentrazione di gDNA con il kit di quantificazione del dsDNA.
    NOTA: Se la concentrazione è troppo bassa per le fasi successive del protocollo, utilizzare un reagente di pulizia a bilie a sfera per immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI) per concentrare il DNA.

4. Arricchimento della cassetta sgRNA (ed eliminazione del trasferimento del gDNA)

  1. Digestione enzimatica di restrizione
    1. Digerire un massimo di 5 μg di gDNA con 20 U dell'enzima/s (ad esempio, per la spina dorsale lentiGuide-puro per la libreria Brunello Kinome 1 utilizzare la combinazione NdeI e PspXI) in un volume totale di 50 μL. Aumentare il numero di reazioni per ottenere la rappresentatività desiderata degli sgRNA.
      NOTA: Seleziona gli enzimi di restrizione da tagliare nelle regioni laterali della cassetta, ma tieni presente che alcuni degli sgRNA potrebbero contenere un sito di restrizione. Questi sgRNA verranno persi in questo passaggio e non appariranno nel sequenziamento. L'assenza di questa guida serve come controllo della digestione. La Tabella Supplementare 1 mostra un elenco degli sgRNA di Kinome 1 che sono scinditi da PspXI e NdeI.
    2. Incubare durante la notte a 37 °C in un termociclatore.
    3. Esegui una pulizia SPRI due volte.
      1. Prepara 10 mL di Elution Buffer (EB) (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) e 50 mL di etanolo fresco al 70%.
      2. Vortice le sfere e aggiungi 100 μL al prodotto della digestione.
      3. Mescola accuratamente pipettando e incuba per 5 minuti. Magnetizza per altri 5 minuti.
      4. Mentre si è sul magnete, aggiungere 200 μL di etanolo al 70% senza disturbare la pallina. Aspetta 30 secondi, poi scarta il soprantantante.
      5. Ripeti il passo 4.1.3.3 per un totale di 2 lavaggi. Lascia asciugare le perline per 2 minuti.
      6. Rimuovere dal magnete, aggiungere 40 μL di buffer di eluzione e risospendere le sfere tramite pipetta. Incubare per 2 minuti.
      7. Magnetizza per 2 minuti e trasferisci il soprantantante in un nuovo tubo.
        NOTA: Quando si imposta questo protocollo per la prima volta, verifica la digestione tramite elettroforesi (capillare). Assicurati che venga osservata una macchia.
  2. Pulldown della cassetta sgRNA.
    1. Preparazione di perle magnetiche di streptavidina.
      1. Prepara il tampone di lavaggio/legaggio 2x: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA. Diluire metà del volume con H2O a 1x.
      2. Vortice le perline per 1 minuto.
      3. Trasferisci il volume desiderato di perline in un tubo (tipicamente 1 mg è sufficiente), aggiungi un volume uguale di Wash/Binding Buffer 1 volta, o almeno 1 mL, e risospendi.
      4. Metti il tubo su un magnete per 1 minuto e scarta il soprantantante.
      5. Rimuovi il tubo dal magnete e risospezioni le sfere lavate nello stesso volume di 1x Wash/Binding Buffer del volume iniziale di sfere prelevate dalla fiala.
      6. Ripeti per un totale di 3 lavaggi.
      7. Sospensiono le perline in 2x Wash/Binding Buffer.
    2. Aggiungi 5 μL di primer pulldown da 10 μM elencati nella Tabella 1 alla digestione purificata dal passaggio 4.1.3.6.
    3. Incuba in un bagno asciutto a 96 °C per 5 minuti, poi porta subito sul ghiaccio per 5 minuti.
    4. Aggiungi 1 mg di perline magnetiche di streptavidina già lavate.
      NOTA: Il legame biotina-sreptavidina funziona meglio a 1 M NaCl. Assicurati di mescolare volumi uguali di perle e DNA biotinilato.
    5. Incuba per 20 minuti risospendendo il mix ogni 4 minuti.
    6. Magnetizza per 5 minuti.
    7. Lava le palline 3 volte con 1× tampone di lavaggio/rilegaggio.
    8. Sospezione delle sfere a 50 μL di EB 8.0.
      NOTA: Le cassette sgRNA utilizzate qui sono legate alle perle di streptavidina. Non scartarli.

5. preparazione della libreria sgRNA

  1. PCR1
    1. Prepara la miscela PCR1 con 20 μL di tampone Herculase 5x, 1 μL di dNTP (100 mM), 1 μL di DNA polimerasi, 2,5 μL di 10 μL di primer PCR1 diretto e inverso elencati nella Tabella 1, e 23 μL di acqua di grado PCR. Mescola pipette e aggiungi la miscela PCR1 alle perle del passo 4.2.8.
      NOTA: La Tabella 1 elenca i primer PCR1 progettati per la Brunello Kinome Library 1.
    2. Inserire i tubi in un termociclatore ed eseguire il programma per la PCR1 descritto nella Tabella 2.
      NOTA: Assicurati che il termociclatore possa gestire reazioni da 100 μL. Altrimenti, aliquota nelle reazioni di 50 μL. Scala secondo necessità.
    3. Mettere in pool tutte le PCR1 degli stessi campioni in un unico tubo.
    4. Pulizia SPRI PCR1 utilizzando 150 μL (1,5x) di perne (seguite i passaggi 4.1.3.3-4.1.3.7). Risospendere ogni reazione PCR in 100 μL di EB 8,0.
      NOTA: Se si configura questo protocollo per la prima volta, verificare la dimensione e la qualità del prodotto PCR eseguendo 2 μL di un prodotto PCR a 30 cicli in un sistema di elettroforesi capillare (ad esempio, i sistemi TapeStation di Agilent).
  2. PCR2
    1. Prepara la miscela PCR2 con 10 μL del prodotto di PCR1, 10 μL di tampone 5X, 0,5 μL di dNTP (100 mM), 1 μL di DNA polimerasi, 1,25 μL di primer PCR2 da 10 μM elencati nella Tabella 1 (utilizzare una diversa combinazione rP7-i7-BC e P5-i5-BC per ogni campione), e 26 μL di acqua di grado PCR per un volume totale di 50 μL.
      NOTA: Per mantenere la rappresentazione della libreria, esegui una reazione PCR2 ogni 10costrutti 4 nella libreria.
    2. Inserire i tubi in un termociclatore ed eseguire il programma per la PCR2 descritto nella Tabella 2.
    3. Pulizia SPRI PCR2 utilizzando 75 μL (1,5x) di perle (segui i passaggi 4.1.3.3-4.1.3.7). Risospendere ogni reazione PCR in 50 μL di EB 8.0.
  3. Quantificare la PCR2 (cioè la libreria sgRNA) utilizzando il kit di quantificazione del dsDNA e verificare la dimensione dell'amplicon tramite elettroforesi capillare (ad esempio, TapeStation Systems). Raccogli i campioni.
  4. Sequenza su uno strumento Illumina.
    NOTA: Per la libreria Brunello Kinome 1 a 3052 sgRNA qui, una profondità di sequenziamento di 100-200 milioni di letture per campione è tipicamente sufficiente.

6. Analisi

  1. Campioni di demultiplex usando bcl2fastq.
  2. Controlla la qualità dei file fastq generati con FastQC.
  3. Estrai la sequenza dello sgRNA usando come pattern le sequenze su cassette che fiancheggiano lo sgRNA, così come la lunghezza della guida (20 nt).
  4. Allinea la sequenza estratta al riferimento della libreria usando Bowtie2 per verificare quante delle guide ipotetiche siano sgRNA autentici dalla libreria. Usa samtools per convertire il file SAM con le informazioni sull'allineamento in formato BAM e generare file riepilogo.
  5. Contare e normalizzare il numero di letture per ogni sgRNA nei campioni modificati e di controllo con la funzione di conteggio del software MAGecK.
  6. Confronta i conteggi con la funzione di test di MAGecK per ottenere i punteggi RRA e l'elenco dei geni candidati.

Risultati

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Come descritto nella Sezione del Protocollo, le cellule CAR T sono state generate seguendo il nostroprotocollo 26 stabilito. Per lo screening CRISPR, abbiamo adattato il flusso di lavoro sviluppato da Wang et al.17 (Figura 1A). Per un breve periodo, le cellule T di due donatori indipendenti sono state isolate e attivate per 24 ore prima di una trasduzione consecutiva sia con la libreria sgRNA CRISPR sia con il vettore lentivirale CAR, raggiungendo il 67% e il 72% delle cellule CAR-positive al quinto giorno. Una frazione delle cellule è stata nucleofetata con la proteina Cas9 per indurre knockout, mentre le cellule rimanenti hanno servito come base per la rappresentazione dello sgRNA. Le cellule trasdotte sono state selezionate con antibiotici e successivamente popolazioni distinte sono state selezionate in base ai fenotipi in studio. La proliferazione delle cellule CAR T è stata monitorata durante lo screening utilizzando conteggi cellulari basati su AOPI, ed espressa come cambiamento di piega (Figura 1B). Dopo l'integrazione con puromicina ai giorni 8, 10 e 12, abbiamo confermato un arricchimento riuscito delle cellule CAR T trasdotte con la libreria CRISPR in entrambi i donatori, come dimostrato dalla sopravvivenza e proliferazione continue. Cellule T non trasdotte (UTD) e cellule CAR T prive di trasduzione della libreria CRISPR sono state utilizzate come controlli della selezione degli antibiotici.

Dopo l'estrazione del DNA genomico, sono state preparate librerie di sgRNA tramite amplificazione PCR. Per superare i problemi derivanti da un eccesso trasferimento di gDNA, abbiamo implementato un protocollo che incorpora la digestione enzimatica di restrizione e il pulldown biotina-streptavidina della cassetta sgRNA (Figura 2A,B). Il gDNA è stato digerito con enzimi di restrizione NdeI e PspXI che fiancheggiano la cassetta sgRNA (Figura 2C). Oligos biotinilati, progettati per legarsi a monte dei siti di ricottura del primer PCR1, sono stati utilizzati per catturare frammenti di cassetta sgRNA, poi rimossi con sfere di streptavidina per eliminare il gDNA trasmesso. I frammenti contenenti sgRNA sono stati poi amplificati selettivamente (Figura 2D) e indicizzati attraverso 2 PCR consecutive.

Le librerie di ogni campione venivano sequenziate utilizzando il Next Generation Sequencing (NGS). Dopo il demultiplexing, il controllo qualità e l'identificazione degli sgRNA, i dati sono stati analizzati con la pipeline MAGeCK. Per prima cosa, il comando count quantificò e normalizzò i conteggi di lettura degli sgRNA nei campioni di controllo (basali) e quelli modificati da Cas9 (Figura 3A,B). Le correlazioni di Pearson e Spearman indicano che la rappresentatività dello sgRNA è stata mantenuta durante l'esperimento (gDNA donatore) rispetto alla libreria plasmidica (Figura 3C). Successivamente, il comando di test confrontò entrambe le condizioni, assegnando punteggi robusti di aggregazione dei ranghi (RRA) a ciascun gene (Figura 3D). Geni significativamente arricchiti o depauperati sono stati identificati utilizzando soglie di p < 0,05 e log fold change (LFC) > 0,5 (Figura 3E). Infine, è stata effettuata un'analisi di arricchimento delle vie dei geni candidati utilizzando Metascape, rivelando i termini principali dell'Ontologia Genica associati ai regolatori identificati (Figura 3F).

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Figura 1: Screening CRISPR nelle cellule CAR T. (A) Schema dello screening CRISPR nelle cellule CAR T. (B) Selezione delle cellule trasdotte con puromicina (P). Le librerie plasmidiche includono un gene di resistenza alla puromicina per la selezione positiva. L'antibiotico è stato aggiunto all'ottavo giorno al substrato in campioni non trasdotti di cellule T non trasdotte (UTD) e CAR T trasdotte. Campioni senza puromicina sono stati utilizzati come controllo della proliferazione. Sono mostrati i dati di due donatori indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Preparazione della libreria per l'analisi dell'arricchimento degli sgRNA. (A) Schema del protocollo per la preparazione della biblioteca. (B) Schema della localizzazione relativa delle dimensioni di taglio dell'enzima di restrizione (forbici) e delle regioni di ricottura degli innesco PCR1 (freccia) e degli innetti biotinilati (freccia con punto verde). (C) Elettroforesi del gDNA prima e dopo la digestione RE. (D) Arricchimento selettivo delle cassette sgRNA dopo PCR1. Sono mostrati i dati di due donatori indipendenti provenienti da campioni basali e Cas9 dei due fenotipi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Guida l'analisi dell'arricchimento con MAGeCK. (A) Riepilogo dell'output della funzione di conteggio MAGeCK. (B) Distribuzione dei conteggi di lettura. (C) Coefficienti di Pearson e Spearman per la correlazione tra il conteggio del gDNA dei donatori e delle librerie plasmidi. (D) Geni potenzialmente arricchiti/depurati classificati tramite un'aggregazione di classifica robusta modificata (punteggio RRA). (E) Grafico vulcanico che mostra geni significativi (valore p < 0,05, LFC > 0,5) in rosso. (F) Termini Top Gene Ontology (GO) dopo l'analisi delle vie Metascape dei geni significativi arricchiti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Sequenza di primer. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: condizioni PCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 1: Elenco degli sgRNA nella libreria Kinome 1 e degli sgRNA persi durante la digestione con NdeI e PspXI Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

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Lo screening CRISPR si basa sul principio della perturbazione a guida singola, il che significa che dovrebbe essere integrato un solo sgRNA per cellula. Per raggiungere questo obiettivo, gli sgRNA vengono tipicamente somministrati tramite vettori lentivirali e la molteplicità delle infezioni (MOI) deve essere controllata con attenzione. Un MOI di ca. Generalmente si raccomanda 0,3, con il risultato che il 25%-30% delle cellule viene trasdotto con una singola particellavirale 6. Una titolazione accurata è quindi essenziale per determinare il volume di particelle virali necessarie. Un altro passo cruciale è la perdita della copertura degli sgRNA durante il protocollo. La perdita cellulare durante il prelievo, le inefficienze durante l'estrazione del gDNA (in particolare sovraccarico di colonna ed eluzione incompleta del DNA), o un modello eccessivo durante l'amplificazione PCR possono tutti contribuire a questa perdita, distorcendo così la nostra analisi dello sgRNA. Per quanto riguarda gli oligos biotinilati, è meglio che siano purificati con HPLC per evitare che la biotina libera utilizzata nella sintesi saturi le sfere di streptavidina. Inoltre, si consiglia fortemente un amino-modificatore a 3' per prevenire l'amplificazione da parte degli inneschi biotinilati nelle successive PCR. Inoltre, quando si progettano questi oligos, evita qualsiasi sovrapposizione con i primer PCR1 per evitare la competizione durante l'amplificazione. Inoltre, l'analisi bioinformatica richiede un'attenta attenzione: i modelli di estrazione degli sgRNA dipendono dalla spina dorsale plasmidiale (ad esempio, lentiGuide-puro o lentiCRISPR v2), e la stringenza dell'allineamento può variare da corrispondenza esatta a una certa tolleranza per le discrepanti. Inoltre, poiché questo protocollo include una fase di digestione, alcuni sgRNA contenenti siti di restrizione possono andare persi, richiedendo l'aggiustamento della libreria di riferimento.

In questo studio, proponiamo un protocollo ottimizzato di preparazione della libreria di screening CRISPR che arricchisca frammenti contenenti sgRNA tramite la digestione e, cosa più importante, tramite uno pulldown step. La digestione enzimatica di restrizione è stata precedentemente suggerita come strategia per ridurre l'input di gDNA e arricchire le cassettesgRNA 27. Analogamente, le sonde biotinilate sono state ampiamente applicate in biologia molecolare per catturare specifici acidi nucleici o complessi proteina-acidonucleico 28,29,30,31.

Il nostro protocollo si basa su questi principi e li adatta per lo screening CRISPR nelle cellule CAR T primarie, anche se vanno riconosciute diverse limitazioni. Innanzitutto, le cellule T CAR primarie impongono vincoli sulla scala di screening, poiché la loro capacità di espansione è limitata. Per mantenere una copertura adeguata e una rappresentazione dello sgRNA, è necessario un gran numero di cellule iniziali. Quando ciò non è fattibile, possono essere usate librerie personalizzate piùpiccole 12, anche se ciò riduce l'ampiezza dell'interrogatorio genetico. La variabilità biologica è un'altra sfida; Sono previste differenze tra i donatori, e la sovrapposizione dei risultati significativi è spessomodesta di 17. In secondo luogo, la strategia di arricchimento si basa sulla presenza e posizione dei siti di taglio dell'enzima di restrizione. In rari casi, questi siti possono verificarsi all'interno di sequenze sgRNA, il che è più problematico per librerie piccole con ridondanza limitata. Tuttavia, la maggior parte delle librerie, in particolare quelle genomiche a livello genomico, include più sgRNA per bersaglio, minimizzando l'impatto complessivo della perdita di guida. Infine, strategie alternative di arricchimento basate sulla frammentazione, come la sonicazione abbinata alla catturadella sonda 24, possono offrire una certa flessibilità nei casi in cui la digestione con enzimi di restrizione non è adeguata.

Nel complesso, la cassetta sgRNA rappresenta una frazione minuscola del DNA genomico totale nelle cellule modificate da CRISPR, rendendo un arricchimento efficiente fondamentale per la preparazione di una libreria di successo. Rispetto ai protocolli standard, il nostro flusso di lavoro ottimizzato riduce il trasferimento del gDNA e favorisce l'amplificazione PCR dello sgRNA di interesse. Sebbene la combinazione di frammentazione del gDNA e pulldown della sonda biotinilata con le perle di streptavinina non sia concettualmente nuova, la sua integrazione nello screening CRISPR evita comuni trappole PCR e aumenta la riproducibilità dello screening CRISPR. Inoltre, l'incorporazione di metriche QC standardizzate in ogni fase chiave (come la purezza post-smistamento delle cellule T, la proporzione di cellule resistenti alla puromicina, l'integrità del gDNA e l'efficienza della trasduzione CAR) migliorerebbe ulteriormente la robustezza e la riproducibilità del flusso di lavoro. In conclusione, sebbene sviluppato nel contesto delle cellule CAR T primarie e con solo due donatori (che potrebbero rappresentare una limitazione, anche se sono stati utilizzati diversi campioni per ogni donatore), questo protocollo ottimizzato potrebbe essere ampiamente applicabile ad altri screening CRISPR e flussi di lavoro NGS con grandi rassegni di gDNA.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato supportato dal progetto PID2022-137914OB-I00 finanziato da MICIU/AEI /10.13039/501100011033 e da FEDER, UE. Questo studio è stato supportato dall'Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) tramite Red de Terapias, Avanzadas, TERAV e TERAV+ (RD21/0017/0009 e RD24/0014/0010) e tramite il Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer CIBERONC (CB16/12/00489). Questo studio è stato supportato dal Gobierno de Navarra Salud (GN2023/08 e GN2024/04) e da Proyectos Estratégicos (DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 e 0011-1411-2023-000074). La Figura 1B e la Figura 2A sono state create con BioRender.com

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4200 TapeStationAgilentG2991A
Acridine OrangeInvitrogenA1301
AMPure XP Beckman CoulterA63881
Separatore NEO autoMACSMiltenyi130-120-327Selezionatore a celle magnetiche ad alta velocità
Oligo biotinilatiIDT
BSASigmaA9647
Contatore a celle fluorescenti K2 del cellometroRevvityCMT-K2-MX-150Contatore a celle fluorescenti
Camere di conteggio CHT4RevvityCHT4-SD100-002
Nanoperle CD4 di CytoSinctGenScriptL00863-1
Nanosfere CytoSinct CD8GenScriptL00864-1
dNTPAgilent200418-51
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen11206D
Calamita DynaMag-2Invitrogen12321D
EDTA 0,5 M pH 8,0Invitrogen15575-038
EtanoloMerck1,00,98,31,000
Elettroporatore ExPERT ATXMaxCyteExPERT ATx
Ficoll-PaqueCytiva17544203
Filtropur S 0.2 & micro; mSarstedt83,18,26,001
GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-ResearchGenScriptZ03621-1
Buffer Herculase 5XAgilent600675-52Buffer 5X
Enzima di fusione dell'Erculasi IIAgilent600679-51DNA polimerasi
IL-15Miltenyi130-095-765
IL-7Miltenyi130-095-362
Mastercycler X50aEppendorf6313HG006059
Buffer di Elettroporazione MaxCyteCytivaEPB1
NdeINew England BiolabsR0111L
Tessuto nucleospinMacherey-Nagel74,09,52,250
PBSGibco14190-094
PolybreneMerckTR-1003-6
PrimersThermoFisher
Propidio IodioSigmaP4864
PspXINew England BiolabsR0656S
PuromicinaGibcoA11138-03
Fluorometro Qubit 3.0InvitrogenQ33216
Test del DNA Qubit HSInvitrogenQ32851
Assemblaggio di elaborazione a pozzo sterile R-50x3MaxCyteLM243882
T Cell TransAct umanoMiltenyi130-111-160Reagente di stimolazione delle cellule T
Stazione a nastro HSD1000Agilent5067-5585
TEXMACSMiltenyi130-097-196Mezzo di crescita per cellule T
Tris Buffer, 1,0 M, pH 8,0, grado di biologia molecolareEMD Milipore648314
Acqua, per biologia molecolare, senza DNAsi, RNAsi e proteasiThermoScientific327390010

Riferimenti

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