Presentiamo un protocollo per integrare la randomizzazione mendeliana multiomica, la trascritomica a singola cellula e lo screening in silico basato sulla struttura, al fine di delineare sistematicamente l'asse Drebrin Like (DBNL)-macrofago nell'insufficienza cardiaca. Suggeriamo DBNL come bersaglio immunometabolico farmacologico.
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Articolo di ricerca
Meccanismi molecolari della DBNL nell'insufficienza cardiaca: dall'immunometabolismo dei macrofagi alle implicazioni terapeutiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'insufficienza cardiaca (IC) rimane una grande sfida sanitaria globale, con trattamenti efficaci limitati che mirano ai suoi meccanismi fisiopatologici fondamentali. In questo studio, è stato utilizzato un approccio multiomico integrato che combina randomizzazione mendeliana (MR) e sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) per identificare potenziali biomarcatori e bersagli terapeutici per l'IC. Abbiamo utilizzato dati provenienti da studi di associazione genomica a livello genomico (GWASs), loci di tratti quantitativi di espressione (eQTLs), loci di tratti quantitativi di metilazione (mQTL) e loci di tratti quantitativi proteici (pQTLs) per indagare i meccanismi genetici dell'HF. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è stato eseguito per analizzare l'espressione genica nei macrofagi cardiaci, e l'analisi pseudo-temporale è stata utilizzata per studiare la regolazione dinamica della DBNL durante la differenziazione dei macrofagi. Simulazioni di attracco molecolare e dinamica hanno identificato l'acido pirininicico (WY-14643; PubChem CID: 4594; sinonimi: 50892-23-4; WY-14643) come potenziale regolatore di DBNL. L'analisi multiomica ha rivelato che il DBNL (simile al Drebrin) è un gene chiave associato al rischio di HF. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha rivelato che la DBNL è espressa principalmente nei macrofagi cardiaci ed è sovraregolata in condizioni patologiche. L'espressione di DBNL da parte dei macrofagi è associata al metabolismo immunitario e alle vie profibrotiche, in particolare le vie di segnalazione IL-6/JAK/STAT3, PI3K/AKT/mTOR e TGF-β. L'analisi del pseudotempo ha indicato che DBNL ha un effetto regolatorio dinamico sulla differenziazione dei macrofagi, specialmente nell'infiammazione cronica. L'aggancio molecolare e le simulazioni dinamiche hanno dimostrato che l'acido piridinico ha un ruolo potenziale nella regolazione del DBNL. Questo studio chiarisce il ruolo della DBNL nella progressione dell'insufficienza cardiaca e ne suggerisce il potenziale come bersaglio terapeutico. È importante sottolineare che la rilevanza terapeutica viene dedotta dalle previsioni computazionali. Questi risultati offrono nuove intuizioni sul metabolismo immunitario e sulla comunicazione intercellulare mediata dai macrofagi, stabilendo una base teorica per future applicazioni nell'ottimizzazione di farmaci mirati al DBNL e nella ricerca funzionale. Tuttavia, sono necessarie ulteriori validazioni sperimentali e studi preclinici per dimostrare l'efficacia clinica del DBNL come bersaglio terapeutico.
Introduzione
L'insufficienza cardiaca (IC) rappresenta una sfida sanitaria globale significativa e in crescita che colpisce milioni di persone in tutto il mondo e impone notevole pressione economica sui sistemisanitari 1. Di conseguenza, è urgente la necessità di interventi efficaci nella gestione dell'insufficienza cardiaca (IC).
La complessa fisiopatologia dell'insufficienza cardiaca ha origine da una contrattilità miocardica compromessa del ventricolo sinistro, che porta a una cascata di complicazioni sistemiche, come la congestione polmonare eperiferica 2. Tuttavia, affrontare direttamente i meccanismi fisiopatologici fondamentali che stanno alla base della progressione dell'insufficienza cardiaca, in particolare la rimodellazione miocardica avversa, rimane una sfida critica einesatta. Negli ultimi decenni, il campo della ricerca biomedica ha subito un sostanziale cambiamento di paradigma, facilitato principalmente dall'incorporazione di tecnologie multiomiche e metodologie avanzate di bioinformatica. Questi strumenti offrono opportunità eccezionali per identificare nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici per la malattia. La randomizzazione mendeliana (MR), un rigoroso approccio epidemiologico genetico, utilizza polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) come variabili strumentali per dedurre relazioni causali tra esposizioni genetiche ed esiticlinici 4. Adottando il quadro metodologico degli studi controllati randomizzati, la randomizzazione mendeliana (MR) affronta efficacemente i problemi di confondimento e causalità inversa fornendo prove solide per l'identificazione e il riutilizzo dei target farmacologici. Parallelamente, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) rivela l'eterogeneità tissutale con una risoluzione senza pari, offrendo profonde intuizioni sull'espressione genica specifica per tipo cellulare e sulle reti di comunicazione intercellulare all'interno di organi intricati come ilcuore 5. L'approccio multiomico, che sintetizza dati genetici, trascrittomici e proteomici, offre un potenziale sostanziale per chiarire i meccanismi delle malattie e identificare vie terapeutiche.
Nonostante questi progressi tecnologici, persistono significative lacune di conoscenza riguardo ai meccanismi cellulari e molecolari specifici che guidano l'infiammazione cardiaca e il rimodellamento nell'insufficienza cardiaca. Le evidenze accumulate suggeriscono che le cellule immunitarie, in particolare i macrofagi, sono fondamentali per orchestrare risposte infiammatorie e il successivo rimodellamento dei tessuti durante i processi di lesione miocardica e insufficienza cardiaca cronica, che a loro volta sono fondamentali per la progressione dellamalattia 6. Le ricerche precedenti si sono concentrate prevalentemente su mediatori infiammatori ampi o marcatori della superficie cellulare, creando una significativa lacuna nell'esplorazione di bersagli regolatori intracellulari all'interno di queste popolazioni immunitarie cruciali. Inoltre, sebbene gli studi tradizionali di associazione genomica a livello genomico (GWAS) abbiano identificato numerose associazioni genetiche legate all'insufficienza cardiaca, spesso incontrano difficoltà nell'stabilire relazioni causali definitive, limitandone così l'applicabilità per la traduzione terapeuticadiretta 7. Di conseguenza, l'implementazione di un quadro completo di randomizzazione mendeliana multiomica (MR), che incorpora varianti genetiche che influenzano la metilazione del DNA (mQTLs), l'espressione genica (eQTLs) e l'abbondanza proteica (pQTLs), è essenziale per ottenere inferenze causali più robuste attraverso molteplici strati regolatori biologici. Questo approccio affronta le limitazioni intrinseche associate agli studi QTL a livello singolo. In particolare, la proteina simile alla drebrin (DBNL) è stata oggetto di ampie ricerche nel contesto dello sviluppo neuronale e della dinamicacitoscheletrica 8; tuttavia, il suo significato funzionale e il potenziale terapeutico nelle malattie cardiovascolari, in particolare l'insufficienza cardiaca, rimangono in gran parte inesplorati. Questa significativa lacuna nella nostra comprensione ostacola la considerazione del DBNL come un bersaglio nuovo e potenzialmente vitale per lo sviluppo di farmaci nel trattamento dell'insufficienza cardiaca.
Per colmare queste lacune critiche di conoscenza, questo studio mira a identificare in modo robusto i geni chiave causalmente associati al rischio di insufficienza cardiaca attraverso un quadro integrato multiomica di risonanza magnetica che combina dati eQTL, mQTL e pQTL. Questo studio presenta un approccio innovativo che coinvolge l'integrazione di analisi multiomiche di randomizzazione mendeliana — inclusi i loci di tratti quantitativi di espressione (eQTLs), i loci quantitativi di tratti di metilazione (mQTLs) e i loci quantitativi di tratti proteici (pQTLs) — con dati trascritomici monocellulari ad alta risoluzione (GSE161470) e dati trascrittomici in massa (GSE161472) per identificare sistematicamente il gene DBNL come fattore di rischio causale critico per l'insufficienza cardiaca. Questi risultati dimostrano che il DBNL è espresso prevalentemente e specificamente nei macrofagi cardiaci e che la sua espressione cambia dinamicamente durante il loro processo di differenziazione. Inoltre, i risultati di questo studio chiariscono il ruolo fondamentale della DBNL nel modulare il microambiente immunitario cardiaco e nell'orchestrare le vie immunometaboliche associate all'insufficienza cardiaca, come la cascata di segnalazione IL-6/JAK/STAT3, così come le vie di segnalazione profibrotica. Inoltre, impiegando tecniche di biologia computazionale, questa ricerca prevede che l'acido piriditile (WY-14643) sia un ligando ad alta affinità per DBNL, fornendo così un quadro teorico completo e multidimensionale che supporta la designazione di DBNL come nuovo bersaglio terapeutico per l'insufficienza cardiaca e facilita lo sviluppo di interventi farmacologici mirati. Utilizzando il sequenziamento a RNA a singola cellula, abbiamo caratterizzato l'espressione cellulare specifica e le vie funzionali del gene chiave DBNL identificato nel microambiente cardiaco, e abbiamo indagato il ruolo della DBNL nelle vie di segnalazione immunometabolica e profibrotica, nonché nella comunicazione cellula-cellula tra tipi cellulari cardiaci. Potenziali liganti di piccole molecole per DBNL sono stati identificati tramite agganciamento molecolare computazionale e simulazioni di dinamica molecolare. Ipotizziamo che la DBNL, espressa principalmente nei macrofagi cardiaci, eserciti un effetto causale sulla progressione dell'insufficienza cardiaca regolando le vie immunometaboliche e la diafonia intercellulare. In sintesi, integrando la randomizzazione mendeliana multiomica avanzata con l'analisi a cellula singola ad alta risoluzione, abbiamo identificato e caratterizzato sistematicamente nuovi bersagli terapeutici per l'insufficienza cardiaca ed esplorato potenziali bersagli modulatori a piccole molecole.
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Protocollo
Download dati
Dati di espressione genica
I dati di sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq) utilizzati nel presente studio sono stati provenienti dal repository Gene Expression Omnibus (GEO) gestito dal National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), specificamente dal dataset con numero di accesso9 GSE161470 (tessuto cardiaco umano composto da quattro campioni di controllo e uno patologico). Questo dataset è stato originariamente pubblicato da Zhang et al. nel 202210. L'obiettivo principale dell'indagine originale era esaminare l'eterogeneità cellulare e i meccanismi regolatori molecolari nel tessuto cardiaco umano in condizioni di insufficienza cardiaca. Per l'analisi attuale, sono stati selezionati cinque campioni da questo dataset, ciascuno composto da profili di espressione singola completi derivati dal tessuto cardiaco umano. Anche l'altro dataset utilizzato in questo studio è stato ottenuto dal repository pubblico NCBI GEO, in particolare dal File della Matrice Serie corrispondente al numero di accessione GSE161472, accompagnato dal file di annotazione GPL11154. Il profilo espressivo comprende un totale di 84 campioni, inclusi 37 campioni di controllo e 47 campioni di malattia. Questa ricerca comprende un'analisi multiomica integrativa, con tutte le indagini condotte utilizzando dati accessibili al pubblico.
Dati eQTL
I dati eQTL, ottenuti dal consorzio eQTLGen, si concentrano sull'elucidazione del quadro genetico dell'espressione genica nel sangue e sui fattori genetici che influenzano i tratti complessi3. Il consorzio è attualmente impegnato nella seconda fase del suo ampio progetto, che conduce meta-analisi di dati genomici a livello genomico relativi all'espressione genica nel sangue.
Dati di esposizione - mQTLs
I dati mQTL sono stati ottenuti da una meta-analisi pubblicata della coorte europea (EUR), che esamina la metilazione del DNA nel sangue intero all'interno del quadro genetico di 3.701 campioni provenienti da popolazioni di ascendenza europea11. Il dataset includeva informazioni su 426.636 tratti mQTL.
Dati di esposizione-pQTL
I dati pQTL del plasma sono stati acquisiti dal database deCODE (https://www.decode.com/summarydata/)4. Questo studio ha utilizzato il rilascio dei dati del 2021 del dataset deCODE pQTL, che comprende uno studio di associazione genomica a livello genomico (GWAS) dei livelli di proteine plasmatiche misurati utilizzando 4.907 aptameri in una coorte di 35.559 individui di origine europea.
Dati di esito
Le statistiche riassuntive sull'insufficienza cardiaca sono state ottenute da uno studio di associazione genomica su larga scala (GWAS) che coinvolgeva principalmente partecipanti di ascendenza europea, accessibile tramite il database dell'European Bioinformatics Institute (EBI) (GCST90162626). Il dataset sull'insufficienza cardiaca includeva 115.150 casi e 1.550.331 controlli. Il Catalogo GWAS, che comprende pubblicazioni, associazioni di riferimento e statistiche riassuntive dettagliate, offre attualmente dati mappati al Genome Assembly e alla build dbSNP.
Analisi di randomizzazione mendeliana di mQTLs, eQTLs e pQTLs
Per indagare sistematicamente le potenziali relazioni causali tra espressione genica, abbondanza proteica, livelli di metilazione del DNA e rischio di insufficienza cardiaca, sono state effettuate analisi di randomizzazione mendeliana (MR) utilizzando i loci di testo quantitativo di espressione (eQTLs), loci quantitativi di tratti proteici (pQTLs) e loci di metilazione dei tratti quantitativi (mQTLs). Durante la fase di pre-elaborazione dei dati di esposizione, polimorfismi a nucleotide singolo (SNP) associati a ciascuna variabile di esposizione (gene, proteina o sito di metilazione) sono stati estratti dai rispettivi database con una soglia di significanza genomica di P < 1 × 10⁻⁵ per fungere da variabili strumentali (IV) candidati iniziali. Successivamente, è stato condotto un aggregamento di disequilibrio di collegamento (LD) per i IV di ogni fattore di esposizione utilizzando una finestra di 10.000 kilobasi (kb) e una soglia LD R² di 0,001 per garantire l'indipendenza tra gli strumenti. Questi IV selezionati sono stati poi armonizzati con statistiche riassuntive di uno studio di associazione genomica a livello di insufficienza cardiaca (GWAS; ID: GCST90162626) impiegando la funzione read_outcome_data, mantenendo solo quegli SNP che mostrano un valore di associazione P inferiore a 5×10⁻⁵ nel dataset di risultati. Per mitigare il debole bias degli strumenti, la statistica F per ogni IV è stata calcolata come F = (β_exposure/SE_exposure)², e solo gli strumenti con F > 10 sono stati inclusi nelle analisi successive. Per la stima dell'effetto causale, l'allineamento alletico tra i dataset di esposizione e di esame è stato eseguito utilizzando la funzione harmonize_data del pacchetto TwoSampleMR. Le analisi RM sono state quindi condotte utilizzando quattro approcci statistici complementari: (1) il metodo ponderato per varianza inversa (IVW), che fornisce meta-analisi delle stime del rapporto di Wald tra SNP; (2) regressione MR-Egger, che tiene conto della pleiotropia direzionale incorporando un termine intercettazione sotto l'assunzione Instrument Strength Independent of Direct Effect (InSIDE); (3) il metodo della mediana ponderata, che fornisce stime causali coerenti anche se fino al 50% degli strumenti sono invalidi; e (4) il metodo del modo ponderato, che identifica il cluster di stima degli effetti causali più frequente, offrendo un potenziale statistico aumentato e un errore di tipo I ridotto rispetto a MR-Egger. Nei casi in cui era disponibile una sola variabile strumentale, veniva applicato esclusivamente il metodo del rapporto di Wald. Per valutare la robustezza dei risultati, sono state effettuate analisi di sensibilità complete, inclusi test di eterogeneità tramite la funzione mr_heterogeneity, valutazione della pleiotropia tramite mr_pleiotropy_test e analisi leave-one-out implementate tramite la funzione mr_leaveoneout, che esclude iterativamente ogni SNP per determinare l'influenza delle singole varianti sui risultati complessivi. Associazioni significative sono state visualizzate utilizzando strumenti grafici come mr_scatter_plot e mr_forest_plot. Questa pipeline analitica è stata applicata uniformemente tra i dataset eQTL, pQTL e mQTL per mantenere la coerenza metodologica durante tutto lo studio.
Analisi di colocalizzazione
È stata condotta un'analisi di colocalizzazione tramite il metodo Coloc, dati riassuntivi eQTL e un GWAS dell'insufficienzacardiaca 5. Il polimorfismo a singolo nucleotide indice (SNP) è stato utilizzato per calcolare la probabilità posteriore entro una finestra di aggregazione di 100 kb. Nell'analisi di colocalizzazione (coloc), l'Ipotesi H3 indica la probabilità posteriore che i due tratti, ovvero espressione genica e insufficienza cardiaca, siano correlati ma possiedano varianti causali distinte. Viceversa, l'Ipotesi H4 indica la probabilità a posteriori che l'associazione tra i due tratti sia attribuibile a una singola variante causale condivisa. Una soglia di SNP. PP. È stato utilizzato un H4 superiore a 0,90 per determinare la colocalizzazione.
Infiltrazione immunitaria
Il metodo CIBERSORT è una tecnica ampiamente adottata per valutare i tipi di cellule immunitarie all'interno del microambiente12. Utilizzando i principi di regressione dei vettori di supporto, è possibile eseguire un'analisi di deconvoluzione della matrice di espressione dei sottotipi di cellule immunitari. Incorporando 547 biomarcatori, CIBERSORT può differenziare 22 fenotipi delle cellule immunitarie umane, inclusi cellule T, cellule B, plasmocellule e varie sottopopolazioni di cellule mieloidi. Utilizzando il dataset GSE161472, è stata condotta un'analisi che impiega l'algoritmo CIBERSORT in combinazione con la sua matrice integrata LM22, che caratterizza i profili di espressione genica di 22 distinti tipi di cellule immunitarie umane. I livelli di infiltrazione di queste 22 popolazioni di cellule immunitarie sono stati quantificati per ciascun singolo campione. Successivamente, la funzione cor.test è stata applicata per valutare le correlazioni tra l'espressione dei geni chiave e i corrispondenti livelli di infiltrazione delle cellule immunitari.
Elaborazione dei dati per sequenziamento RNA a singola cellula e controllo qualità
I dati del profilo di espressione a singola cella venivano elaborati utilizzando il package Seurat (V4.3.0) nell'ambiente R (V4.3.0) 6. Questo studio ha utilizzato un flusso di lavoro convenzionale per l'analisi dei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Inizialmente, i profili di espressione venivano importati utilizzando il pacchetto Seurat. Le cellule sono state filtrate sulla base di diverse metriche di qualità, tra cui il conteggio totale di UMI di ciascuna cellula, il numero di geni espressi, la proporzione di letture mitocondriali e la proporzione di letture ribosomiali. Gli outlier sono stati identificati come valori che si discostano dalla mediana di oltre tre deviazioni assolute mediane (MAD). Le soglie specifiche di filtraggio applicate erano le seguenti: nFeature_RNA ≥ 200, percent.mt ≤ 2,15718, nFeature_RNA ≤ 2840,941 e nCount_RNA ≤ 5194,27. Tipicamente, le cellule con conteggi totali di UMI eccessivamente elevati e un numero di geni espressi venivano classificate come doppietti, mentre le cellule con percentuali elevate di letture mitocondriali o ribosomiche erano considerate di bassa qualità, potenzialmente sottoposte ad apoptosi o frammentazione. Seguendo questi passaggi di filtraggio, DoubletFinder (versione 2.0.4) è stato utilizzato per identificare e rimuovere i doppietti da ogni campione individualmente, completando il processo di controllo qualità della cella. Inizialmente, la normalizzazione dei dati veniva effettuata utilizzando la funzione normalizeData. Lo stato del ciclo cellulare è stato successivamente valutato tramite la funzione CellCycleScoring e sono stati identificati geni altamente variabili tramite il metodo FindVariableFeatures. Il dataset è stato poi scalato utilizzando ScaleData per standardizzare i dati e mitigare l'influenza dei geni mitocondriali, dei geni ribosomici e degli effetti del ciclo cellulare sulle analisi a valle. La riduzione lineare della dimensionalità è stata effettuata utilizzando l'analisi delle componenti principali (PCA) tramite la funzione RunPCA, con componenti principali significativi selezionati per ulteriori analisi. Per affrontare gli effetti batch tra diversi campioni, è stato utilizzato l'algoritmo Harmony (versione 1.1.0). Questo approccio raggruppa iterativamente celle simili da lotti distinti all'interno dello spazio PCA mantenendo la diversità dei lotti all'interno dei cluster. Dato il relativo lieve effetto batch osservato nel dataset, sono stati applicati parametri predefiniti (θ = 2). La riduzione della dimensionalità non lineare è stata successivamente effettuata utilizzando RunUMAP, seguita dalla costruzione di un grafo di vicini di celle tramite FindNeighbors e dal clustering delle celle tramite FindClusters. Per l'annotazione dei tipi cellulari, è stato implementato un framework di annotazione gerarchica: l'annotazione manuale primaria si basava su modelli caratteristici di espressione genica informati dal database CellMarker e dalla letteratura pertinente; questo era integrato dai risultati delle annotazioni automatiche ottenuti dal software SingleR come riferimento. Per aumentare ulteriormente l'accuratezza e la completezza dell'identificazione dei tipi cellulari, sono stati consultati molteplici database autorevoli, tra cui l'Human Primary Cell Atlas (HPCA), BlueprintEncode, MonacoImmune, DatabaseImmuneCell e NovershternHaematopoietic. L'annotazione delle celle veniva effettuata interrogando il database CellMarker (http://117.50.127.228/CellMarker/CellMarkerBrowse.jsp) e rivedendo la letteratura, aiutata dal supporto automatico dell'annotazione fornito dal software SingleR (V2.4.0) 13. L'obiettivo è identificare i tipi cellulari presenti nel tessuto corrispondente e i loro associati genimarcatori 14.
Analisi delle interazioni ligando-recettore
In questo studio, CellCall (versione 1.0.7) è stata utilizzata per eseguire un'analisi completa delle reti di comunicazioneintercellulare 15. Utilizzando annotazioni di tipo cellulare derivate da Seurat insieme alla matrice grezza, è stato costruito un oggetto di analisi normalizzato con parametri configurati per il genoma umano. La funzione TransCommuProfile è stata applicata per quantificare la forza delle interazioni cellula-cellula tramite un algoritmo ponderato, implementando una soglia di significatività di un valore p < 0,05 per identificare coppie ligando-recettore affidabili. Le coppie di interazione significative sono state successivamente sottoposte ad analisi di arricchimento delle vie KEGG tramite la funzione getHyperPathway, e le relazioni tra tipi cellulari e vie sono state illustrate utilizzando grafici a bolle. La rete di comunicazione complessiva fu infine visualizzata tramite un grafico circolare, in cui otto colori distinti indicavano diversi tipi di cellule. La forza dell'interazione e la direzionalità erano rappresentate da caratteristiche a frecca, fornendo una caratterizzazione dettagliata della dinamica della segnalazione intercellulare.
Analisi del pseudotempo
Per indagare la regolazione trascrizionale dinamica dei macrofagi durante la progressione dell'insufficienza cardiaca, questo studio ha utilizzato l'algoritmo Monocle per condurre un'analisi pseudotemporale sulle sottopopolazioni di macrofagi. La matrice di espressione genica corrispondente alle sottopopolazioni cellulari target è stata estratta per costruire oggetti di analisi della traiettoria a singola cellula, con geni altamente variabili selezionati come caratteristiche di ordinamento. Utilizzando la tecnica di riduzione della dimensionalità DDRTree, le cellule sono state mappate su uno spazio bidimensionale per ricostruire la traiettoria di differenziazione. Sono state effettuate analisi di visualizzazione per determinare la distribuzione delle cellule lungo l'asse del pseudotempo e per identificare geni la cui espressione è cambiata significativamente nel corso dello pseudotempo. Le analisi successive si sono concentrate sul gene chiave DBNL e hanno caratterizzato la sua dinamica di espressione lungo la traiettoria cellulare, elucidando i meccanismi di riprogrammazione trascrizionale dei macrofagi durante la progressione dell'insufficienzacardiaca 16.
Analisi dell'arricchimento degli insiemi genici (GSEA)
In questo studio, è stato utilizzato un approccio GSEA per chiarire i meccanismi regolatori associati ai geni chiave coinvolti nell'insufficienza cardiaca. Utilizzando geni chiave già identificati, i campioni sono stati stratificati in coorti ad alta e bassa espressione sulla base del valore mediano di espressione. L'analisi differenziale dell'espressione è stata condotta utilizzando il pacchetto limma, generando una lista genica classificata secondo log fold change (logFC). L'analisi successiva di arricchimento delle vie KEGG è stata eseguita utilizzando lo strumento clusterProster, con set genici provenienti dal database MsigDB che fungevano da base di riferimento. L'algoritmo GSEA è stato poi applicato per identificare vie di segnalazione significativamente arricchite tra i due gruppi di espressione, e per determinare la significatività statistica è stata utilizzata una soglia di valore p aggiustata inferiore a 0,05. Per illustrare le funzioni regolatorie dei geni centrali all'interno dei percorsi critici, sono state utilizzate varie tecniche di visualizzazione, tra cui grafici GSEA multipercorso e diagrammi di reti circolari.
Analisi della variazione dei set genici (GSVA)
GSVA è un approccio non parametrico e non supervisionato utilizzato per valutare l'arricchimento dei set genici all'interno dei dati trasscrittomici. Questo metodo trasforma variazioni a livello genico in variazioni a livello di percorso calcolando punteggi compositi per set genetici specifici, facilitando la valutazione dei cambiamenti funzionali biologici su vari campioni. Nel presente studio, i set genici sono stati ricavati dal Molecular Signatures Database. L'algoritmo GSVA è stato impiegato per calcolare punteggi compositi per ciascun insieme genico, consentendo la valutazione di potenziali alterazioni funzionali biologiche su diversi campioni. I risultati dell'analisi di arricchimento GSVA sono forniti nel materiale supplementare (Tabella Supplementare 1).
Previsione dei farmaci CTD
Il gene target (DBNL) è stato inserito nel campo di ricerca del Comparative Toxicogenomics Database (CTD), è stata selezionata la categoria di malattia "cardiopatia" e la query è stata eseguita per recuperare i dati di previsione dei farmaci associati alla condizione "insufficienza cardiaca". I risultati di previsione ottenuti sono stati successivamente importati nel software Cytoscape per facilitare la visualizzazione dei dati e permettere la costruzione di una mappa di rete di interazione genico-chimica.
Metodi di aggancio molecolare
A causa della struttura cristallina tridimensionale non risolta della proteina DBNL umana (UniProt ID: Q9UJU6), questo studio ha previsto la struttura tridimensionale della DBNL sulla base di AlphaFold317. L'acido pirinixico (WY-14643) è disponibile per il download dal database PubChem (PubChem CID: 5694). Successivamente, la struttura proteica è stata pre-processata utilizzando il software MGLTools (versione 1.5.7)18, includendo passaggi come l'aggiunta di atomi di idrogeno. Contemporaneamente, proteine e piccole molecole venivano convertite nel formato PDBQT richiesto per l'aggancio. Il software AutoDock Vina (versione 1.1.2)19 è stato utilizzato per il collegamento molecolare globale (esogenicità=16, num_modes=30) per esplorare possibili modalità di legame. Al completamento dei calcoli di attracco, la conformazione complessa con la maggiore affinità, indicata dall'energia libera di legame più bassa, dovrebbe essere selezionata come struttura iniziale per le successive simulazioni di dinamica molecolare.
Metodo di simulazione della dinamica molecolare
Per indagare sistematicamente la stabilità del legame e i meccanismi di interazione tra composti candidati e proteine, sono state condotte simulazioni convenzionali di dinamica molecolare (MD) utilizzando il pacchetto software GROMACS (versione 2024.03)20. I parametri proteici sono stati generati utilizzando il campo di forza Amber14SB21, il modello della molecola d'acqua è stato generato utilizzando il modelloTIP3P 22, e i parametri della topologia del ligando sono stati generati utilizzando lo strumento Antechamber Python Parser Interface (ACPYPE), basato sul General Amber Force Field (GAFF). Il sistema complesso ligando-proteina si è poi situato all'interno di una scatola ottaedrica di confine periodica piena di molecole d'acqua TIP3P. Sono stati introdotti ioni sodio (Na⁺) e cloruro (Cl⁻) per raggiungere una concentrazione di 0,15 mol/L e neutralizzare la carica complessiva del sistema. Al completamento della costruzione del sistema, il primo passo prevedeva la minimizzazione dell'energia utilizzando il metodo di discesa più ripida per 50.000 gradini, con l'obiettivo di eliminare eventuali conformazioni potenzialmente irragionevoli all'interno della struttura. Successivamente furono eseguite due fasi di equilibrio del sistema: una simulazione NVT (numero costante di particelle, volume e temperatura) a 100 ps seguita da una simulazione NPT (numero costante di particelle, pressione e temperatura) a 100 ps. Durante queste simulazioni, sono stati applicati vincoli posizionali agli atomi pesanti della spina dorsale proteica per preservare l'integrità strutturale della proteina. La temperatura veniva mantenuta a 300 K utilizzando il termostato V-rescale, e la pressione veniva regolata a 1 bar impiegando il barotto di Parrinello-Rahman per l'accoppiamento di pressione. Al termine della fase di equilibrio, è stata condotta una simulazione di produzione di 100 nanosecondi, durante la quale vengono eliminati tutti i vincoli posizionali. La traiettoria fu integrata utilizzando un passo temporale di 2 femtosecondi, e il metodo particle-mesh Ewald (PME) fu impiegato per gestire con precisione le interazioni elettrostatiche a lungo raggio. La traiettoria veniva salvata ogni 10 ps, e venivano prodotti in totale 10.000 fotogrammi per analisi successive. Inoltre, traiettorie stabili nell'intervallo 90-100 ns sono state estrate dalla simulazione, e l'energia libera di legame dei complessi proteici di ligando è stata calcolata utilizzando lo strumentoGMPBSA 23.
Analisi statistica
La validità di questa analisi di randomizzazione mendeliana (MR) dipende da tre assunzioni fondamentali. (1) Rilevanza: Le variabili strumentali (IV) devono mostrare una forte associazione con l'esposizione. (2) Indipendenza: I IV devono essere indipendenti da qualsiasi elemento di confusione che influenzi sia l'esposizione che il risultato. (3) Restrizione di esclusione: Le flebo dovrebbero influenzare l'esito esclusivamente attraverso il loro impatto sull'esposizione. Una violazione di questa ipotesi, in cui una flebo influenza l'esito attraverso vie non coinvolgenti l'esposizione, è chiamata pleiotropia orizzontale. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando la versione R 4.3.0, con test bilaterali, e un valore p inferiore a 0,05 è stato generalmente considerato indicativo di significatività statistica.
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Risultati
Identificazione del DBNL come gene associato al rischio di insufficienza cardiaca tramite randomizzazione mendeliana e analisi di colocalizzazione
L'identificatore di esito per i campioni correlati all'insufficienza cardiaca, GCST90162626, è stato acquisito dal dataset statistico sommario. Le relazioni causali tra 1.247 coppie di loci di tratti quantitativi di espressione (eQTLs) e gli esiti sono state determinate utilizzando le funzioni extract_instruments e extract_outcome_data (Tabella Supp...
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Discussione
Sebbene l'infiammazione costituisca un aspetto fondamentale della fisiopatologia dell'insufficienza cardiaca (IC), le indagini precedenti si sono concentrate prevalentemente su mediatori infiammatori generalizzati e marcatori della superficiecellulare 17,18,24. Questa attenzione ha limitato l'elucidazione dei meccanismi cellulari specifici coinvolti. Per superare queste limitazioni, abbiamo util...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.
Ringraziamenti
Questo programma di ricerca è stato sostenuto dalla Fondazione Provinciale di Scienze Naturali di Zhejiang della Cina (LTGY24H020001), dal Progetto di Scienza e Tecnologia sulla Medicina Tradizionale Cinese nella provincia di Zhejiang (2023ZR131, 2023ZL158), dal Progetto Chiave per il Benessere Pubblico di Ningbo (2024S030), dal Programma di Ricerca e Sviluppo Tecnologico Chiave di Ningbo (2022Z149), dal Laboratorio Chiave di Medicina di Precisione per le Malattie Aterosclerotiche della Provincia di Zhejiang (2022E10026). e il Progetto Speciale per la Ricerca Medica Clinica dell'Associazione Medica dello Zhejiang (2021ZYC-A11).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CellMarker Database | Università Medica di Harbin (CellMarker 2.0) | http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/ | CellMarker Database; Per interrogare geni di marcatori di tessuto/tipo cellulare durante l'annotazione a singola cellula |
| Database Tossicogenomica Comparativa (CTD) | CTD (Università di Duke e altri) | http://ctdbase.org/ | Database CTD; Per recuperare interazioni tra sostanze chimiche, geni, fenotipi e malattie, utilizzate per la previsione dei farmaci |
| deCODE Plasma pQTL Dataset (2021, 4.907 aptamer, 35.559 campioni europei) | Genetica deCODE | https://www.decode.com/summarydata/ | Rilascio dei dati pQTL 2021; Utilizzato come dati di esposizione pQTL per l'analisi RM |
| eQTLGen Whole Blood eQTL Data | Consorzio eQTLGen | https://www.eqtlgen.org/ | eQTLGen fase I/II (versione specifica a seconda dell'utilizzo); Utilizzato come dati di esposizione eQTL per analisi di risonanza magnetica e di localizzazione |
| GEO Single-cell RNA-seq Dataset GSE161470 (Tessuto cardiaco umano: 4 campioni di controllo + 1 campione patologico) | NCBI Omnibus sull'Espressione Genica (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161470 | GSE161470; Ottenere dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula del tessuto cardiaco umano per l'analisi a valle |
| Catalogo GWAS | NHGRI– EBI | https://www.ebi.ac.uk/gwas/ | Catalogo GWAS; Recuperare informazioni, annotazioni e analisi ausiliarie GWAS relative all'HF |
| Statistiche riassuntive GWAS sull'insufficienza cardiaca (GCST90162626) | NHGRI– Catalogo EBI GWAS | https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90162626 | Ammissione agli studi: GCST90162626; Utilizzato come dati di esame per l'analisi della risonanza magnetica e della colocalizzazione |
| Database delle Firme Molecolari (MSigDB) v7.0 | Broad Institute | https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb | MSigDB v7.0; Per insiemi geni di background GSEA / GSVA e annotazioni di percorso |
| Acido pirinicistico (WY-14643) Dati strutturali (PubChem) | NCBI PubChem | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5694 | PubChem CID: 5694; Utilizzato per ottenere la struttura 3D dei ligandi per l'aggancio molecolare e la simulazione dinamica |
| Database delle proteine UniProt (DBNL, UniProt ID: Q9UJU6) | Consorzio UniProt | https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UJU6 | UniProt: Q9UJU6; Utilizzato per ottenere la sequenza amminoacidica di DBNL per la previsione della struttura e l'attracco |
| Meta-analisi mQTL del sangue intero (Ref 11, 3.701 campioni europei, 426.636 tratti mQTL) | Autori / Consorzio (secondo la tua referenza 11) | Autore in attesa per aggiungere URL originale del database / DOI | Reference DOI o ID del dataset; Utilizzato come dati di esposizione mQTL per l'analisi RM |
Riferimenti
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