Sviluppo ed efficacia delle nanoparticelle di squalene-chidamide a risposta enzimatica per il cancro al pancreas

Summary

Questo protocollo dettaglia la sintesi e la caratterizzazione delle nanoparticelle di squalene-chitosano modificate con acido folico, valuta il rilascio di farmaci responsivi agli enzimi e l'assorbimento cellulare in vitro, e le applica per migliorare la terapia del cancro pancreatico tramite una somministrazione mirata.

Abstract

Qui presentiamo un protocollo per affrontare la penetrazione intratumorale limitata dei farmaci a piccole molecole causata dalla matrice extracellulare densa (ECM) dell'adenocarcinoma del pancreas dettale (PDAC). I prodroghi offrono un grande potenziale per superare questa sfida migliorando la penetrazione dei farmaci e l'efficacia nella morte dei tumori. Lo squalene (SQ), un precursore naturale della biosintesi del colesterolo con eccellente biosicurezza e biocompatibilità, può migliorare la compatibilità delle membrane dei farmaci idrofili e potenziarne l'assorbimento cellulare quando coniugato con agenti chemioterapici o piccole molecole bioattive. In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo sistema prodrug lipofilo basato su SQ: il farmaco anticancro idrofilo chidamide (CHI) è stato coniugato a SQ tramite un legame amidico — un collegamento sensibile alla pancreatina e alla catepsina B (enzimi chiave sovraespressi nel microambiente PDAC). Questa coniugazione ha prodotto un prodrogamento anfifilico SQ-CHI, che è stato ulteriormente autoassemblato in nanoparticelle modificate con folato (FA) (FA-SQ-CHI NN). I NP ottimizzati hanno mostrato un diametro idrodinamico uniforme di 173,3 ± 1,5 nm, un indice di polidispersione (PDI) di 0,181 ± 0,18, un'elevata capacità di carico di droga del 59,0% ± 0,77% e un potenziale Zeta stabile di -13,10 ± 0,86 mV. Gli studi di rilascio in vitro hanno mostrato che gli NP hanno raggiunto l'80,2% ± 4,22% di rilascio cumulativo del farmaco entro 72 ore in presenza dello 0,25% di pancreatina, mentre solo il rilascio tra il 33% e il 38% è stato osservato in tamponi aggiustati per pH (pH 4,5 o 7,4) senza enzimi. I saggi di captazione cellulare hanno confermato che la modifica dell'AF ha significativamente aumentato l'efficienza della somministrazione intracellulare, con un'intensità di fluorescenza 1,8-2,3 volte superiore nelle cellule PDAC (PSN-1 e CFPAC-1) rispetto alle NP non mirate tra 12 e 24 ore. L'attuale protocollo fornisce una metodologia completa per la sintesi e caratterizzazione del prodrug, la valutazione in vitro della cinetica di rilascio enzimatica responsiva e analisi comparative dell'efficacia terapeutica e della penetrazione tissutale, evidenziando i vantaggi fondamentali del nanoportatore in termini di somministrazione mirata, alto carico di farmaci e rilascio controllato innescato dagli enzimi.

Introduction

L'adenocarcinoma del pancreas del dotto (PDAC) è un tumore altamente maligno del tratto digestivo, con un tasso di incidenza quasi uguale al suo tasso di mortalità, e un tasso di sopravvivenza a 5 anni di solo 8%-9%^1. Un microambiente tumorale complesso (TME) è la caratteristica distintiva del^{PDAC 2}. È composto principalmente da una matrice extracellulare anomala (ECM), fibroblasti associati al cancro attivati (CAF) e un ambiente cellulare profondamente immunosoppressivo. Il PDAC ECM è ricco di collagene di tipo I. Sia il contenuto alterato che l'architettura anomala promuovono la progressione tumorale e sono associati a una prognosi^{sfavorevole 3}. I CAF sono le cellule stromali più abbondanti e sono costituiti da sottotipi funzionalmente distinti, come i myCAF produttori di matrice e gli iCAF infiammatori, che mostrano plasticità^{fenotipica 4}.

Dal punto di vista immunologico, il PDAC TME è dominato da cellule mieloidi pro-tumorali. I linfociti antitumorali sono scarsi o disfunzionali. I linfociti B maturi contribuiscono inoltre^{all'immunosoppressione 3,4}. Insieme, questi componenti stabiliscono molteplici barriere terapeutiche. Lo stroma denso, caratterizzato da un'elevata pressione del liquido interstiziale, crea una barriera di penetrazione significativa che ostacola gravemente l'erogazione di agenti terapeutici nelle regioni tumorali profonde, limitando così sostanzialmente l'efficacia clinica dei farmaci^{chemioterapeutici 5}. Di conseguenza, sviluppare sistemi di somministrazione di farmaci in grado di superare questa barriera stromale e penetrare in profondità nel tessuto tumorale pancreatico è di importanza cruciale.

Negli ultimi anni, lo squalene (SQ), un precursore naturale della biosintesi del colesterolo, ha attirato notevole attenzione grazie alla sua eccellente biosicurezza e^{biocompatibilità.} Essendo altamente idrofobica, la SQ può essere coniugata con farmaci idrofili per formare prodroghe anfifiliche, migliorando così la biocompatibilità dei farmaci idrofili a piccole molecole con le membrane cellulari e migliorando la loro efficienza di assorbimento^{cellulare 7}. Studi precedenti hanno dimostrato che la SQ può essere coniugata covalentmente con vari agenti chemioterapici, come cisplatino, paclitaxel e gemcitabina, formando nanoparticelle profarmaco con alta capacità di carico del farmaco, migliorando la somministrazione dei tumori^{solidi 8,9}. Queste proprietà sottolineano l'ampio potenziale applicativo della SQ nello sviluppo dei sistemi di somministrazione di farmaci.

Per migliorare il targeting tumorale, questo studio utilizza l'acido folico (FA) come ligando di targeting. L'AO è una vitamina idrosolubile cruciale per il metabolismo a un carbonio, la^{biosintesi 10}, l'omeostasi^{redox 11} e le reazioni di^{metilazione 12}. La coniugazione dell'A tramite i suoi gruppi carbossilico al nanoportatore consente il riconoscimento e il legame specifici al recettore folato (FR), seguita da un'endocitosi mediata dal^{recettore 13}. Sfruttando l'effetto di permeabilità e ritenzione aumentata delle cellule tumorali, Zheng et ^al.14 hanno valutato l'espressione del recettore folato α (FRα) nel cancro del pancreas, nel pancreas normale, nei tessuti adiacenti e nella pancreatite cronica utilizzando Western blotting e immunoistochimica, analizzandone la correlazione con le caratteristiche clinicopatologiche. FRα è stato espresso nel 94,7% (72/76) dei casi di cancro al pancreas, correlato con la metastasi, ma è stato assente nei tessuti pancreati normali. Le nanoparticelle modificate con FA possono accumularsi selettivamente nei tessuti FR-positivi, permettendo terapie mirate molecolare.

Chidamide (CHI) è un nuovo inibitore dell'istone deacetilasi. Studi preclinici hanno dimostrato che presenta anche una potente attività antitumorale contro tumori solidi come il cancro al pancreas e al seno, e può invertire la resistenza ai farmaci nelle cellule^{tumorali 15,16}. Tuttavia, la sua forte idrofilitia è associata a una bassa efficienza di penetrazione nel microambiente tumorale e a una scarsa distribuzione all'interno dei tessuti tumorali solidi, il che limita gravemente il suo potenziale terapeutico clinico per il cancro^{al pancreas 5}. Utilizzando il chidamide (CHI) come farmaco modello, questo studio propone la preparazione di nanoparticelle autoassemblate tramite la coniugazione del CHI con la SQ e la successiva modifica con la FA. Questa strategia mira a migliorare l'efficacia antitumorale del CHI contro il cancro al pancreas superandone la scarsa penetrazione nel microambiente tumorale e la distribuzione subottimale all'interno del tessuto tumorale solido. Inoltre, valutando l'efficacia in vitro del CHI nelle linee cellulari del cancro al pancreas, si prevede che questo approccio migliori significativamente la penetrazione e gli effetti citotossici del CHI — un farmaco idrofilo rappresentativo a piccole molecole — nel microambiente tumorale pancreatico, fornendo così una base sperimentale per guidare la terapia basata sul CHI nel cancro al pancreas.

Il nostro studio approfondisce le procedure sperimentali per preparare nanoparticelle di profármaco autoassemblate CHI-SQ-PEG-FA per il trattamento del cancro al pancreas. In particolare, descriviamo l'ottimizzazione e la caratterizzazione del processo di preparazione per le nanoparticelle CHI-SQ-PEG-FA, insieme a studi di rilascio in vitro di farmaci. Il processo prevede: innanzitutto, ottimizzare la formulazione utilizzando un approccio sperimentale a fattore singolo e determinare la dimensione ottimale delle particelle e il carico di farmaco; secondo, caratterizzare le nanoparticelle tramite saghi UPLC e MTS; e infine, stabilire un modello di sferoidi tumorali in vitro co-coltura. Utilizzando la cumarina-6 (C6) come sonda fluorescente in nanoparticelle mirate, convalidiamo ulteriormente la penetrazione e la distribuzione delle nanoparticelle all'interno degli sferoidi tumorali tridimensionali e otteniamo dati rilevanti.

Protocol

1. Sintesi di SQ-CHI e SQ-PEG-FA

1. Sintesi di SQ-CHI: Pesa 120,4 mg (0,3 mmol) di acido 1,1',2-trisqualenoico e lo dissolve in 1 mL di N, N-Dimetilformamide (DMF). Aggiungi sequenzialmente NHS (46 mg, 0,4 mmol) ed EDCI (72 mg, 0,38 mmol) e lascia che la reazione prosegra per 90 minuti sotto protezione con azoto.
2. Sciogli il chidamide (58,56 mg, 0,15 mmol) in 1 mL di DMF e aggiungilo a goccia nella miscela di reazione. Mescolare la reazione a temperatura ambiente sotto un'atmosfera di azoto per 72 ore.
3. Dopo il completamento, evaporare il solvente a pressione ridotta a 5-15 kPa per ottenere il prodotto greggio. Purificare il prodotto grezzo tramite cromatografia a colonna flash utilizzando un'eluzione a gradiente di DCM/MeOH (99:1, 99:5, 85:5).
4. Verifica strutturale del SQ-CHI: Inserire il prodotto sintetizzato di SQ-CHI in una fiala di vetro e asciugarlo sotto vuoto in un essiccatore per 24 ore. Sciogliere il prodotto in circa 1 mL di cloroformio deuterato (_{CDCl 3}) e trasferirlo in un tubo campione NMR. Eseguire un'analisi NMR di ¹H per confermare la struttura chimica del^{prodotto 17}.
5. Sintesi di SQ-PEG-FA: Sciogliere 41,12 mg di acido 1,1',2-trisqualenoico in 35 μL di DMF. Aggiungere sequencialmente N-idrossisuccinimide (NHS, 15,71 mg) e 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimide (EDCI, 24,59 mg) a questa soluzione.
6. Lascia che la reazione proceda per 90 minuti sotto un'atmosfera di azoto. Sciogliere 20 mg di FA-PEG-NH₂ in 35 μL di DMF e aggiungerlo a goccia alla miscela di reazione.
7. Mescolare la miscela risultante a temperatura ambiente per 72 ore sotto l'azoto. Purificare il prodotto greggio con un tubo centrifugo a ultrafiltrazione MWCO da 3 kDa a 5.200 x g per 30 minuti per rimuovere l'acido libero non reagito. Inserire la soluzione acquosa complessa SQ-PEG-FA purificata in una fiala di vetro e precongelarla a -50 °C. Liofilizza la soluzione pre-congelata in un liofilizzatore per ottenere il complesso SQ-PEG-FA come polvere liofilizzata.

2. Verifica strutturale di SQ-PEG-FA

1. Posizionare il complesso SQ-PEG-FA liofilizzato in un tubo centrifuga da 2 mL e asciugarlo ulteriormente sotto vuoto in un essiccatore per 24 ore. Sciogliere il prodotto in circa 1 mL di dimetilsolfosido deuterato (_{DMSO-d 6}) e trasferirlo in un tubo campione NMR. Eseguire un'analisi NMR ^{a un'ora}per confermare la struttura chimica del complesso.
2. Ottimizzazione della preparazione e caratterizzazione dei NP SQ-CHI-PEG-FA
3. Pesare 6,64 mg di SQ-CHI e scioglierlo in 2 mL di etanolo assoluto per preparare una soluzione di stocco da 3,32 mg/mL (4,3 μM).
4. Aggiungere la soluzione etanolica SQ-CHI (1, 0,2, 0,1 o 0,05 mL) a goccia su 1 mL di acqua deionizzata sotto mescolazione. Mescolare per 5 minuti, poi rimuovere l'etanolo tramite evaporazione a pressione ridotta. Sonicare la miscela risultante per 30 minuti per ottenere una sospensione di nanoparticelle CHI-SQ. Misurare il diametro idrodinamico e l'indice di polidispersione (PDI) delle nanoparticelle con uno Zetasizer per identificare la formulazione^{ottimale 18}.
5. Aggiungere 0,1 mL della soluzione etanolica SQ-CHI a 1 mL di acqua deionizzata dopo diverse durate di mescolare (0, 5, 10 o 20 min). Dopo il rispettivo periodo di agitazione, rimuovere l'etanolo tramite evaporazione riducente di pressione, seguita da una sonicazione per 30 minuti per ottenere sospensioni di nanoparticelle CHI-SQ. Misurare il diametro idrodinamico e il PDI per determinare il tempo ottimale di mescolatura.
6. Aggiungi 0,1 mL della soluzione etanolica SQ-CHI a 1 mL di acqua deionizzata durante 5 minuti. Dopo aver mescolato, rimuovere l'etanolo tramite evaporazione riducente della pressione. Sonicare la miscela risultante per diverse durate (0, 5, 20 o 30 minuti) per ottenere sospensioni di nanoparticelle CHI-SQ. Misurare il diametro idrodinamico e il PDI per determinare il tempo ottimale di sonicazione.
7. Confermare le condizioni ottimali basandosi sui risultati sopra riportati. Qui, il rapporto volumetrico ottenuto tra acqua e soluzione di stocco = 10:1, tempo di mescolare = 5 minuti e tempo di sonicazione = 30 minuti. Ripetere tutti gli esperimenti indipendentemente in triplicata per garantire l'affidabilità.
8. Usa il metodo a fattore singolo mantenendo costanti gli altri parametri. Variare sequenzialmente i seguenti fattori per valutarne l'impatto sulla distribuzione delle dimensioni delle particelle e sul potenziale Zeta delle nanoparticelle: rapporto di massa dei componenti (SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0,05, 1:0,5, 1:0,7), rapporto di fase e volume (fase acquosa: fase organica = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20) e tempo di sonicazione (5, 15, 30, 45 min).
9. Secondo il protocollo ottimizzato, si combinano le soluzioni stock SQ-CHI e SQ-PEG-FA al rapporto determinato. Aggiungi questa miscela a goccia in acqua deionizzata sotto una mescolata costante. Continua a mescolare per 5 minuti per assicurarti una mescolazione accurata. Rimuovere l'etanolo tramite evaporazione riducente di pressione, seguita da sondazione con sonda per 30 minuti per ottenere la sospensione finale di nanoparticelle CHI-SQ-PEG-FA.
10. Misurare il diametro idrodinamico, la distribuzione delle dimensioni (PDI) e il potenziale Zeta delle nanoparticelle utilizzando la diffusione dinamica della luce con un analizzatore laser delle dimensioni delle particelle. Osservare la morfologia delle nanoparticelle tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM, ingrandimento 150.000x) e microscopia elettronica a scansione (SEM, ingrandimento 80.000x).
11. Determinazione del contenuto di carico del farmaco tramite cromatografia liquida ultra-performante (UPLC)
12. Imposta le condizioni cromatiche come segue: colonna C18 (2,1 mm x 50 mm, 1,7 μm); Fase mobile: 0,1% di acido formico Soluzione acquosa - acetonitrile (75:25, V/V); lunghezza d'onda di rilevamento: 258 nm; portata: 0,2 mL/min; temperatura della colonna: 23 °C; volume di iniezione: 5 μL; Durata: 10 min.
13. Ricostruisci la sospensione CHI-SQ-PEG-FA NP e centrifugala a 7.500 x g per 30 minuti. Raccogli il soprandanante e filtralo attraverso una membrana microporosa da 0,22 μm. Usa il filtrato risultante come soluzione di prova. Iniettare e analizzare la soluzione di prova nelle condizioni cromatografiche specificate. Calcola il contenuto di carico di farmaco delle nanoparticelle basandosi sulla concentrazione misurata di CHI nel filtrato.

3. Studio di rilascio in vitro del farmaco

1. Pipettare con precisione un'aliquota da 2 mL di una soluzione CHI appena preparata o della sospensione di nanoparticelle CHI-SQ-PEG-FA in una sacca per dialisi con un limite di peso molecolare di 3 kDa.
2. Immergi la sacca per la dialisi nel mezzo di rilascio contenente diverse concentrazioni di pancreatina (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). A intervalli di tempo prestabiliti (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), preleva 1 mL di campioni dal mezzo di rilascio e sostituisci immediatamente con un volume uguale di mezzo fresco preriscaldato per mantenere le condizioni di sink.
3. Determinare la concentrazione di CHI in tutti i campioni utilizzando il metodo UPLC (condizioni cromatografiche specificate nella sezione 3) e calcolare il rilascio cumulativo del farmaco.
4. Usa il tampone di acetato di ammonio (pH 4,5) come mezzo di rilascio. Pipettare con precisione 2 mL della sospensione delle nanoparticelle in una sacca per dialisi (3 kDa). Aggiungi diverse unità di attività (0, 0,7, 1,4, 2,8 U) di Cathepsin B direttamente nella sacca per la dialisi. Immergi la sacca in 40 mL di mezzo di rilascio e incubala in uno shaker a temperatura costante a 37 ± 0,5 °C e 75 giri/min. Nei momenti prestabiliti (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), preleva campioni di 1 mL e sostituisci immediatamente con un volume uguale di mezzo fresco, preriscaldato, allo stesso pH per mantenere l'equilibrio del sistema.
5. Filtrare i campioni raccolti attraverso una membrana microporosa di 0,22 μm. Analizzare i filtrati tramite UPLC per determinare la concentrazione del farmaco. Calcola la percentuale cumulativa di rilascio di CHI e traccia i profili di rilascio del farmaco.
6. Pipetta con precisione un'aliquota da 2 mL della soluzione CHI o della sospensione CHI-SQ-PEG-FA NP in una sacca per dialisi (MWCO da 3 kDa). Immergi la sacca per la dialisi nel mezzo di rilascio contenente diverse concentrazioni di pancreatina (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). Nei momenti prestabiliti (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), preleva 1 mL di campioni e sostituisci immediatamente con un volume uguale di mezzo fresco e preriscaldato per mantenere le condizioni di sink.
7. Quantificare la concentrazione di farmaci nei campioni tramite UPLC. Calcola il rilascio cumulativo del farmaco e genera le curve di rilascio.
8. Valutazione della stabilità delle nanoparticelle nel PBS
9. Mescola i CHI-SQ-PEG-FA NP CON PBS (PH 7,4) in un rapporto di 1:20 (v/v). Incubare la miscela in un shaker a temperatura costante a 37 ± 0,5 °C e 100 giri/min. Prelevare campioni a 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72, 96 h per misurare il diametro idrodinamico e il potenziale Zeta.
10. Saggio di proliferazione cellulare tramite metodo MTS
11. Le cellule del cancro al pancreas PSN-1 sono state coltivate in mezzo RPMI-1640 completo. Le cellule nella fase di crescita logaritmica sono state prelevate tramite digestione con lo 0,25% di tripsina a 37 °C e risospese a una densità di 4-6 x^{10 4} cellule/mL nel mezzo completo. La sospensione è stata seminata in piastre da 96 pozzi a 100 μL per pozzo, e pre-coltura per 2 ore in_{un incubatore} a 37 °C e 5% di CO 2 per consentire l'adesione completa delle cellule.
12. Aspira il mezzo di coltura originale. Impostare un gruppo di controllo (mezzo di coltura a vuoto) e molteplici gradienti di concentrazione di gruppi chidamidi (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM), con tre pozzi replicati per gruppo. Aggiungere 100 μL di mezzo bianco o contenente farmaci in ciascun pozzo, poi trasferire la piastra cellulare nell'incubatrice per la coltura continua. Trattare i gruppi sperimentali con 100 μL di mezzo fresco contenente concentrazioni variabili (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM) di SQ-PEG, CHI LIBERO, CHI-SQ-PEG NPs o CHI-SQ-PEG-FA NPs, mentre il gruppo di controllo riceve un volume uguale di mezzo bianco. Dopo un'ulteriore incubazione per 96 ore, rimuovere il mezzo contenente il farmaco da ciascun pozzo.
13. Aggiungere 20 μL di soluzione di lavoro MTS a ciascun pozzo, seguito da incubazione per 4 ore. Scuotere la piastra a 96 pozzi per 15 secondi per garantire l'omogeneità e misurare immediatamente l'assorbanza (valore A) di ogni pozzo a una lunghezza d'onda di 490 nm usando un lettore di microplacche. Calcola il tasso di proliferazione cellulare sottraendo il valore OD del gruppo vuoto dal valore OD del gruppo trattato con il farmaco, dividendo il risultato per la differenza tra il valore OD del gruppo del mezzo vuoto e il valore OD del gruppo vuoto, e poi moltiplicando per 100.
14. Stabilimento di un modello di sferoidi tumorali in vitro co-colturato
15. Mescolare cellule PSN-1 nella fase di crescita logaritmica con cellule HPSC a un rapporto 2:7 e seminarle in piastre di 96 pozzi a attacco ultra-basso con una densità di 5.000 cellule per pozzo. Dopo la formazione dello sferoide tumorale, si trattano gli sferoidi con diverse nano-formulazioni (NP marcati con Coumarina 6 CHI-SQ-PEG/C6 NP e CHI-SQ-PEG-FA/C6) o DMSO (come controllo) e co-incubarli per 48, 96 e 144 ore per valutarne l'efficacia del farmaco.
16. Dopo l'incubazione, si aggiunge un volume uguale di reagente per il test di vitalità cellulare a ciascun pozzo. Posiziona il piatto su uno shaker orbitale e agita per 15 minuti per assicurare una lisi completa, seguito da un'incubazione a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
17. Trasferire il lisato cellulare su una piastra nera a 96 pozzi. Misurare il segnale di chemiluminescenza a una lunghezza d'onda di 562 nm utilizzando un lettore multifunzione di micropiastre per quantificare la vitalità cellulare.
18. Indagine sull'assorbimento cellulare di nanoparticelle
19. Preparare nanoparticelle mirate (CHI-SQ-PEG-FA/CN N) e nanoparticelle non mirate (CHI-SQ-PEG/CN6 NP) incorporando la cumarina-6 (C6) come sonda fluorescente. Coltivare regolarmente le cellule PSN-1 nella fase logaritmica di crescita per 24 ore per formare un monostrato. Dissolvere la cumarina 6 in etanolo per preparare una soluzione di stock da 200 μg/mL. Mescola 10 μL della soluzione con SQ-CHI e SQ-PEG-FA (o SQ-PEG) in un rapporto 1:0,7, poi inietta goccia a goccia in acqua deionizzata durante l'agitazione. Mescolare per 5 minuti, rimuovere l'etanolo per evaporazione e sonicare per 30 minuti. Infine, purificare tramite ultrafiltrazione (3 kDa, 12.000 giri/min, 20 min) per ottenere gli oggetti.
20. Trattare le cellule come segue: i gruppi sperimentali ricevono un mezzo senza siero contenente C6 libero, CHI-SQ-PEG/CN NN o CHI-SQ-PEG-FA/CN NN (con una concentrazione finale di CHI di 5 μmol/L e una concentrazione di C6 di 2,6 μmol/L), mentre il gruppo di controllo riceve un volume uguale di mezzo bianco.
21. Dopo l'incubazione per 4, 12 e 24 ore, aspira il mezzo contenente il farmaco. Nuclei delle cellule di colorazione utilizzando 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)¹⁹.
22. Effettuare osservazioni al microscopio a fluorescenza (40x, lunghezza d'onda di eccitazione Ex=360 nm, lunghezza d'onda di emissione Em=477 nm). Valutare l'assorbimento cellulare delle nanoparticelle misurando l'intensità di fluorescenza della cumarina-6.

4. Analisi statistica

1. Esegui tutti gli esperimenti con almeno 3 repliche per ottenere i dati presentati in questo studio. Analizza le statistiche usando il software GraphPad Prism. Presentare i dati sperimentali come media ± errore standard della media (SD) e confrontare tra i gruppi utilizzando il test t di Student, ANOVA unidirezionale o il test Wilcoxon dove appropriato. Stabilire la soglia per la significatività statistica a P < 0,05.

Results

Questo studio ha progettato con successo e valutato sistematicamente un nuovo sistema miro di somministrazione di nanofarmaci -- le nanoparticelle autoassemblate basate su prodroghe a base di squalenilazione chidamide (CHI-SQ-PEG-FA NP; Figura 1). Abbiamo sintetizzato i NN CHI-SQ-PEG-FA (Figura 2) e valutato sistematicamente gli effetti di vari parametri, tra cui il rapporto di fase olio-acqua (Figura 3A

Discussion

Questo studio fornisce una guida pratica passo dopo passo per implementare un sistema a vita bassa basato sull'autoassemblaggio delle nanoparticelle. Le nanoparticelle autoassemblate ottenute in questo studio hanno mostrato una forma sferica regolare, buona dispersione, dimensione uniforme delle particelle, elevata efficienza di carico e incapsulamento di farmaci, e hanno dimostrato stabilità^{soddisfacente 21}. Un modello 3D di co-coltura di sferoidi tumorali (PSN-1...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% tripsina-EDTA	Gibco (USA)	25200072
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimide cloridrato (EDCI)	Sigma-Aldrich (USA)	E6383
Fiale criogeniche da 2 mL	Corning (USA)	430488
Piastre di coltura cellulare a 96 pozzi	Corning (USA)	3598
etanolo assoluto	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	100092680
acetone	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	32201-2.5L
acetonitrile	Tedia (USA)	A998-4	Grado HPLC
Acetato di ammonio	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	10002861
Solfato di sodio anidro	Sigma-Aldrich (USA)	31481
Armadietto di sicurezza biologica	Thermo Fisher Scientific, USA	1380, 1332, 1356
Fiaschette di coltura cellulare	Corning (USA)	CLS430372
incubatore di colture cellulari	Thermo Fisher Scientific, USA	HERA51901126
chidamide (CHI)	Shenzhen Microcore Biotech Co., Ltd. (Cina)		purezza >95%
Lettore di micropiastre multimodalità Cytation 5	BioTek, USA	CYT5MV
Agitatore termostatico per riscaldamento magnetico DF-101S	Zhengzhou Kechuang Instrument Co., Ltd., Cina
diclorometano	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	80047318
Dimetilsolfosido (DMSO)	Sigma-Aldrich (USA)	D2650
Diosano	Aladdin (Cina)	D116156-5ml
Mezzo DMEM	Gibco (USA)	12100046
Soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS)	Gibco (USA)	14040141
Acetato di etil	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	10009460
etere etilico	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
FA2004B bilanciamento elettronico	Shanghai Tianmei Balance Instrument Co., Ltd., Cina	FA2004B
Siero bovino fetale (FBS)	Gibco (USA)	10099141C
folato-poli(glicole etilenico)amminamina (FA-PEG-NH2)	Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (Cina)	PS2-NFA-2000
Acido formico	Aladdin (Cina)	F112034	Grado HPLC
Liofilizzatore	Thermo Fisher Scientific, USA
Catepisina B umana	Sigma-Aldrich (USA)	SRP0289
Linee cellulari del cancro del pancreas umano (PSN-1, CFPAC-1)	la Collezione di Cultura di Tipo Americano (ATCC)	CRL-3211, CRL-1918
cellule stellate pancreatiche umane (HPaStec, HPSC)	la Collezione di Cultura di Tipo Americano (ATCC)
La tripsina umana	Sigma-Aldrich (USA)
Acido cloridrico	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	CFSR-10011008
microscopio invertito	Olympus, Giappone	IX83
Il Dulbecco's Medium Modificato di Iscove (IMDM)	Gibco (USA)	12440053
IX 1000 miscelatore vortice & nbsp;	Hangzhou Ruicheng Instrument Co., Ltd., Cina	IX 1000
Metanolo	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	M433287-10L
metanolo	Tedia (USA)	MS1922-001	Grado HPLC
tubi microcentrifughe (1,5/2,0 mL)	Assigen (USA)	MCT-150-C
micropipette (20, 100 e 1000 μ L)	Thermo Fisher Scientific, USA	4642050, 4642070, 4642090
Sistema di purificazione dell'acqua Mill-Q	Millipore, USA	ZR0Q00800
Kit di saggio MTS (3-(4,5-dimetiltiazolo-2-il)-5-(3-carbossimetossifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio)	Promega (USA)	G3582
N,N-Dimetilformamide (DMF)	Aladdin (Cina)
N-bromosuccinimide (NBS)	Sigma-Aldrich (USA)	B81255
N-Idrossisuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich (USA)	56480
Optima Max ultracentrifuga	Beckman, USA	393490
Soluzione di penicillina/streptomicina	Gibco (USA)	15140-122
Acido periodico	Sigma-Aldrich (USA)	P7875
Etere di petrolio	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
Fenazina metosolfato (PMS)	Sigma-Aldrich (USA)	3180806
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco (USA)	70011069
Poli(glicole etilenico)amminamina (PEG-NH2)	Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (Cina)	PG2-AM-20k
RPMI-1640 media	Gibco (USA)	31800022
Polvere di gel di silice	Sigma-Aldrich (USA)	53698	300 mesh
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich (USA)	401676
Cloruro di sodio	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	10019318
Diidrato di dicromato di sodio	Sigma-Aldrich (USA)	1.93689
Squalene	Sigma-Aldrich (USA)	Y0002131
Tubi centrifughe sterili (15 e 50 mL)	Corning (USA)	430791, 430828
Acido solforico	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	10021618
Tetraidrofurano	China National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)	34865-4X4L	Grado analitico
tubi centrifughi a ultrafiltrazione (taglio del peso molecolare: 3,5 kDa)	Beckman, USA	344088