Method Article

Un protocollo di microscopia a localizzazione di molecole singole multimarcatore per l'indagine della cromatina nell'ambiente nucleare denso

DOI:

10.3791/69868

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June 5th, 2026

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1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo di colorazione e analisi per la microscopia di localizzazione a singola molecola della cromatina a tre colori (SMLM) che consente la mappatura riproducibile di eucromatina, eterocromatina e RNAP II per l'analisi spaziale. Questo protocollo consente un'efficiente marcatura multicolore in ambienti nucleari densi, inclusi bersagli associati alla cromatina, consentendo una rilevazione simultanea affidabile.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopia a super-risoluzione ha notevolmente avanzato la nostra capacità di esaminare strutture biologiche oltre il limite di diffrazione, rendendola indispensabile per lo studio di strutture nucleari densamente impacchetate come la cromatina, lamine nucleari e corpi nucleari come i nucleoli. La cromatina presenta un'organizzazione su scala multipla—dai nucleosomi di dimensioni nanometriche ai domini su scala micronica—che richiede approcci di imaging capaci sia di alta risoluzione che di specificità molecolare. La microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM), in particolare la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM), consente una mappatura precisa dei segni epigenetici, offrendo una comprensione fondamentale della struttura e della funzione della cromatina. Tuttavia, l'imaging multi-etichetta nell'ambiente nucleare presenta sfide uniche, tra cui una riduzione dell'accessibilità degli anticorpi, un aumento del legame aspecifico e l'instabilità dei fluorofori. Per affrontare questi problemi, presentiamo un protocollo di immunomarcatura sequenziale ottimizzato per ambienti nucleari ad alta densità, consentendo SMLM robusto a tre colori con diafonia minima e minore degradazione del segnale. Questo metodo include formulazioni tampone ottimizzate, selezione dei fluorofori e strategie di validazione degli anticorpi per garantire un'etichettatura riproducibile e ad alta fedeltà su più bersagli. È importante sottolineare che integriamo questo protocollo con una pipeline di analisi computazionale che sfrutta localizzazioni da un singolo bersaglio molecolare come ancoraggi spaziali (punti inizio) per quantificare distanze inter-bersaglio, densità locali e coaffinità multi-etichetta. Ciò consente un'analisi spaziale dettagliata dei componenti della cromatina su scala nanometrica. Questo protocollo funge da quadro riproducibile per l'imaging multicomponente e l'analisi quantitativa in ambienti subcellulari densi, offrendo uno strumento potente per i ricercatori che studiano architetture nucleari complesse come la cromatina.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'avvento della microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM) ha permesso un'esplorazione senza precedenti di strutture biologiche su scala nanometrica 1,2,3,4,5. Oltre all'imaging a bersaglio singolo, l'estensione alla SMLM multicolore ha ulteriormente fatto avanzare il campo permettendo la visualizzazione simultanea di più specie molecolari, così come le relazioni spaziali e temporali tra strutture di subdiffrazione 6,7,8,9,10,11 . Tuttavia, applicare SMLM multiplexato a modifiche di istoni abbondantemente distribuite rimane una sfida a causa della natura densa e polimerica del DNA nucleare e della limitata accessibilità degli anticorpi in questo ambiente 12,13,14,15,16,17,18.

La cromatina presenta un'organizzazione gerarchica e su scala multipla che si estende su diversi ordini di grandezza, da assemblaggi nucleosomici su scala nanometrica all'architettura nucleare su scala micrometrica. Su scala maggiore, i cromosomi occupano territori cromosomici distinti, all'interno dei quali il genoma viene ulteriormente suddiviso in compartimenti A/B e domini topologicamente associati (TAD) che vincolano interazioni regolatorie a lungo raggio attraverso meccanismi come l'estrusione ad anelli 19,20,21,22. Su scale inferiori a 200 nm, la cromatina è organizzata come un polimero disordinato composto da domini di impacchettamento eterogenei (PD) piuttosto che da blocchi discreti di eucromatina e eterocromatina, con regioni trascrizionalmente attive che si localizzano preferenzialmente ai confini PD 23,24,25,26,27,28,29. Alle scale più piccole (5-20 nm), la cromatina è composta da assemblaggi nucleosomici irregolari e covate nucleosomiche, sottolineando l'assenza di un motivo uniforme di piegamento di ordine superiore e sottolineando la natura emergente e dipendente dalla scala dell'organizzazione genomica 24,26,30. Con il rapido progresso degli approcci basati sul sequenziamento come il sequenziamento da immunoprecipitazione della cromatina e la cattura di conformazione della cromatina ad altorendimento 19,30,31,32,33, sono state identificate varie caratteristiche delle strutture organizzative mesoscale dellacromatina 31,32. Tuttavia, queste tecniche, a differenza dell'imaging, non riescono a catturare una geometria spaziale che viene osservata solo dopo la risoluzione di queste strutture. Metodi di microscopia elettronica come la microscopia elettronica della cromatina (ChromEM24) e la microscopia elettronica a scansione della cromatina (ChromSTEM25) hanno rivelato che la cromatina è eterogenea e organizzata in domini di impacchettamento su scale di lunghezza di 50-200nm 25,28,29. Sebbene queste tecniche permettano una risoluzione impressionante per identificare i domini di impacchettamento della cromatina, non possono fornire una mappatura molecolare specifica come offre SMLM. L'accumulo di punti di DNA per l'imaging in topografia nanoscala (DNA-PAINT22) e l'ibridazione in situ multiplexata con fluorescenza (FISH)19consentono un multiplexing ad alto livello; tuttavia, DNA-PAINT è fortemente influenzato da un rumore di fondo elevato derivante da eventi di legame casuali nell'ambiente nucleare ricco dioligonucleotidi 12,34, mentre i metodi tradizionali FISH basati su denaturazione termica richiedono un ripiegamento nativo della cromatina interrotto. Studi precedenti hanno applicato tecniche di imaging a superrisoluzione per studiare la cromatina a questa scala di lunghezza e hanno identificato una composizione ibrida di domini di impacchettamento, in contrapposizione ai precedenti modelli di separazionedi fase 12,23,34,35. Questo protocollo deriva da un articolo precedentemente pubblicato che discuteva il significato biologico di questirisultati 34. Pertanto, data la sua alta risoluzione e capacità di multiplexing, il dSTORM basato su immunocolorazione rimane la strategia più praticabile per l'imaging della cromatina multicolore in condizioni quasi native.

Questo protocollo non è il primo a dimostrare l'etichettatura di più di due bersagli nucleari, con studi precedenti che hanno etichettato complessi proteici o geniindividuali 12,36. Nonostante il successo nell'etichettatura delle modifiche post-traduzionali degli istoni nucleosomi, la marcatura, l'imaging e l'analisi multicolore della cromatina SMLM presentano sfide significative. Innanzitutto, l'immunocolorazione nell'ambiente denso della cromatina richiede l'ottimizzazione della concentrazione di anticorpi, della sequenza di incubazione e della composizione del tampone per garantire una penetrazione e un legame adeguati senza un eccessivo background. In secondo luogo, è necessaria un'analisi completa di più marcatori, poiché le interazioni tra eucromatina, eterocromatina ed enzimi come la RNA polimerasi tendono a superare le semplici esclusioni binarie. Finora, il numero massimo di colori dimostrati nell'imaging dSTORM con cromatina rimane due 18,37,38,39.

Qui presentiamo un protocollo robusto per l'imaging e l'analisi SMLM della cromatina a tre colori. Il nostro flusso di lavoro di colorazione ottimizza il tempo di incubazione degli anticorpi e utilizza buffer di imagingmigliorati 40per una sessione di imaging prolungata su più marcatori. Descriviamo inoltre pipeline computazionali per l'analisi della distanza a due colori e l'analisi della densità delle giunzioni a tre colori, consentendo la caratterizzazione quantitativa delle relazioni tra eterocromatina, eucromatina e meccanismi di trascrizione. A differenza di precedenti studi SMLM sulla cromatina bicolore che suggerivano una separazione tra eterocromatina ed eucromatina, l'imaging della cromatina a tre colori rivela che il genoma è organizzato in domini di impacchettamento, con eucromatina e trascrizione attiva localizzate alla periferia dei nuclei costitutivi di eterocromatina34.

Questo protocollo fornisce alla comunità un framework riproducibile per eseguire SMLM in cromatina multicolore e stabilisce strategie di analisi adatte a bersagli nucleari multidisciplinari coniugati funzionalmente. Colmando le lacune metodologiche, consente un'esplorazione sistematica dell'organizzazione dei domini della cromatina a livello supra-nucleosomico, integrando gli approcci di sequenziamento e microscopia elettronica preservando l'architettura nucleare nativa. Questo articolo è un protocollo esteso di un articolopubblicato 34.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: La successiva sezione del protocollo sarà suddivisa nel processo di colorazione e nel processo di acquisizione descritti di seguito. Per tutorial sull'analisi dei dati, si prega di consultare la pubblicazioneassociata 34 che dettaglia l'analisi di multi-etichetta per modifiche agli istoni etichettati.

1. Processo di tintura:

NOTA: In tutto il protocollo si fa riferimento a piastre da 35 mm o 8 piastre ben camerate. Questi sono i vasi che il nostro gruppo utilizza per la coltura cellulare, tuttavia metodi più piccoli ed efficienti sono possibili. Assicurarsi che, se vengono utilizzati materiali alternativi, le concentrazioni raccomandate per gli anticorpi tamponanti vengano mantenute. A causa della natura sequenziale di questo protocollo, la selezione degli anticorpi è importante per un marcatore efficace. Utilizziamo il ragionamento standard per garantire che gli anticorpi dell'ospite per i bersagli siano diversi, in modo che i nostri anticorpi secondari possano colpire specie ospiti distinte, minimizzando efficacemente gli effetti fuori bersaglio. L'ordine di marcatura viene determinato in base alla posizione del bersaglio all'interno del nucleo. Poiché stiamo puntando ai domini di impacchettamento dellacromatina 25,28,34,35 e comprendiamo che si tratta di un processo guidato dalla diffusione, etichettamo sempre prima i bersagli eterocromatici, seguiti dall'eucromatina e infine dagli RNAPII per minimizzare l'esclusione sterica nelle regioni eterocromatiche dense. L'ottimizzazione dei buffer è stata effettuata empiricamente durante lo sviluppo del protocollo. Abbiamo riscontrato che l'inclusione del siero di capra dopo il primo bersaglio è stata utile per ridurre gli effetti fuori target nelle fasi successive.

  1. Preparazione del tampone
    1. Componenti del buffer:
      NOTA: Per ulteriori informazioni sui componenti, inclusi i tempi di conservazione e preparazione, si prega di consultare la Tabella dei materiali. Raccomandiamo all'utente di avere tutte le soluzioni pronte prima di iniziare il protocollo per evitare errori sperimentali. La soluzione di tempra dovrebbe essere fatta per ultima.
    2. Crea un buffer di blocco
    3. Pesare l'albumina sierica bovina (BSA) in modo che la concentrazione finale nel volume tampone necessario per l'esperimento sia del 3% e aggiungere a un tubo centrifuga. Inclinare il tubo a un angolo di 45° in modo che i cristalli di BSA siano distribuiti nel tubo, poi aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Questo viene fatto per prevenire la formazione di grumi cristallini che non si dissolvono.
    4. Lascia il tubo a temperatura ambiente finché tutti i cristalli non si sono dissolti. Non scuotere tubi o vortice: questo causerà la formazione di bolle che attireranno le proteine in superficie e impediranno alla BSA di dissolversi completamente.
    5. Una volta completamente disciolto, si aggiunge Triton X-100 in modo che la sua concentrazione finale sia dello 0,2% (v/v) dato il volume scelto nello step 1.3. Se i cristalli non sono completamente sciolti, pipetta su e giù più volte per mescolare lentamente la soluzione senza formare bolle.
      NOTA: Se si prepara un tampone modificato, includere il siero di capra al 10% in questo processo. Tuttavia, i buffer di blocco modificati devono essere resi freschi durante l'uso e non conservati a lungo, ma assicurarsi che le concentrazioni finali siano le stesse indicate nella Tabella dei materiali: 3% BSA, 0,2% Triton X-100.
    6. Fai del lavaggio un buffer:
      Ripeti i passaggi per il blocco del buffer in 1.1.2, ma usa le concentrazioni elencate nella sezione materiali e qui per comodità (0,2% BSA, 0,1% Triton X-100 in 1X -DPBS, e per modifiche includere siero di capra all'1%).
    7. Crea una soluzione fissativa:
      1. Aggiungi PBS a un tubo centrifuga.
      2. Aggiungere la quantità appropriata di paraformaldeide al 16% al tubo della centrifuga per una concentrazione finale del 4%.
        NOTA: Preparate le cellule fresche e pronte quando estraete le cellule dall'incubatore. Sebbene la soluzione fissativa attuale normalmente non utilizzi glutaraldeide, può essere inclusa ed è utile grazie alla fissazione più robusta e a una fissazione più duratura rispetto al paraformaldeide. Il sistema per dSTORM non possiede capacità per segnali di fluorescenza a durata di fluorescenza provenienti da glutaraldeide (GA), tuttavia gli utenti che possiedono la capacità potrebbero trovare utile questo per distinguere le strutture marcate con fluorofori.
    8. Prepara la soluzione di tempra:
      1. Pesa il boroidriduro di sodio sulla carta di pesatura.
      2. Prepara il tubo della centrifuga.
      3. Aggiungi boridrido di sodio al tubo.
      4. Aggiungi PBS alla provetta.
        NOTA: La soluzione dovrebbe avere bolle dopo aver aggiunto il PBS.
    9. Fai il buffer di immagini:
      1. Sciogliere il 1,4-Diazabicicloottano (DABCO) in RNASI deionizzata, acqua priva di DNASI, per ottenere una soluzione DABCO da 13 mL con una concentrazione di 1 M.
      2. Aggiungi 12 M HCl (~240 μL) finché il DABCO non si scioglie completamente e il pH raggiunge 8,0.
      3. Prepara 1 M di solfito di sodio sciogliendolo in 10 MBS. La DTT non richiede alcuna preparazione.
      4. Per la preparazione finale, utilizzare stock pregressi per produrre 65 mM DABCO con 30 mM di solfito di sodio e 30 mM di DTT (1 M stock) in acqua deionizzata.
      5. Regola il pH tramite titolazione con HCl e NaOH finché il pH non è 8,0. Conservare coperto e sigillato con Parafilm a 4° C non più di 2 mesi. Controlla il pH durante l'uso.
  2. Dettagli del processo di tintura per la prima etichetta:
    1. Fissazione:
      1. Prendi cellule vive dall'incubatore e rimuovi il mezzo di coltura cellulare dal piatto. Scartare il mezzo di coltura cellulare in un contenitore di rifiuti biologici.
      2. Aggiungi abbastanza PBS per coprire le celle (1 mL per una piastra da 35 mm e 500 μL per una vetrina da camera).
      3. Mescola delicatamente la teglia per lavare le cellule con PBS, poi rimuovi la PBS dalla piattaforma. Scartare il PBS in un contenitore di rifiuti biologici.
      4. Aggiungi abbastanza soluzione fissativa per coprire le celle (1 mL per un piatto da 35 mm e 500 μL per un vetrino da camera), poi lascia fissare le celle per 10 minuti.
      5. Durante la fissazione delle celle, pesa il boroidriduro di sodio per la soluzione di tempra e aggiungilo a un tubo centrifuga.
      6. Rimuovi la soluzione fissativa dalla piastra e gettala nel contenitore di rifiuti chimici liquidi correttamente etichettati.
    2. Tempra
      1. Aggiungi abbastanza PBS al piatto da coprire la superficie (1 mL per un piatto da 35 mm e 500 μL per un vetrino da camera), poi posiziona il piatto su uno shaker (qualsiasi shaker standard va bene) per 5 minuti per lavare le celle.
      2. Togli il piatto dallo shaker, rimuovi il PBS e gettalo nel contenitore di rifiuti chimici liquidi etichettato correttamente.
      3. Aggiungere abbastanza soluzione temprante (250 μL, piatti a 8 pozzetti) al piatto per coprire la superficie (1 mL per un piatto da 35 mm e 500 μL per un vetrino da camera), poi posizionare il piatto su uno shaker per 7 minuti per raffreddare l'autofluorescenza nelle celle.
      4. Mentre le celle sono sullo shaker, scartare la soluzione residua di tempra nel tubo della centrifuga nel contenitore di rifiuti chimici liquidi correttamente etichettati.
      5. Togli il piatto dallo shaker, rimuovi la soluzione di tempra e gettalo nel contenitore di rifiuti chimici liquidi etichettato correttamente.
      6. Aggiungi abbastanza PBS (250 μL, piatto a 8 pozzi) al piatto per coprire la superficie (1 mL per un piatto da 35 mm e 500 μL per un vetrino da camera), poi posiziona il piatto su uno shaker per 5 minuti per lavare le celle.
      7. Togli il piatto dallo shaker, rimuovi il PBS e gettalo nel contenitore di rifiuti chimici liquidi etichettato correttamente.
      8. Ripeti i passaggi 1.2.2.6 e 1.2.2.7 altre due volte (per un totale di 3 lavaggi PBS).
    3. Bloccaggio
      1. Aggiungi abbastanza buffer di blocco al piatto per coprire la superficie (250 μL, piatto a 8 pozzi, 1 mL per un piatto da 35 mm e 500 μL per un vetrino da camera in vetro).
      2. Posizionare il piatto su uno shaker per almeno 1 ora per permeabilizzare le membrane cellulari e bloccare i siti di legame (occupare i siti non specificati, così da non interferire con quelli target). (Anche se abbiamo testato più volte per determinare la durata minima di blocco riuscita a 20 minuti, raccomandiamo vivamente di bloccare per almeno 1 ora o più fino a una notte. Potrebbe essere necessaria ottimizzazione dato il target e la linea cellulare.)
      3. Mentre le cellule sono sullo shaker, preparare una soluzione primaria di colorazione per anticorpi (vedi concentrazione consigliata sul sito del fornitore o consulta la tabella nella sezione materiali).
      4. Per determinare il volume totale delle soluzioni di colorazione da produrre, aggiungere 0,5 mL al volume necessario per coprire le celle (ad esempio, per un piatto da 35 mm, preparare una soluzione da 1,5 mL).
      5. Rimuovere il volume determinato nella sezione 1.2.3.1 dal materiale tampone bloccante e aggiungere questo volume a un nuovo tubo centrifuga per preparare la soluzione di colorazione.
      6. Aggiungere un volume appropriato di stock di anticorpi primari al buffer di blocco per ottenere la concentrazione finale corretta. I volumi primari di stock di anticorpi per diversi anticorpi frequentemente utilizzati si trovano nella sezione materiali.
      7. Togli il piatto dallo shaker, rimuovi il tampone bloccante e gettalo nel contenitore di rifiuti chimici liquidi etichettato correttamente.
    4. Colorazione primaria degli anticorpi:
      1. Aggiungere abbastanza soluzione primaria di colorazione anticorpale alla piastra per coprire la superficie (1 mL per una piastra da 35 mm e 500 μL per una vetrata da camera), poi posizionare la piastra su uno shaker per almeno 1-2 ore fino a notte per etichettare i bersagli cellulari.
      2. Togli il piatto dallo shaker, rimuovi la soluzione primaria di colorazione anticorpale e gettalo nel contenitore di rifiuti chimici liquidi correttamente etichettati.
      3. Aggiungi abbastanza buffer di lavaggio al piatto da coprire la superficie (1 mL per un piatto da 35 mm e 500 μL per un vetrino da camera), poi posiziona il piatto su uno shaker per 5 minuti per lavare le celle.
      4. Togli il piatto dallo shaker, rimuovi il tampone per il lavaggio e gettalo nel contenitore di rifiuti chimici liquidi etichettato correttamente.
      5. Ripeti i passaggi 1.2.4.3 e 1.2.4.4 altre due volte (per un totale di 3 lavaggi del buffer di lavaggio).
      6. Mentre le cellule sono sullo shaker durante l'ultimo lavaggio, preparare una soluzione secondaria di colorazione anticorpale (vedi la concentrazione raccomandata sul sito del fornitore o consulta esperimenti precedenti).
      7. Per determinare il volume totale delle soluzioni di colorazione da produrre, aggiungere 0,5 mL al volume necessario per coprire le celle (ad esempio, per un piatto da 35 mm, preparare una soluzione da 1,5 mL).
      8. Rimuovere il volume determinato nella sezione 1.2.4.7 dal buffer di blocco e aggiungere questo volume a un nuovo tubo centrifuga per preparare la soluzione di colorazione.
      9. Aggiungi un volume appropriato di stock di anticorpi secondari al buffer di blocco per ottenere la concentrazione finale corretta. I volumi di stock di anticorpi secondari per diversi anticorpi frequentemente utilizzati si trovano nella tabella dei materiali.
      10. Avvolgi il tubo della centrifuga con la soluzione secondaria di colorazione per anticorpi con carta stagnola fino a quando non è pronta ad essere aggiunta alle cellule nel piatto.
    5. Colorazione secondaria degli anticorpi:
      1. Aggiungere una soluzione secondaria di colorazione per anticorpi sufficiente alla piastra da coprire la superficie (1 mL per una piastra da 35 mm e 500 μL per una vetrata da camera), poi posizionare la piastra su uno shaker per almeno 40 minuti per aggiungere fluorofori ai bersagli cellulari marcati.
      2. Assicurati che il piatto sia coperto con carta stagnola per evitare lo sbiancamento da fluorofori.
      3. Togli il piatto dallo shaker, rimuovi la soluzione secondaria per le macchie anticorpali e gettalo nel contenitore di rifiuti chimici liquidi etichettato correttamente.
      4. Aggiungi abbastanza PBS al piatto da coprire la superficie (1 mL per un piatto da 35 mm e 500 μL per un vetrino da camera), poi posiziona il piatto su uno shaker per 5 minuti per lavare le celle.
      5. Togli il piatto dallo shaker, rimuovi il PBS e gettalo nel contenitore di rifiuti chimici liquidi etichettato correttamente.
      6. Ripeti le sezioni 1.2.5.4 e 1.2.5.5 un'ultima volta (per un totale di 2 lavaggi PBS).
      7. Le cellule possono ora essere visualizzate o conservate per l'imaging successivo. Se effettui immagini immediatamente, segui i passaggi nella sezione Acquisizione. Se conservi per immagini in seguito, continua seguendo i passaggi seguenti.
      8. Aggiungi abbastanza PBS alla piastra da coprire la superficie (1 mL per una piastra da 35 mm e 500 μL per una vetrata da camera) prima di conservare.
      9. Avvolgi il piatto con parafilm, poi con carta stagnola per prevenire sia l'evaporazione liquida che lo sbiancamento con fluorofori.
      10. Conserva la teglia avvolta a 4°C fino a quando non è pronta per l'immagine.
        NOTA: Per le etichette utilizzate in questo protocollo, le piattole possono essere conservate per 2-3 giorni prima che la qualità dell'immagine ne suba un impatto significativo; tuttavia, diversi anticorpi possono avere stabilità variabili ma, con una corretta conservazione, sono stabili per un certo periodo dopo il completamento del protocollo. Non è consigliata conservare una ciotola etichettata per più di una settimana poiché la soluzione fissativa non è abbastanza concentrata per garantire una stabilità a lungo termine.
  3. Successiva procedura di colorazione dell'etichetta:
    1. Blocchi:
      1. Consulta 1.2.3.1 - 1.2.3.2 ma usa il buffer di blocco con il siero per capra. Il tempo di incubazione per il blocco può essere breve di appena 1 ora, ma raccomandiamo tempi più lunghi con un limite superiore di notte (18-24 ore) per queste successive etichette per ridurre il legame fuori bersaglio. Si prega di fare riferimento agli esperimenti precedenti.
      2. Nel frattempo, preparare soluzioni anticorpali primarie, invece del tampone bloccante, in tampone bloccante con siero di capra.
    2. Colorazione primaria degli anticorpi:
      1. Prepara il tampone di blocco modificato e il tampone di lavaggio con siero per capre e il tampone per lavaggio con siero per capre come descritto nella sezione preparazione del tampon.
      2. Fare riferimento alle sezioni di passaggio 1.2.3-1.2.4 (Bloccaggio e colorazione primaria degli anticorpi) utilizzando i buffer modificati di blocco e lavaggio:
        NOTA: Il tempo di incubazione dell'anticorpo primario può essere breve di appena 1 ora e lungo durante la notte (8-24 ore). Sebbene le migliori prestazioni di etichettatura siano state raggiunte con tempi di incubazione più lunghi, specialmente per multi-etichetta. I dati di questo protocollo sono stati preparati con passaggi di incubazione notturni.
      3. Poco prima del termine del tempo di incubazione, si preparano soluzioni secondarie di anticorpi nel buffer di blocco modificato 1.1.3.
    3. Colorazione secondaria degli anticorpi:
      1. Consulta la sezione 1.2.5 (Colorazione secondaria degli anticorpi) ma usa il tampone bloccante con siero di capra.
        NOTA: Si noti che il tempo di incubazione può essere breve anche di 1 ora, ma abbiamo testato tempi più lunghi (2-4 ore) con prestazioni simili. Per le etichette successive, ripetere la sezione 1.3.

2. Processo di acquisizione

NOTA: Per l'acquisizione dati, utilizzare il software Nikon Imaging Software (NIS) Elements compatibile con il microscopio utilizzato. Qualsiasi software che possa controllare filtri, percorso di luce e impostazioni della telecamera va bene per questo protocollo. Il seguente protocollo di imaging è adattato per l'illuminazione a Fluorescenza Totale Interna di Riflettanza (TIRF) del campione; tuttavia, il protocollo di etichettatura è compatibile con molteplici forme di imaging. L'imaging non-TIRF è possibile con questo protocollo di etichettatura per STORM ed è necessario per applicazioni 3D STORM. Si prega di utilizzare un protocollo standard per metodologie di imaging alternative.

  1. Successiva procedura di colorazione dell'etichetta:
    1. Attiva i componenti ottici necessari e stabilisci la connessione con il software adeguato. Nella maggior parte dei casi, come nel NIS, il software non inizializzerà completamente a meno che il computer non possa comunicare correttamente con il microscopio, la telecamera e il controllo del palco.
    2. Open NIS Software (o equivalente).
    3. Configura la visualizzazione live: Attiva la visualizzazione live >attiva Tieni la scala automatica > nelle impostazioni della fotocamera imposta il tempo di esposizione a 30 ms.
    4. Imposta il percorso dati per le acquisizioni.
    5. Naviga nel pannello superiore Acquisizione> Fast Time Lapse> Percorso
    6. Seleziona il nome corretto del file per la prima acquisizione e imposta il numero di frame a 10.000.
      NOTA: Questi passaggi vengono adottati per limitare il tempo in cui il campione viene esposto alla sorgente luminosa una volta iniziata l'immagini.
    7. Assicurarsi che l'angolo critico e l'angolo zero del TIRF siano preimpostati prima dell'acquisizione. Si prega di consultare le fonti online su tutorial su come realizzarlo. Come detto prima, se non usi l'illuminazione TIRF, questo passaggio può essere saltato.
    8. Seleziona il percorso di luce corretto per la fotocamera e attiva l'opzione Illuminazione Epi sotto Lampade (su software NIS o equivalente) per assicurarti che lo specchio sia configurato per l'illuminazione a campo ampio da fonti di luce non laser standard.
  2. Preparazione di esempio:
    1. Recuperare i campioni e aggiungere il buffer di imaging (formulazione descritta nella sezione 1.1 Preparazione del tampon) al campione. (A seconda del buffer di imaging utilizzato, potrebbero essere necessarie diverse precauzioni. Proteggi i campioni dalla luce.)
    2. Dopo aver aggiunto olio all'obiettivo, posiziona il campione sul palco con il supporto appropriato e attiva Perfect Focus , quindi metti a fuoco sul campione.
  3. Passaggi di imaging:
    1. Trova il punto laser e naviga fino a un punto sul piatto senza cellule.
    2. Attiva l'illuminazione TIRF .
    3. Cambia il filtro per adattarlo a quello appropriato per far passare la luce rossa (o qualunque laser sia usato per acquisire dati per questo campione specifico).
      NOTA: Utilizzare un filtro multi-tacca come descritto nella tabella dei materiali. Il filtro multi-tacca non è necessario e gli utenti possono alternativamente effettuare immagini di cubi filtro non distinti progettati per i fluorofori utilizzati nella colorazione.
    4. Accendi il laser alla potenza laser minima ~ 1 mW (dipende dalla fonte di illuminazione ma viene fatto per evitare sbiancamenti accidentali) e imposta l'angolo dello specchio su un angolo critico.
    5. Se non ci sono celle nelle vicinanze, aumenta la potenza del laser finché il punto laser non è chiaramente visibile nella visuale in diretta.
    6. Usa lo strumento Regione di Interesse (ROI), disegna, imposta e salva il ROI dove si trova il punto laser.
      NOTA: Per campioni multi-etichetta, si prega di assicurarsi che i punti laser per tutte le fonti luminose necessarie per il campione siano allineati. In questo protocollo usiamo tre laser e assicuriamo che tutti i punti siano allineati. Questo è essenziale poiché la co-registrazione dei dati spaziali richiede l'allineamento laser.
    7. Torna all'illuminazione Epi e al filtro del campo chiaro.
    8. Utilizzando lo strumento di definizione ROI, naviga per trovare una cellula sana appropriata (ad esempio una cellula HCT116 adatta dovrebbe avere una forma aderente, poligonale o ovale con un confine cellulare chiaro).
    9. Centra il ROI sul nucleo e clicca su OK per zoomare in posizione ROI (Esegui usando l'illuminazione a campo luminoso, poiché la salute della cellula non può essere determinata direttamente da immagini fluorescenti a campo ampio del nucleo.
    10. Ritorna all'illuminazione TIRF usando lo stesso metodo usato nella 2.3.2.
    11. Seleziona il filtro appropriato per il bersaglio con la lunghezza d'onda più lunga (nella maggior parte dei casi si tratta di rosso lontano, cioè bersaglio etichettato Alexa Fluor 647). Di solito, la lunghezza d'onda più lunga viene selezionata per prima per evitare il foto-sbiancamento del campione con lunghezze d'onda più corte, nel caso in cui i bersagli etichettati abbiano secondari che si sovrappongono agli spettri.
    12. A bassa potenza laser per ciascun laser necessario (nel caso multi-etichette sarebbero 3 laser), accendi il laser e illumina il nucleo per assicurarti che il campione sia correttamente allineato.
    13. Utilizzare i controlli TIRF per assicurarsi che il campione sia illuminato con TIRF.
    14. Seleziona la posizione Z appropriata per l'acquisizione in base alle esigenze. Tuttavia, questo può essere regolato subito prima dell'acquisizione.
    15. Set exposure time based on needs of the fluorophores (use anywhere between 10‬-30 ms).
    16. Clicca su Acquisire> Timelapse veloce.
    17. Imposta i frame a ≥10.000 e clicca su Applica per creare il file nella cartella specificata.
    18. Accendi la potenza laser al 50% e fai un campione con la candeggina.
    19. Il nucleo dovrebbe inizialmente sbiancare, ma poco dopo (pochi secondi dopo) dovrebbe iniziare a lampeggiare.
    20. Torna all'angolo critico desiderato e alla posizione Z alternando le posizioni salvate o controllando manualmente l'angolo dello specchio e la posizione Z e acquisisci un time lapse veloce.
    21. Assicurarsi che non ci siano deviazioni nello stadio o che la co-registrazione delle immagini multicanale non venga eseguita correttamente. Utilizzare marcatori fiduciari (microsfere fluorescenti) oppure salvare la posizione Z all'inizio dell'acquisizione per usarla successivamente per la correzione della deriva usando il metodo di salvataggio della posizione per l'acquisizione multipunto nel dispositivo.
    22. Cambia filtro (o lascia perdere se usi multi-tacca con banda passante per il fluoroforo necessario) e ripeti le sezioni 2.3.17-2.3.20 (Per le etichette successive, assicurati di iniziare sempre con bassa potenza laser, regolare i parametri e acquisire).
  4. Elaborazione dei dati:
    1. Carica lo stack di immagini raw in FIJI usando il plugin Bio-Formats. Genera una proiezione a intensità minima selezionando Image> Stacks> Z Project e scegliendo Min intensity come tipo di proiezione. Sottrai questa proiezione minima dallo stack di immagini raw usando Process > Image Calculator. Sull'immagine risultante, esegui la sottrazione dello sfondo (Process > Subtract Background) con un raggio di sfera rotante di 5 pixel.
    2. Definisci la regione di interesse (ROI) per singole cellule manualmente o con il plugin Nuclei Outline (Plugins > GDSC > Celle > Nuclei Outline).
    3. Esegui l'analisi di localizzazione sullo stack di immagini preelaborate all'interno del ROI definito utilizzando il plugin ThunderSTORM (Plugins > ThunderSTORM > Run analysis). Utilizzare parametri appropriati per una localizzazione robusta (ad esempio, filtro immagine: B-spline, ordine = 3, scala = 2; soglia di intensità massima = 1,5× std (Onda.F1); metodo di localizzazione sub-pixel: gaussiano, sigma = 2; raggio di adattamento = 4; metodo di adattamento: massima probabilità). Le coordinate risultanti possono essere usate per ricostruire l'immagine a super-risoluzione.
    4. Per esperimenti multicanale, unire i canali per generare un'immagine dSTORM composta ricostruita con cromatina (Immagine > Canali di fusione > colore).

Results

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Immagini rappresentative della cromatina tricolore dSTORM

Il protocollo proposto per colorazione sequenziale è stato testato valido per una varietà di linee cellulari, tra cui fibroblasti BJ, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A, ecc. La Figura 1 mostra le immagini rappresentative delle cellule fibroblasti BJ, HeLa e MCF10A.

Validazione della pipeline di analisi utilizzando dataset simulati

Lo sviluppo di un protocollo di immunofluorescenza a tre colori rese necessaria la creazione di un approccio computazionale specializzato in grado di gestire la complessità dei dati nucleari SMLM multi-bersaglio (Figura 2A,2 B). Dato l'ambiente denso della cromatina in cui più bersagli coesistono in prossimità, abbiamo implementato un framework di analisi point-cloud che elabora direttamente le coordinate di localizzazione invece che immagini ricostruite. Questo approccio sfrutta gli estesi strumenti di analisi di clustering disponibili per i datipoint-cloud 40,41,42. Abbiamo valutato sistematicamente la capacità della pipeline di analisi di distinguere schemi spaziali biologicamente significativi utilizzando dataset simulati controllati. Sono stati generati quattro tipi di distribuzione per rappresentare scenari di organizzazione della cromatina distinti: distribuzione normale per modifiche molto raggruppate, distribuzione uniforme per schemi dispersi, distribuzione toroidale che modella le zone di esclusione e distribuzione casuale come controllo organizzativo (Figura 2C). Questi pattern simulati erano ancorati a posizioni autentiche di cluster eterocromatinali derivate da dati sperimentali H3K9me3, preservando vincoli spaziali nucleari realistici. Questo framework di analisi utilizza il clustering DBSCAN (epsilon = 50 nm, punti minimi = 3), che è uno dei tanti metodi per l'analisi di cluster nei datiSMLM 40,41,42. Per garantire parametri di clustering corretti, abbiamo precedentemente descritto un metodo di ottimizzazione pensato per il rilevamento dei domini di impacchettamentodella cromatina 34. Si noti che, utilizzando questo come primo passo nell'analisi, gli utenti dovranno ottimizzare i parametri che informano la selezione attraverso la struttura, l'ambiente e la funzione del loro obiettivo. Qui i confini del cluster sono determinati tramite calcoli di involucro convesso, eliminando le assunzioni sulla geometria del dominio. La nostra validazione ha dimostrato una chiara discriminazione tra tutti i modelli di distribuzione simulati attraverso profili distintivi di istogrammi a distanza (Figura 2D). Ogni tipo di organizzazione spaziale produceva firme caratteristiche quando le localizzazioni venivano analizzate rispetto ai centroidi eterocromatinali. L'analisi dell'occupazione congiunta è stata testata utilizzando simulazioni a doppio marcatore con relazioni spaziali controllate (Figura 2E). I marcatori separati spazialmente (configurazione normale-toroidale) hanno prodotto una densità articolare minima come previsto, risultando in profili di distribuzione piatti (Figura 2E). I pattern di marcatori sovrapposti (configurazione normale-casuale) producevano una densità di congiunzione decrescente con l'aumentare della distanza dai punti di riferimento, corrispondendo alle previsioni teoriche. Questi risultati di validazione dimostrano la capacità del nostro framework di rilevare e quantificare le relazioni di accoppiamento spaziale in complessi dataset multi-target. Per maggiori informazioni su come sono stati generati questi dataset simulati, si prega di consultare la pubblicazionecompleta 34.

Risultati rappresentativi dall'analisi dell'organizzazione della cromatina

L'implementazione del nostro approccio di analisi validata su campioni biologici rivela schemi caratteristici di organizzazione spaziale raggiungibili tramite questo protocollo. Utilizzando cellule HeLa processate con la nostra procedura di colorazione a tre colori per H3K9me3, H3K27ac e RNA Polimerasi II, dimostriamo le capacità analitiche rese possibili da questa metodologia. L'eterocromatina H3K9me3 funge da sistema di riferimento ideale, date le evidenze consolidate dell'organizzazione concentrica della cromatina sulla scala 200 nm da precedenti indagini a super-risoluzione 23,28,35. L'analisi inizia con l'identificazione basata su DBSCAN dei domini di eterocromatina, che vengono successivamente categorizzati per raggio effettivo: domini piccoli (25-40 nm), domini medi (40-80 nm) e domini grandi (80-253 nm). Questa stratificazione delle dimensioni spiega l'eterogeneità documentata nelle dimensioni dei domini di impacchettamento del DNA, con domini medi che misurano circa 80 nm nel raggio25. Le misurazioni della distanza impiegano una finestra di ricerca del raggio cluster di 1,5x (Figura 2B in alto) per catturare i segnali prossimali di eucromatina e polimerasi (Figura 3A,B).

I risultati rappresentativi mostrano che sia H3K27ac che RNA Polimerasi II si localizzano costantemente vicino ai confini dell'eterocromatina in tutte le categorie di domini, in linea con studiprecedenti 28,44 e modelli di localizzazione della trascrizione rispetto ai domini dellacromatina 23,35,45,46. L'analisi quantitativa della distanza rivela posizioni medie molto vicine alle periferie dei domini: i domini grandi mostrano H3K27ac a -1,0 nm e la polimerasi RNA II a 8,4 nm dai confini, mentre i domini più piccoli mostrano associazioni periferiche comparabili con differenze posizionali minori. Queste misurazioni indicano che gli elementi attivi della cromatina si concentrano all'interfaccia tra domini repressivi e permissivi piuttosto che essere completamente esclusi. L'analisi della densità congiunta dimostra la capacità del protocollo di rivelare l'accoppiamento spaziale tra bersagli co-etichettati (Figura 3C-F). L'analisi relativa ai domini eterocromatinici mostra la densità massima delle articolazioni appena fuori dai confini del dominio (r/r₀> 1), indicando una co-localizzazione preferenziale della H3K27ac-RNA Polimerasi II nelle regioni periferiche (Figura 3G-I). Questi risultati mostrano come questa pipeline di colorazione e analisi possa aiutare a indagare complesse relazioni spaziali in ambienti densi.

figure-results-1
Figura 1: Tre immagini a colori delle celle utilizzate. Immagini a tre colori di (A) BJ fibroblast (B) HeLa e (C) MCF10A. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Quadro di analisi quantitativa per l'organizzazione spaziale dei target rispetto ai cluster di eterocromatina. (A) Pipeline di analisi per dati SMLM multicanale utilizzati in questo studio. (B) Schema dei calcoli della distanza dalla periferia per cluster di eterocromatina identificati e metodo di conteggio di affinità congiunta. Entrambi i metodi vengono utilizzati per determinare quantitativamente la disposizione di due bersagli rispetto alla struttura del cluster di eterocromatina. (C) Esempi di distribuzioni scatter attorno a specifici cluster di eterocromatina utilizzati in uno studio34 per determinare organizzazioni biologiche distinte di strutture target (raggruppate all'interno di un dominio vs intorno al dominio vs non associate e distribuite casualmente). (D) Istografia distanza dalla periferia per curve di affinità centralizzate, distribuite casualmente e toroidali e (E) Curva di affinità articolare per casi di simulazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Relazioni spaziali quantitative dei marcatori di trascrizione attorno ai domini degli istoni. (A) Risultati dell'istogramma distanza dalla periferia per dati biologici esemplari di cellule HeLa multi-marcate. Per domini piccoli (<40 nm), medi (40-80 nm) e grandi (>120 nm) per RNAPII e (B) H3K27ac rispetto ai cluster H3K9me3. (C-E) Immagini di esempio per un'immagine dSTORM a tre etichette di celle HeLa (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p, con immagine intassata e zoomata per un singolo dominio. (F) Adattamento convesso dell'involucro (rosso) del dominio raffigurato in E con la zona di analisi in grigio. (G) Grafici di affinità per RNAPII rispetto a H3K27ac e H3K27ac (H) rispetto a RNAPII nell'analisi ROI per tutti i domini nei dati di medie dimensioni nel dataset. (I) Densità congiunta di RNAPII e H3K27ac nell'analisi ROI per tutti i domini di medie dimensioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

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Questo protocollo SMLM a tre colori rappresenta un significativo progresso nella nostra capacità di studiare l'organizzazione della cromatina nell'ambiente nucleare denso. L'approccio sequenziale di marcatura immunofluorescenza, combinato con l'analisi spaziale a nuvole puntiformi che utilizza stime di localizzazione come punti come base dell'analisi, fornisce ai ricercatori uno strumento potente per esaminare le relazioni su scala nanometrica tra diverse modifiche della cromatina e meccanismi attivi di trascrizione che prima erano non rilevabili con tecniche di microscopia convenzionali.

La strategia di colorazione sequenziale del protocollo affronta sfide fondamentali insite all'imaging nucleare multi-bersaglio. A differenza delle strutture citoplasmatiche o associate alla membrana, che sono relativamente scarse, i bersagli della cromatina nucleare esistono in densità estremamente elevata con domini spaziali sovrapposti. Il nostro approccio di blocco modificato, che incorpora il siero proveniente da specie di anticorpi ospiti secondari dopo ogni ciclo di marcatura, previene efficacemente la reattività incrociata tra coppie di anticorpi mantenendo la specificità del bersaglio. Le incubazioni notturne a 4°C garantiscono una penetrazione completa degli anticorpi in tutto il volume nucleare, fondamentale per raggiungere la densità di marcatura uniforme necessaria all'analisi quantitativa SMLM. Questo protocollo produce in modo affidabile immagini con risoluzione di 15-20 nm su più linee cellulari, rendendolo ampiamente applicabile per studi sull'organizzazione della cromatina.

Di seguito sono riportati i consigli per la risoluzione dei problemi durante la sessione di imaging. Se i nuclei non sbiancano, la causa più probabile è un'intensità laser insufficiente al campione, che può derivare da una bassa potenza o da un angolo TIRF errato; in questo caso, si verifica l'allineamento del laser, aumenta la potenza del laser e regola con attenzione l'angolo del TIRF. Se i lampeggi nel nucleo sono pochissimi ma rimangono costantemente luminosi, ciò indica che i nuclei non si sono sbiancati abbastanza. Se i battiti di clink sono molto scarsi e i nuclei non sono affatto visibili, la spiegazione più probabile è la colorazione inefficace, e i reagenti e gli anticorpi dovrebbero essere controllati prima di ripetere il protocollo. Al contrario, se il numero di sbattiti nucleari è molto alto (un risultato auspicabile), è necessario un tempo di sbiancamento più lungo fino a quando i singoli lampeggi singoli ben separati possono essere risolti visivamente. Negli esperimenti convenzionali SMLM, la densità di marcatura appropriata può spesso essere stimata utilizzando strutture di riferimento ben definite come i microtubuli; tuttavia, la cromatina presenta un'organizzazione altamente eterogenea e manca di una struttura di verità di base ben definita, rendendo tale stima più difficile. Basandoci sull'ottimizzazione empirica e sull'esperienza precedente, garantiamo quindi che la densità effettiva di marcatura raggiunga circa 100 localizzazioni per μm² per consentire una ricostruzione robusta dei domini di impaccheggio della cromatina. Nel nostro protocollo, non abbiamo usato alcun indicatore fiduciario ma raccomandavamo se gli utenti li possiedono. Nei nostri esperimenti, gli spostamenti laterali rimangono entro 0,2 pixel (meno di ~5nm), cosa che può essere trascurata. Pertanto, non abbiamo utilizzato marcatori fiduciari.

La scelta di H3K9me3, H3K27ac e RNA polimerasi II fornisce informazioni complementari sull'organizzazione della cromatina a livello nanoscala. H3K9me3 funge da riferimento spaziale ideale perché forma cluster discreti e ben definiti che rappresentano l'eterocromatina costitutiva e possono essere identificati in modo affidabile tramite algoritmi di clustering automatizzato. H3K27ac segna la cromatina associata all'esaltatore che partecipa attivamente alla regolazione genica, mentre la polimerasi RNA II indica direttamente i siti di trascrizione attiva. Insieme, questi tre obiettivi permettono di indagare come la macchina trascrizionale e le modifiche regolatrici della cromatina si organizzino rispetto alle regioni eterocromatiche all'interno dell'architettura nucleare.

Il framework di analisi delle nuvole puntiformi affronta limitazioni critiche degli studi precedenti sull'organizzazione della cromatina consentendo un'analisi spaziale completa in ambienti nucleari densi. I metodi tradizionali di confronto a coppie non possono catturare le complesse relazioni spaziali che si verificano quando più modifiche della cromatina coesistono all'interno delle stesse regioni nucleari. Il nostro approccio utilizza l'analisi della densità congiuntiva per rivelare dove H3K27ac e RNA polimerasi II si localizzano in relazione ai cluster di H3K9me3, fornendo informazioni quantitative che non possono essere ottenute da esperimenti separati a due colori.

I risultati rappresentativi dimostrano costantemente un modello organizzativo coeso piuttosto che una compartimentalizzazione rigorosa della cromatina. Sia H3K27ac che RNA polimerasi II si localizzano preferenzialmente nelle periferie dei cluster eterocromatina su diverse dimensioni di dominio, con misurazioni quantitative che mostrano un posizionamento entro 10 nm dai confini dei cluster, a supporto dei risultati di altri gruppi con metodi e modelli di trascrizionesimili 23,28,35,45,46 . L'analisi della densità congiunta rivela che la macchina attiva di trascrizione e la cromatina associata all'esaltatore si accoppiano più frequentemente nelle regioni circostanti cluster eterocromatici. Questi risultati mettono in discussione modelli semplici di separazione delle fasi e supportano principi organizzativi integrati in cui diverse modifiche alla cromatina mantengono una prossimità spaziale stretta invece di formare compartimenti separati distinti.

Il design modulare del protocollo consente di investigare diverse questioni di biologia della cromatina tramite la sostituzione dei bersagli, mantenendo allo stesso tempo lo stesso quadro analitico. Gli studi sul tempismo della replicazione possono sostituire le proteine del ciclo cellulare come l'antigene nucleare delle cellule di proliferazione (PCNA) e il mantenimento dei mini cromosomi (MCM), mentre le indagini sulla risposta al danno al DNA potrebbero colpire γH2AX e fattori di riparazione. Gli studi sul ciclo cellulare potrebbero esaminare le modifiche degli istoni che cambiano durante la divisione, mentre la ricerca sulla differenziazione potrebbe concentrarsi sui segni epigenetici associati all'impegno della linea di discendenza. L'approccio di marcatura sequenziale accoglie qualsiasi combinazione di proteine nucleari o modifiche della cromatina per cui esistono anticorpi affidabili, limitati principalmente da considerazioni di compatibilità spettrale e reattività incrociata. Questa flessibilità consente ai ricercatori di affrontare questioni fondamentali sulla dinamica della cromatina durante vari processi cellulari, mantenendo al contempo capacità di analisi spaziale quantitativa.

Disclosures

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Gli autori di questo protocollo non hanno alcuna divulgazione o interessi concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH U54CA268084, U54CA261694 e R01CA228272, da sovvenzioni della National Science Foundation EFMA-1830961 e CBET-2430743, e dal sostegno filantropico di Rob e Kristin Goldman, dal signor David Sachs e dalla Christina Carinato Charitable Foundation.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Andor iXon Ultra 888 CCD  a moltiplicazione elettronica;AndorDU-888U3-CSO-#BV NA
Albumina sierica bovinaSigma AldrichA7030Usate per bloccare e lavare i buffer. Non conservare il buffer di blocco basato su BSA per più di 1 mese a 4° C
Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd., Modello MGL-FN-532 (532 nm) e nbsp;PSU-H-LED https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htmNA
Scatola laser coerente OBIS (405 nm, 488 nm, 532 nm, 552 nm, 637 nm) & nbsp;Coerente1228877 I laser collimavano con 3– 10 kW/cm³ Potenza media al campione, minimo 10.000 fotogrammi raccolti per canale a lunghezza d'onda con  10– 30  ms  tempo di acquisizione. 
DABCO (1,4-Diazabiciclo-(2.2.2)-ottano)SigmaD27802NA
DBPS (1X)Thermo Fisher14190-136NA
Acqua distillataNANAQualsiasi acqua distillata va bene.
DTT (Ditiotreitolo), 1MSigma43816NA
Vetro a copertura ben cameratoCellvisC8-1.5H-NPuò essere qualsiasi piastra di vetro, ma i volumi devono essere regolati a seconda del recipiente.
Capra anti-Mouse AF568Thermo FisherA11004Concentrazione stock: 2 mg/mL
Stabilità post-etichettatura: 2– 3 giorni
Goat anti Rabbit AF647Thermo FisherA21245Concentrazione di stock: 2 mg/mL
Stabilità post-etichettatura: 4– 5 giorni
Capra anti-ratto A488Thermo FisherA11006Concentrazione stock: 2 mg/mL
Stabilità post-etichettatura: 2– 3 giorni
Anticorpo primario H3K27acThermo FisherMA5-23516Concentrazione di stock: 1,0 mg/mL 
Anticorpi primari H3K9me3  AbcamAB1769156Concentrazione di stock: 1,287 mg/mL 
Tubo Conico di Polipropilene ad alta chiarezza 15 mL   Corning 352096Utilizzato per soluzioni fissative e di tempra  
Tubo conico polipropilene ad alta nitidezza 50 mLCorning352070Utilizzato per scorte di lavoro da 40 mL di tamponi di blocco e lavaggio
Acido cloridrico (HCl), 12MSigma258148NA
Nikon Eclipse Ti-E con sistema di messa a fuoco perfetto  NikonTI-DH 611392 Microscopio rovesciato 
Nikon SR APO TIRF, ingrandimento 100x, 1,49 NA Nikonhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series  NA
Siero normale per capraAbcamAB7481-1002Usato dopo che la prima etichetta è finita. Dovrebbero essere presenti nei buffer di blocco e lavaggio
Paraformaldehyde 16 % Scienze della microscopia elettronica15710Usata in soluzione fissativa che dovrebbe essere consumata entro 2 settimane dalla preparazione. Proteggi dalla luce a 4°Grad; C
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10XAmbionAM9625NA
Punte per pipette 1000 uLSureOne02-707-404Qualsiasi punta di pipetta va bene, purché sia così s appropriato per il volume
RNAPII-PS2AbcamAB252855Concentrazione di stavolta: 0,98 mg/mL
Boridriduro di sodioThermo FisherS678-10Usa il fresco per la tempra del buffer ogni singola volta.
Idrossido di sodio (NaOH)Thermo Fisher A16037.36NA
Solfito di sodioSigmaS0505NA
Triton X-100 10%Thermo Fisher 28314NA

References

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