Effetti antinfiammatori delle lattone sesquiterpeniche da Eupatorium lindleyanum DC. in Rodent Models

Sommario

Questo studio dimostra che i sesquiterpeni lattoni provenienti da Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) esercitano effetti antinfiammatori significativi nei modelli di edema dell'orecchio del topo indotto da xilene e nell'edema delle zampe di ratto indotto dalla carragenina, alleviando i danni istopatologici, riducendo il rilascio di citochine e inibindo l'attivazione della segnalazione di NF-κB.

Abstract

L'infiammazione acuta è un processo patologico fondamentale coinvolto in molte malattie immunitarie. Eupatorium lindleyanum La DC., una base medicinale tradizionale, è ricca di lattoni sesquiterpeni (SLEL), che sono stati segnalati come presenti di attività farmacologica; tuttavia, i loro effetti antinfiammatori e i cambiamenti molecolari associati rimangono incompletamente caratterizzati. In questo studio, risposte infiammatorie acute sono state indotte in un modello di edema dell'orecchio del topo indotto dal xilene e in un modello di edema delle zampe di ratto indotto dal carragenenano. Il danno tissutale e l'infiltrazione infiammatoria sono stati valutati tramite colorazione di ematossilina ed eosina. I livelli di citochine proinfiammatorie (TNF-α, IL-6 e IL-1β) sono stati quantificati nel siero da ELISA e la loro espressione trascrizionale nei tessuti infiammati è stata analizzata tramite PCR quantitativa (qPCR). Le modifiche nelle proteine associate alla via NF-κB, inclusi IκBα fosforilata e p65, sono state valutate tramite western blotting. Il trattamento SLEL ha ridotto l'edema di orecchio e zampa e ha alleviato le caratteristiche istopatologiche dell'infiammazione acuta, inclusi edema tissutale, infiltrazione delle cellule infiammatorie e congestione vascolare. Parallelamente, la somministrazione di SLEL è stata associata a una diminuzione dei livelli sierici e dell'espressione di mRNA tissutale di Tnf-α, Il-6 e Il-1β. L'analisi del Western blot ha dimostrato una riduzione della fosforilazione di IκBα e p65 nei tessuti infiammati dopo il trattamento SLEL, indicando la modulazione degli eventi di segnalazione correlati a NF-κB. Insieme, questi risultati dimostrano un flusso di lavoro sperimentale per valutare l'attività antinfiammatoria della SLEL nei modelli di infiammazione acuta e suggeriscono che i suoi effetti siano associati a una riduzione dell'espressione di citochine pro-infiammatorie e a una segnalazione alterata della via NF-κB.

Introduzione

L'infiammazione è una risposta difensiva complessa innescata da invasioni patogene o lesioni tissutali e svolge un ruolo fondamentale nel limitare le infezioni, eliminare stimoli nocivi e promuovere la riparazione dei^tessuti. Sebbene le risposte infiammatorie controllate siano essenziali per mantenere l'omeostasi tissutale, un'infiammazione eccessiva o persistente può portare a danni ai tessuti, disfunzioni degli organi e alla progressione di malattie croniche. Clinicamente, l'infiammazione è caratterizzata da arrossamento, gonfiore, calore e dolore e, nei casi gravi, può causare risposte patologiche sistemiche. Ogni numero di evidenze hanno collegato l'infiammazione disregolata allo sviluppo di cancro, malattie cardiovascolari e disturbi^{autoimmuni 2}˒³.

I farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) sono attualmente gli agenti più utilizzati per la gestione dell'infiammazione. Nonostante la loro efficacia nel sollievo dei sintomi, l'uso prolungato di FANS è frequentemente associato ad effetti avversi, tra cui irritazione gastrointestinale, reazioni di ipersensibilità ed^{epatotossicità 4}, che ne limitano l'applicabilità clinica. Di conseguenza, cresce l'interesse nell'identificare agenti antinfiammatori alternativi con profili di sicurezza migliorati. I prodotti naturali, comprese le medicine tradizionali a base di erbe, sono stati esplorati come potenziali fonti di composti bioattivi con proprietà immunomodulatrici. Tuttavia, affermazioni generalizzate riguardanti la bassa tossicità o le funzioni regolatorie sistemiche devono essere interpretate con cautela e richiedono una validazione sperimentale nei modelli di malattia^{definiti 5}.

Eupatorium lindleyanum DC. è una pianta medicinale tradizionale i cui fitochimici caratteristici includono lattoni sesquiterpeni, principalmente composti di tipo guaianolide ed eudesmanolide, insieme a germacranoli e^{xantanolidi 6}. Estratti di Eupatorium lindleyanum DC. sono state segnalate attività abbassanti dei lipidi, anti-aterosclerotiche, antitumorali e antinfiammatorie in vari contesti^{sperimentali 6}. In particolare, estratti di etanolo di Eupatorium lindleyanum DC. hanno mostrato effetti protettivi nei modelli di lesioni polmonari acute indotte da lipopolisaccaridi (^{LPS) 7}. Tuttavia, l'attività antinfiammatoria della SLEL e i suoi effetti nei modelli classici di infiammazione acuta rimangono insufficientemente caratterizzati.

Per colmare questa lacuna, abbiamo impiegato due modelli complementari di infiammazione acuta: edema dell'orecchio indotto da xilene nei topi, che cattura risposte infiammatorie neurogeniche e vascolari rapide, e edema delle zampe indotto dalla carragena nei ratti, un modello ben consolidato che riflette l'infiammazione acuta dipendente dal tempo che coinvolge la produzione di citochine e l'infiltrazione cellulare. Modelli alternativi, come l'infiammazione sistemica indotta da LPS, non sono stati selezionati a causa dell'enfasi sull'attivazione immunitaria sistemica piuttosto che sull'edema tissutale localizzato e della loro limitata idoneità ad analisi istologiche e molecolari a livello di tessuto^{accoppiato 8}.

Utilizzando questa strategia combinata del modello, le risposte infiammatorie sono state valutate tramite misurazioni quantitative dell'edema, valutazione istopatologica tramite colorazione di ematossilina ed eosina (H&E), profilazione delle citochine sieriche, analisi trascrizionale a livello tissutale e cambiamenti proteici associati a NF-κB. Questo protocollo è particolarmente adatto per lo screening dell'attività antinfiammatoria nell'infiammazione acuta, dove la formazione di edema, l'espressione di citochine e le letture molecolari associate alle vie sono di interesse. Tuttavia, i limiti dei modelli acuti devono essere riconosciuti, inclusa l'estrapolazione limitata a condizioni infiammatorie croniche e i confini interpretivi quando si inferisce causalità dai cambiamenti di segnalazione a livello tessutale.

Collettivamente, questo studio mette in evidenza un approccio guidato da protocolli che integra modelli complementari di infiammazione acuta con analisi istologiche e molecolari accoppiate, fornendo un quadro riproducibile per valutare il potenziale antinfiammatorio di composti derivati da erbe.

Protocollo

Il protocollo dello studio sugli animali è stato approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali della Chongqing Medical University (IACUC-CQMU-2025-10073).

Preparazione della frazione arricchita di lattone sesquiterpene (SLEL)

Materiali medicinali essiccati di Eupatorium lindleyanum DC. sono stati polverizzati e sottoposti a estrazione da reflusso 2 volte con etanolo al 70% (v/v) a pressione ridotta. Ogni estrazione è stata effettuata con un rapporto solvente-materiale di 10:1 (v/w) per 2 ore. Gli estratti combinati venivano filtrati, concentrati a pressione ridotta a ≤60 °C e successivamente liofilizzati al vuoto per ottenere la polvere grezza di estratto di etanolo.

L'estratto essiccato è stato completamente disciolto in acqua distillata (concentrazione finale: 100 mg/mL) e sottoposto sequenzialmente a cromatografia in resina poliammidica, seguita da cromatografia macroporosa con resina adsorbitiva D101 per arricchire lattoni sesquiterpeni. Dopo aver raggiunto l'equilibrio di adsorbito, la resina D101 veniva lavata con acqua distillata per rimuovere impurità polari e poi eluita con etanolo anidro. Dopo l'eluzione da etanolo, la frazione raccolta veniva concentrata a pressione ridotta e sottoposta a liofilizzazione per produrre la frazione SLEL, che veniva conservata a −20 °C fino all'utilizzo.

La separazione è stata ottenuta su una piattaforma UPLC che impiega un sistema di fasi binaria mobile di acetonitrile e acido formico allo 0,1% (v/v) in acqua. Il programma di gradiente comprendeva una tenuta isocratica iniziale di 25 minuti a basso contenuto organico, una breve rampa lineare al 70% di acetonitrile, una fase ad alto gradino organico al 90% di acetonitrile e un passo finale di equilibrio per il ritorno alle condizioni iniziali. Il sistema operava a 0,25 mL·min⁻¹ con una temperatura di colonna di 35 °C e un volume di iniezione di 0,1 μL (Figura Supplementare S1).

Animali

In questo studio sono stati utilizzati in totale 36 maschi di ratti Sprague–Dawley (200 ± 20 g) e 36 maschi di topi BALB/c (20 ± 2 g). Gli animali venivano ospitati in condizioni standardizzate (22 ± 2 °C, 55 ± 5% di umidità, 12 ore di ciclo chiaro/oscuro) con libero accesso a cibo e acqua. Gli animali sono stati acclimatati per 7 giorni prima della sperimentazione e monitorati quotidianamente per la salute generale. Tutte le procedure sono state condotte per minimizzare la sofferenza animale e l'anestesia è stata applicata prima della raccolta del sangue e del prelievo dei tessuti.

Edema dell'orecchio indotto da xilene nei topi

Il modello dell'edema dell'orecchio del topo è stato stabilito come descritto^{in precedenza 9}. Dopo l'acclimatazione, i topi sono stati suddivisi casualmente in sei gruppi (n = 6 per gruppo): controllo (CG), modello (MG), desametasone (DEX, 10 mg/kg) e SLEL a bassa dose (75 mg/kg), a dosi medie (150 mg/kg) e gruppi ad alta dose (300 mg/kg). Tutti i trattamenti sono stati somministrati con gavaga orale una volta al giorno per 7 giorni consecutivi (volume di dosaggio finale: 10 mL/kg). A 1,5 ore dall'ultima somministrazione, l'infiammazione è stata indotta applicando 30 μL di xilene in modo uniforme su entrambe le superfici dell'orecchio destro, tranne che nel gruppo di controllo. Trenta minuti dopo, i topi sono stati anestetizzati, sono stati prelevati campioni di sangue e sono stati prelevati punzoni circolari da 8 mm da posizioni anatomiche identiche di entrambe le orecchie.

Edema delle zampe indotto dalla carragenan nei ratti

Il modello dell'edema delle zampe di ratto è stato stabilito utilizzando carragenina, come descritto^{in precedenza 10}. I ratti sono stati assegnati casualmente in sei gruppi (n = 6 per gruppo): CG, MG, DEX (5 mg/kg) e SLEL a bassa dose (50 mg/kg), a dosi medie (100 mg/kg) e ad alta dose (200 mg/kg). I trattamenti sono stati somministrati per via orale una volta al giorno per 7 giorni (10 mL/kg). I volumi di base delle zampe sono stati misurati prima della dose finale. Trenta minuti dopo l'ultima somministrazione, 0,1 mL di soluzione di carragenina al 1% (w/v) sono stati iniettati sottocutaneamente sulla superficie plantare della zampa posteriore destra. I volumi delle zampe sono stati misurati a 1, 2, 3 e 4 ore dopo l'iniezione utilizzando un pletissometro. L'edema delle zampe è stato calcolato come:

Edema delle zampe (%) = (Vt − V0) / V0 × 100%

Esame istologico

I tessuti dell'orecchio e delle zampe sono stati prelevati immediatamente dopo le valutazioni funzionali. I tessuti sono stati fissati in formalina tamponata al 10% di neutro per 72 ore a temperatura ambiente, incorporate nella paraffina, sezionate (5 μm) e colorate con H&E secondo i protocolli^{standard 11}.

Saggio immunoenzimatico legato (ELISA)

I campioni di siero sono stati prelevati tramite centrifugazione a 3.000 × g per 10 minuti a 4 °C. I livelli di TNF-α, IL-6 e IL-1β sono stati quantificati utilizzando kit ELISA disponibili in commercio secondo protocolli standard.

Analisi del western blot

Gli estratti proteici totali sono stati preparati da tessuti di orecchio e zampe utilizzando il tampone di lisi RIPA integrato con inibitori di proteasi e fosfatasi. Le concentrazioni proteiche sono state quantificate tramite un saggio BCA e quantità uguali di proteina (30 μg per campione) sono state risolte tramite SDS-PAGE e trasferite sulle membrane PVDF. Le membrane sono state bloccate con il 5% di latte scremo per 1 ora a temperatura ambiente, seguite da incubazione con anticorpi primari a 4 °C durante la notte e anticorpi secondari coniugati con HRP per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande immunoreattive sono state rilevate tramite chemiluminescenza potenziata e quantificate con il software ImageJ.

PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)

L'RNA totale è stato isolato dai tessuti dell'orecchio e delle zampe utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA elencato nella Tabella dei Materiali. Un microgrammo di RNA totale è stato trascritto inversamente in cDNA utilizzando un kit commerciale di trascrizione inversa secondo le istruzioni del produttore. La PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando la chimica SYBR Green con primer specifici per geni (Tabella 1) in un volume di reazione di 10 μL sotto un protocollo di amplificazione in due fasi. Le condizioni dettagliate di trascrizione inversa e i parametri di ciclo PCR sono forniti nella sezione Protocollo. I livelli relativi dei trascrizioni sono stati calcolati utilizzando il metodo 2^⁻ΔΔCT , con Gapdh usato come gene di riferimento interno.

Dati e analisi statistica

I dati sono espressi come media ± SD. I confronti statistici tra due gruppi sono stati effettuati utilizzando un test t di Student non accoppiato, mentre l'ANOVA unidirezionale è stata applicata per analisi che coinvolgono più di due gruppi. La significatività statistica è stata definita come p < 0,05. La significatività è indicata come # p < 0,05 e ## p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo (CG), e * p < 0,05 e ** p < 0,01 rispetto al gruppo modello (MG).

Risultati

Composizione chimica in SLEL fino a UPLC-Q/TOF/MSn

Il profilo chimico di SLEL è stato esaminato utilizzando UPLC-Q/TOF-MSn in modalità ioniche positive e negative. Nove lattoni sesquiterpeni sono stati identificati come costituenti predominanti (Figura Supplementare S1). Le assegnazioni delle formule molecolari sono state derivate da ioni addotti osservati, inclusi [M+H]⁺ e [M+Na]⁺ in modalità positiva, così come [M−H]⁻ e [M+HCOO]⁻ in modalità negativa (

Discussione

In questo studio, lattoni sesquiterpene da Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) sono stati valutati utilizzando due modelli di infiammazione acuta consolidati, ovvero edema dell'orecchio indotto da xilene nei topi e edema delle zampe indotto dal carragenano nei ratti. Incorporando punteggi istopatologici, misurazioni di citochine sieriche, quantificazione dell'mRNA a livello tissutale e letture di segnalazione a livello proteico, questo protocollo fornisce una caratterizzazione mul...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
anti-GAPDH	ImmunoWay	YN5585
anti Iκ Bα	Tecnologia di segnalazione cellulare	4812
anti P65	Abmart	TA5006
anti-p-Iκ Bα	Tecnologia di segnalazione cellulare	2859
anti-p-P65	Abmart	TP70621
BCA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P10010
IL-1 e beta; Kit	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20537r
Kit IL-6	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20746r
Micropipetta	Eppendorf
Lettore di microplacche	Gene Co., Ltd	Odyssey Fc
PVDF	Millipore	IPVH00010
Kit di trascrizione inversa	MedChemExpress	HY-K051A
Buffer RIPA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0013B
SYBR Green Mastermix	MedChemExpress	HY-K0522
TNF-α Kit	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20039r
TRIZOL	Thermo Fisher Scientific	15596018CN
Congelatore a bassissima temperatura	SANYO