Imaging spettroscopico a super-risoluzione delle molecole di DNA utilizzando contrasto intrinseco

Sommario

Questo protocollo fornisce operazioni dettagliate sulla preparazione del campione, raccolta dati e analisi degli spettri di fluorescenza intrinseca del DNA.

Abstract

L'imaging a super-risoluzione ha rivoluzionato la ricerca biologica rivelando dettagli strutturali su scala nanometrica. La maggior parte dei metodi ottici di super-risoluzione si basa sulla marcatura fluorescente delle biomolecole, che consente il marcatore specifico delle specie molecolari ma può disturbare le funzioni cellulari, introdurre imprecisioni dalle molecole di collegamento e non fornire l'elevata densità di marcatura costante richiesta per l'imaging della cromatina su scala delle singole molecole di DNA. Una tecnologia che consente imaging genomico in situ, senza marcature e con risoluzione nanometrica, influenzerebbe profondamente la biologia. Qui presentiamo un protocollo che sfrutta la fluorescenza intrinseca del DNA per eseguire la microscopia spettroscopica di localizzazione a singola molecola (sSMLM). Il protocollo dettaglia la preparazione del campione, l'acquisizione dei dati e l'analisi spettrale. In breve, un sottile gel di DNA viene creato depositando una soluzione polinucleotidica sul vetro e lasciandolo asciugare per ore. Dopo la formazione del gel, il campione viene fotografato in presenza di un buffer di imaging utilizzando sSMLM. Il dataset registrato comprende un'immagine di ordine zero, che fornisce localizzazioni spaziali, e un'immagine di primo ordine, che codifica lo spettro di emissione di ciascuna localizzazione. Le ricostruzioni spaziali sono generate dai dati di ordine zero, dopo di che gli spettri corrispondenti vengono estratti dal segnale di primo ordine. Infine, dimostriamo la fattibilità di questo approccio utilizzando molteplici lunghezze d'onda di eccitazione e molecole di DNA con lunghezze, sequenze e composizioni variabili.

Introduzione

Le tecniche di microscopia a fluorescenza a super-risoluzione — tra cui la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), la microscopia a esaurimento a emissione stimolata (STED) e gli approcci di localizzazione a singola molecola (SMLM) come la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM) e la microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM) — hanno spinto la risoluzione della microscopia ottica ben oltre il limite di diffrazione ^{1,2,3,4.5,6,7}, che consente un accesso senza precedenti all'organizzazione su scala nanometrica^{della cromatina} 8,9,10,11,12. Tuttavia, i metodi attuali di colorazione per visualizzare le strutture degli acidi nucleici si basano sul marcatore delle proteine associate al DNA piuttosto che del DNA stesso, oppure impiegano coloranti a piccole molecole che possono disturbare la configurazione nativa della cromatina e compromettere la vitalità^{cellulare 13,14}. A causa di queste limitazioni, lo sviluppo di metodi di imaging ottico a super-risoluzione senza etichettatura in condizioni native e non perturbanti è altamente auspicabile. Il protocollo presentato qui è destinato a nucleotidi di DNA sintetici, purificati a singolo filamento o doppio filamento, dove la fluorescenza intrinseca può essere rilevata in modo affidabile; non è ottimizzato per l'imaging di molecole di DNA nucleare in cellule fisse o vive.

Poiché gli acidi nucleici sono stati a lungo considerati non fluorescenti a causa della loro resa quantistica estremamente bassa (dell'ordine di 10⁻⁴ sotto eccitazione UV) e del decadimento ultraveloce della fluorescenza a temperatura^{ambiente 15}, gli studi sulla fluorescenza intrinseca del DNA (principalmente la durata della fluorescenza) sono stati rari fino allo sviluppo della spettroscopia femtosecondi. È stato ben riconosciuto che i nucleotidi fluorescono debolmente sotto l'illuminazione UV, mentre il loro assorbimento nell'intervallo visibile è notevolmente più debole. Tuttavia, è stato recentemente osservato che la fluorescenza eccitata dalla luce visibile degli acidi nucleici non modificati a concentrazioni fisiologicamente rilevanti esiste¹⁶. Questo fenomeno era probabilmente stato trascurato perché la maggior parte degli studi fotochimici sui nucleotidi è stata condotta in soluzioni diluite (10-100 μM)17,18,19,20, mentre nei nuclei e nei cromosomi le concentrazioni di DNA possono raggiungere 0,1-1^M 21,22,23. Ancora più importante, il cambio stocastico di fluorescenza sotto illuminazione visibile è^{stato osservato 16}, gettando le basi per l'uso di acidi nucleici non modificati come agenti di contrasto endogeni per la microscopia a superrisoluzione basata sulla localizzazione.

Le caratteristiche fotochimiche dei monomeri nucleotidici e delle molecole di DNA monofilamento con sequenze semplici a concentrazioni fisiologiche sotto eccitazione a luce visibile sono state^{esplorate 24}. È stato inoltre dimostrato che queste molecole di DNA possiedono proprietà stocastiche di commutazione di fluorescenza, che si allineano bene con la teoria della deplezione dello stato fondamentale (GSD)^6,7, esaminando il recupero da fluorescenza dei nucleotidi in condizioni di deplezione variabili. Inoltre, poiché i nucleotidi mostrano rese quantistiche relativamente elevate e basse probabilità di incrocio intersistemico, il conteggio dei fotoni e le durate di battito degli eventi di emissione a singola molecola sono paragonabili a quelli dei coloranti esogeni popolari in STORM (ad esempio, Alexa Fluor 647), che mostrano spettri^{distinti 25,26} e rendono il DNA un agente di contrasto intrinseco ideale per l'imaging ad alta risoluzione. Inoltre, l'implementazione dell'algoritmo di regressione spettrale descritto nella sezione precedente consente l'imaging a super-risoluzione sotto i dieci nanometri di polinucleotidi e fibre lineari di DNA^{monofilamento 27}.

Per catturare l'intero spettro della fluorescenza intrinseca del DNA, abbiamo utilizzato un prisma a doppio cuneo (DWP) per la rilevazione spettrale, che consente analisi spettroscopica e imaging a molecola singola ad alta produttività con perdite di trasmissione minime e errore di fronte d'onda 28,29,30, e un software open source di analisi SMLM spettroscopica (RainbowSTORM) per l'elaborazione automatica ^{dei dati 31,32}. Sulla base di questa capacità, abbiamo sviluppato una piattaforma SMLM multi-laser integrata con rilevamento spettroscopico e una pipeline dedicata all'analisi spettrale. Il protocollo che presentiamo qui comprende la preparazione, l'acquisizione dati e l'analisi del campione, fornendo un flusso di lavoro riproducibile per sfruttare la fluorescenza intrinseca del DNA nella microscopia a localizzazione a singola molecola. Oltre a consentire studi proof-of-concept sull'imaging di oligonucleotidi monofilanti e molecole di DNA doppio filamento con contrasto intrinseco, l'approccio ha gettato le basi per applicazioni più ampie nell'imaging del DNA in condizioni native e prive di marcatori, come la previsione di sequenza basata sulla fluorescenza intrinseca del DNA combinata con metodi computazionali.

Protocollo

1. Preparazione di campioni di gel di DNA (Figura 1A)

1. Sciogliere il campione di DNA (oligonucleotide o DNA a doppio filamento) in acqua deionizzata senza nucleasi fino a una concentrazione finale di 100 mM e conservare la soluzione standard a -4 °C.
2. Preparare aliquote da 5 μL per minimizzare i cicli ripetuti di congelamento-disgelo. Se usi aliquote congelate, scongelale a temperatura ambiente per 5-15 minuti, a seconda del volume.
3. Pulisci delicatamente un vetrino di vetro con una salvietta da laboratorio. Pipetta 5 μL della soluzione molecole di DNA da 100 mM sul vetrio appena pulito e lascia evaporare per 1-3 ore, formando un gel di DNA.
4. Aziona questo passaggio in una cappa per sicurezza. Preparare il buffer di imaging secondo la Tabella dei Materiali. Sia il buffer β-mercaptoetanolo che il buffer DABCO sono stati validati per supportare il foto-switching stocastico delle molecole di DNA.
5. Aziona questo passaggio in una cappa per sicurezza. Aggiungi 5 μL di buffer di imaging al gel di DNA e posiziona una copertura sopra immediatamente prima dell'imaging di immagini. Potrebbero esserci bolle all'interno del campione coperto. Usa una pinzetta per rimuovere le bolle all'interno del campione coperto,

2. Calibrazione del sistema sSMLM e acquisizione dati (Figura 1B)

1. Preparare un array di nanobuchi fabbricato con un diametro di 100 nm e una spaziatura di 4 μm, disposto in 8 file x 5 colonne per la successiva calibrazione del sistema SMLM^{spettroscopico 33}.
   NOTA: In alternativa, la tabella di risoluzione 1951 (R3L1S4N) dell'United States Air Force (USAF) può essere utilizzata anche per la calibrazione^{spettrale 33}.
   1. Produrre l'array di nanofori tramite sputing metallico sequenziale e fresatura a fascio ionico focalizzato (FIB). Per prima cosa, depositare un film di alluminio spesso 150 nm su un rivestimento di vetro borosilicato da 22 x 22 mm usando sputtering DC a 75 W con flusso standard di argon di 20 centimetri cubi al minuto (SCCM) a 3 mTorr.
   2. Modella un array nanoforico 5 x 8 nello strato di alluminio utilizzando fresatura FIB operato a una tensione di accelerazione di 30 kV.
2. Accendi il sistema SMLM spettroscopico (Figura 2), inserisci filtri a larghezza di banda ridotta (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm e 750 nm) direttamente davanti alla telecamera e usa una fonte di luce bianca (ad esempio, la lampada del microscopio) per illuminare il campione di calibrazione.
3. Raccogli 10 fotogrammi con ogni filtro. Imposta il tempo di esposizione per 532 nm, 580 nm, 633 nm e 680 nm a 200 ms e a 2000 ms per 750 nm a causa della bassa intensità della lampada e della bassa efficienza della fotocamera nella regione del vicino infrarosso (Figura 3).
4. Carica il campione di gel di DNA sul microscopio, assicurati che il lato del coperchio sia rivolto verso l'obiettivo e apri il software della telecamera per l'acquisizione dati.
5. Identificare la posizione z appropriata con l'aiuto del sistema automatico di tracciamento del foco, assicurando che sia visibile un chiaro lampeggiamento stocastico. Questo passaggio è fondamentale e richiede pazienza, poiché i campioni di gel di DNA mancano di indizi morfologici evidenti come le strutture cellulari, rendendo difficile orientarsi verso un segnale corretto.
6. Assicurati che l'obiettivo non tocchi il bordo del sottocoperto, poiché ciò potrebbe causare perdite di tamponi nell'olio a immersione e interferire con il tracciamento.
7. Acquisire 10.000-30.000 fotogrammi con una potenza di illuminazione tipica di 5 kW/cm² e un tempo di esposizione di 30 ms. Regola il numero di fotogrammi, la potenza di illuminazione e il tempo di esposizione secondo necessità. Dopo l'acquisizione, il software salverà i dati in formato nd2 di default.
8. Dopo aver completato l'esperimento, smaltire il vetrino in un contenitore approvato per rifiuti per oggetti taglienti (ad esempio, contenitore di vetri rotti o per oggetti taglienti) e scartare tutti i tamponi rimanenti nel contenitore designato per rifiuti chimici liquidi in conformità con le linee guida di sicurezza istituzionali.

3. Analisi dei dati di calibrazione e spettroscopia (Figura 1C)

1. Carica la pila di immagini grezze acquisite del campione di DNA in FIJI (Windows 64-bit), utilizzando il Bio-Formats Plugin.
2. Sottrai la proiezione minima dallo stack per ottenere un dataset sottratto dal background e salvalo per l'analisi spettrale. Per la pila di immagini raw caricate, seleziona Image > Stacks > Z Project e scegli Min intensity nel tipo di proiezione. Poi seleziona Calcolatore di Immagini > Processo per sottrarre la proiezione minima dallo stack di immagini raw e salvarla come TIFF.
3. Eseguire l'identificazione della localizzazione sullo stack di immagini raw di ordine zero utilizzando il plugin ThunderSTORM (versione 1.3). Utilizzare parametri appropriati (ad esempio, soglia = 1,2 x std (Onda.F1), sigma = 1,5, raggio di adattamento = 3) per ricostruire l'immagine di ordine zero ed estrarre le coordinate dell'evento di emissione (unità: nm). Per la pila di immagini raw di ordine zero ritagliata, seleziona Plugin > ThunderSTORM > Run analysis.
4. Usa FIJI e il software open-source RainbowSTORM (link GitHub in³², con versione MATLAB più recente di 2020b) per elaborare i dati di calibrazione e ottenere la relazione tra spostamenti orizzontali e verticali e le lunghezze^{d'onda 31,32}.
   1. Esegui l'identificazione della localizzazione sulle immagini di calibrazione delle 5 lunghezze d'onda utilizzando il plugin ThunderSTORM. Utilizzare parametri appropriati (ad esempio, soglia = 5 x std (Onda.F1), sigma = 1,5, raggio di adattamento = 3) per ricostruire le localizzazioni dei nanofori di ordine zero e le corrispondenti localizzazioni spettrali di primo ordine.
   2. Regolare la soglia (ad esempio, in un intervallo da 5-10 x std (Onda.F1)) fino a ottenere 80 localizzazioni per ogni immagine di calibrazione.
   3. Esegui RainbowSTORM e clicca su Calibrazione Spettrale > Sfoglia e carica i file CSV per ogni lunghezza d'onda di calibrazione (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm, 750 nm) del passaggio precedente. Clicca su Salva file di calibrazione.
5. Converti le coordinate basate su nanometri in coordinate dei pixel e mappale alla corrispondente finestra spettrale basandosi sugli spostamenti orizzontali e verticali dallo zero al primo ordine, determinati nella calibrazione (Figura 4), per misurare l'intero spettro della fluorescenza intrinseca del DNA.
   1. Usa script Python^{personalizzati 34} (versione 3.11.7) per estrarre i dati dell'intero spettro con i seguenti passaggi.
   2. Imposta i percorsi file corretti per la pila di immagini sottratta dallo sfondo (.tiff) dal passo 3.2, il file CSV di localizzazione (.csv) prodotto dal passo 3.3 e il file di calibrazione dal passo 3.4 (.mat).
   3. Utilizzare 900-950 pixel come spostamento orizzontale per i dati a 488 nm acquisiti con il DWP 3D, corrispondenti a una finestra spettrale di 484-588 nm, leggermente più ampia rispetto alla gamma di filtri 500-550 nm per garantire la copertura.
   4. Utilizzare 925-984 pixel come spostamento orizzontale per i dati a 532 nm acquisiti con il DWP 3D, corrispondenti a una finestra spettrale da 525-750 nm, ancora una volta scelta per essere più ampia rispetto alla gamma di filtri da 590 a 650 nm.
   5. Usa 23 pixel come spostamento verticale sia per i dati a 488 nm che a quelli a 532 nm con il DWP 3D.
      I valori sopra riportati sono stati derivati dalla curva di calibrazione spettrale ottenuta utilizzando RainbowSTORM. Gli script Python per la misurazione a spettro completo si trovano in³⁴.
6. Linearizzare lo spettro non lineare per analisi successive (confronto, classificazione, ecc.) utilizzando un adattamento polinomiale^{di ordine} 3 (Figura 3).

Risultati

L'intero processo — dalla preparazione del campione all'acquisizione e analisi dei dati — per una pila di immagini di un campione di DNA richiede circa 120 minuti, assumendo che la formazione del gel del DNA richieda 1 ora (Figura 1). Il tempo combinato per lo scongelamento, la formazione del gel e la calibrazione spettrale è fissato a circa 90 minuti, indipendentemente dal numero di immagini o campioni nell'esperimento. Per massimizzare l'efficienza, consigliamo di raccogliere più stack di immagini su più campioni in una singola sessione.

Immagini rappresentative in tempo reale ottenute dopo il DWP sono mostrate nella Figura 1B e nella Figura 3A, dove i segnali di fluorescenza sono suddivisi in ordine zero (a sinistra, contenente informazioni spaziali) e primo ordine (a destra, contenente informazioni spettrali). Nella Figura 1B, le immagini sono state acquisite utilizzando la configurazione DWP 2D, in cui la separazione tra immagini di ordine zero e primo è relativamente piccola. Al contrario, la Figura 3A mostra i dati raccolti utilizzando il DWP 3D, dove i due ordini di diffrazione sono più ampiamente separati a causa della differenza di percorso ottica ingegnerizzata richiesta per l'imaging 3D bipiano. Tutti i dati presentati nelle Figure 1C, 3 e Figure 4 sono stati raccolti utilizzando la configurazione 3D DWP. La scelta tra imaging 2D e 3D dipende dall'obiettivo sperimentale: per le misurazioni spettrali a fluorescenza intrinseca di campioni di DNA sintetizzati, il DWP 2D è generalmente preferito perché questi campioni non presentano caratteristiche strutturali tridimensionali rilevanti, anche se la configurazione DWP 3D può essere utilizzata anche quando si desiderano informazioni assiali.

Insieme, questi risultati rappresentativi dimostrano la capacità principale della piattaforma di imaging basata sul DWP di risolvere simultaneamente spettri di localizzazione spaziale e emissione da singole molecole di DNA in tempo reale. Le prestazioni corrette del sistema sono indicate dalla chiara e stabile separazione tra l'immagine spaziale di ordine zero e l'immagine spettrale di primo ordine, con ogni localizzazione di singola molecola nell'ordine zero corrispondente a una traccia spettrale distinta di primo ordine. L'analisi spettrale quantitativa viene effettuata identificando eventi isolati a singola molecola nell'immagine di ordine zero, misurando lo spostamento relativo dei pixel del segnale di primo ordine associato e convertendo questo spostamento in lunghezza d'onda utilizzando una funzione di mappatura calibrata. Poiché la relazione tra spostamento dei pixel e lunghezza d'onda di emissione è non lineare, si applica un adattamento polinomiale di terzo ordine per ricostruire accuratamente gli spettri di emissione lineari dai dati^{grezzi 28}. Gli spettri a singola molecola risultanti possono essere ulteriormente integrati in pipeline di analisi computazionale, inclusi modelli di machine learning o deep learning, per consentire la classificazione spettrale e l'inferenza della composizione delle sequenze di DNA o della struttura molecolare basata su firme di fluorescenza intrinseca sotto diverse condizioni di illuminazione e stati fotofisici.

Tutti i dati mostrati in questo protocollo sono stati raccolti utilizzando il buffer di imaging³⁵ basato su β-mercaptoetanolo. In linea di principio, qualsiasi buffer di imaging che migliori il comportamento di foto-commutazione dei fluorofori dovrebbe essere compatibile con questo approccio, ad esempio il buffer di imaging^{basato su DABCO, 36}. Le molecole di DNA testate includono A, G, C, T a 20 basi monocatene; catena AC a singolo filo a 40 basi (A₁C₁, A₅C₅, A₁₀C₁₀, A₂₀C₂₀); guanine a singolo filamento a 5, 8, 12, 16 basi; GC e AT a doppio filamento a 20 basi (vedi Tabella dei Materiali per informazioni dettagliate). La selezione dei costrutti di DNA a 20 e 40 basi si basa sull'osservazione che una catena di DNA a 40 basi adotta una conformazione compatta con una dimensione effettiva inferiore a 40 x 3,4 = 13,6 nm, collocandola al di sotto del limite di risoluzione dell'immagine SMLM ricostruita. Le lunghezze d'onda di eccitazione (488 nm e 532 nm) non erano ottimizzate in modo univoco per sequenze specifiche, ma sono state selezionate per dimostrare che la fluorescenza intrinseca del DNA può essere rilevata in modo robusto attraverso diverse composizioni di basi e stati conformazionali utilizzando entrambe le lunghezze d'onda. Abbiamo testato il buffer di imaging come mostrato nella Figura Supplementare 1 e abbiamo riscontrato che quasi nessun segnale di battito stocastico è stato rilevato, escludendo componenti del buffer e trattamenti superficiali del vetro. Solo il gel di DNA + il buffer di imaging ha presentato un numero significativo di battimenti di ciglia. Le vetrine e le coperture di vetro erano pulite e maneggiate con attenzione, mentre il gel campione veniva formato in un ambiente chiuso. Pertanto, è improbabile che i segnali rilevati provengano da impurità o autofluorescenza del substrato. Abbiamo anche misurato il segnale del gel essiccante e della soluzione di DNA, entrambi, e non abbiamo riscontrato differenze significative, quindi i manufatti fotochimici durante l'essiccazione non sono la fonte principale dei segnali. I prodotti di fotodegradazione solitamente mostrano spettri ampi e non hanno proprietà di sbattimento delle palpebre, che non sono mai state osservate nel nostro studio. I limiti quantitativi di rilevamento, riflessi dal conteggio minimo di fotoni delle localizzazioni, sono di 30 - 50 [conteggio di fotoni]. Questo valore rimane lo stesso per campioni di DNA e sistemi marcati, come H3K9me3 marcato AF647 nelle celle fisse. La precisione media di localizzazione della fluorescenza intrinseca del DNA è di circa 15 - 25 nm, mentre l'AF647 è di circa 10 - 15 nm.

Nello scenario 2D, l'immagine SMLM ricostruita ha una dimensione di pixel di 22 nm. La precisione delle localizzazioni delle emissioni stocastiche ha una media di ~20 nm, che descrive l'intervallo di confidenza di dove la singola molecola si localizza. Tuttavia, i campioni testati per fluorescenza intrinseca non presentano strutture biologiche, quindi la risoluzione delle strutture non può essere interpretata. Si dice che la microscopia a diffusione Raman coerente abbia una risoluzione di 250 - 300^{nm 37}, mentre la microscopia UV a due fotoni ha una risoluzione di 300 nm³⁸. Il rapporto segnale-rumore dell'imaging a scattering Raman coerente è di magnitudo 10 - 100³⁹, mentre è 2 - 20 (spesso espresso come segnale a entrambi la deviazione standard, SSDR) per la microscopia UV a 2 fotoni ^40,41. Il SNR per la fluorescenza intrinseca del DNA usando sSMLM è di circa 5 a causa del basso numero di fotoni e delle limitazioni imposte dal rumore di rilevamento della fotocamera.

Figura 1: Flusso di lavoro con durate stimate. (A) La preparazione del campione prevede lo scongelamento del materiale, la preparazione del gel di DNA e l'aggiunta di un buffer per l'imaging. Il tempo totale varia da 1 a 3 ore a seconda del campione e dell'ambiente. (B) Ogni acquisizione richiede un processo di calibrazione con un campione di array nanohole appositamente progettato. Il tempo totale di calibrazione sarà di circa 20 minuti, e il tempo di acquisizione dati per una pila di immagini sarà di circa 10 minuti, inclusa la ricerca campionaria (10.000 fotogrammi e tempo di esposizione di 50 ms). (C) La pipeline di analisi prevede la pre-elaborazione FIJI e l'analisi spettrale in Python. La pre-elaborazione in FIJI richiede circa 10 minuti, mentre l'analisi spettrale è veloce con i codici stabiliti. Gli spettri presentati sono stati raccolti da Guanina a 16 basi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Schema ottico. Le quattro linee laser (405 nm, 488 nm, 532 nm, 647 nm) vengono indirizzate al microscopio rovesciato tramite allineamento laser, rendendo il sistema stabile e facile da operare. Il DWP è posizionato proprio davanti alla telecamera sCMOS, consentendo la rilevazione spettroscopica di singola molecola. Durante la calibrazione per il DWP, verrà inserita una ruota di filtro tra la telecamera e il DWP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Calibrazione spettrale. Le lunghezze d'onda di calibrazione utilizzate sono 532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm e 750 nm. Posizionando sequenzialmente filtri a larghezza di banda stretta con queste lunghezze d'onda centrali dopo il DWP e davanti alla fotocamera, si possono misurare i corrispondenti spostamenti orizzontali e verticali di diverse lunghezze d'onda, permettendo la mappatura di una curva di calibrazione tra posizione del pixel e lunghezza d'onda. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Spettri di molecole di DNA selezionate a doppio filamento e singolo filamento sotto eccitazione rispettivamente di 532 nm e 488 nm. (A - B) Gli spettri non lineari e lineari di GC_alter, che si riferiscono a un tipo di molecola di DNA a doppio filamento, con entrambi i filamenti come 20-base 5'-GCGCGCGCGCGCGCGCGC-3'. Lo spettro verde evidenziato mostra la curva media. (C - D) Gli spettri non lineari e lineari di A₁₀C₁₀, che si riferiscono a un tipo di molecola di DNA a singolo filamento, con lunghezza di 40 basi e ripetuti 10 adenina e 10 citosina (5'- AAAAAAAAAACCCCCCCCCCAAAAAAAACCCCCCCCCCCC-3'). Lo spettro blu evidenziato mostra la curva media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Esperimenti di controllo per la fluorescenza intrinseca del DNA. Clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

Qui presentiamo, per la prima volta, un protocollo per catturare l'intero spettro della fluorescenza intrinseca del DNA sia da molecole di DNA a singolo filamento che a doppio filamento, coprendo il flusso di lavoro dalla preparazione del campione all'acquisizione dati e all'analisi computazionale. Questo protocollo consente l'imaging super-risoluzione senza marcatori delle molecole di DNA sfruttando la fluorescenza intrinseca piuttosto che le sonde esogene. In linea di principio, questo approccio potrebbe essere esteso alle cellule fisse e potenzialmente all'imaging delle cellule vive, evitando la marcatura chimica e l'amplificazione basata su anticorpi. La cromatina all'interno del nucleo coinvolge DNA, RNA e diversi tipi di proteine, che costituiscono un sistema molto più complesso rispetto al gel di DNA. Attualmente, a causa del basso numero di fotoni provenienti dalle molecole di DNA, le emissioni stocastiche dall'interno del nucleo nelle cellule fisse/vive sono difficili. Ma per i cromosomi isolati, o nucleo, il segnale di fluorescenza intrinseca del DNA era stato^riportato 16,24,27. Tuttavia, nella sua forma attuale, il protocollo è limitato ad ambienti in vitro utilizzando campioni di DNA sintetizzati. In confronto, la marcatura del DNA nucleare o della cromatina tramite immunocolorazione richiede tipicamente procedure lunghe a più fasi — inclusi tempra, blocco e incubazioni primarie e secondarie di anticorpi — che possono richiedere dell'ordine di diverse ore (spesso ~5 ore per bersaglio^)12,42, introducendo sia complessità sperimentale sia potenziali perturbazioni nella struttura nativa della cromatina. Eliminando le marcature esogene, l'imaging basato su fluorescenza intrinseca non solo riduce sostanzialmente i tempi di preparazione del campione, ma evita anche perturbazioni strutturali ed errori di collegamento associati a sonde fluorescenti ingombranti e anticorpi, consentendo così una localizzazione più fedele su scala nanometrica del DNA.

Nonostante la sua natura priva di etichette e la semplicità concettuale, l'implementazione efficace di questo protocollo richiede un'attenta attenzione a diversi dettagli sperimentali critici. Ad esempio, durante la preparazione del campione, un tempo insufficiente per la formazione del gel di DNA riduce il numero di localizzazioni individuabili di singole molecole rispetto ai gel completamente formati. Di solito, il gel richiede circa 1,5 ore per formarsi. Se la soluzione non è completamente asciutta, aspetta ancora un po'. Per un coperchissone da 22 x 22 mm, 5 μL di buffer di imaging sono sufficienti, mentre un volume maggiore di buffer può causare perdite, che possono interrompere l'interfaccia di immersione in olio dell'obiettivo e influire negativamente sulle prestazioni di immagini. Se si verifica una perdita, può essere rimossa con cura usando una salvietta da laboratorio. Durante la messa a fuoco, alza gradualmente l'obiettivo dalla posizione z più bassa. Dopo che l'obiettivo si è attivato con l'olio a immersione, si utilizza la modalità di regolazione fine per identificare il piano focale con frequenti eventi di emissione stocastica a singola molecola. Se grandi cluster di gel producono segnali aggregati con spettri di primo ordine sovrapposti, si seleziona un'area di imaging alternativa.

Nonostante i suoi vantaggi, questo protocollo presenta diverse limitazioni importanti che dovrebbero essere considerate nella valutazione della sua applicabilità e prestazioni. Innanzitutto, un'estrazione spettrale accurata si basa su una sufficiente separazione spaziale tra singoli eventi a singola molecola; Densità di localizzazione elevate, come quelle derivanti da grandi cluster di gel di DNA o assemblaggi macromolecolari densamente impacchiati, possono portare a tracce spettrali di primo ordine sovrapposte che complicano o impediscono una ricostruzione affidabile dello spettro. In secondo luogo, il metodo è sensibile all'allineamento ottico e alla stabilità della messa a fuoco, poiché piccoli disallineamenti del prisma a doppio cuneo o deviazioni dal piano focale ottimale possono introdurre errori sistematici nella calibrazione della lunghezza d'onda e ridurre il rapporto segnale-rumore. In terzo luogo, il protocollo attualmente non implementa la demixazione spettrale, limitandone l'uso in campioni ad alta densità molecolare o specie che si sovrappongono spettralmente molteplici. Collettivamente, questi fattori definiscono il regime operativo pratico del metodo e dovrebbero essere attentamente considerati quando si estende il protocollo a sistemi biologici più complessi o affollati.

In questo protocollo, RainbowSTORM viene utilizzato solo per la calibrazione spettrale, anche se il software fornisce anche strumenti potenti per la calibrazione 2D/3D, l'analisi dei dati sSMLM e la ricostruzione delle immagini. Tali strumenti di analisi sono particolarmente adatti a collegare le informazioni di localizzazione spaziale con le letture spettrali nell'imaging spettroscopico a super-risoluzione e potrebbero essere ulteriormente sfruttati in future estensioni di questo protocollo. Infine, questo protocollo è potenzialmente fattibile per altri tipi di macromolecole^biologiche 43,44,45, come RNA, tubulina, ecc. Lo spettro rilevato può essere ulteriormente inserito in modelli computazionali, come i modelli^{di deep learning 46}, per effettuare la classificazione, prevedendo così sequenze o strutture molecolari da spettri intrinseci sotto diverse proprietà di illuminazione e fotofisiche. Questo studio apre anche la strada all'imaging della cromatina specifica e senza marcatori, che evita l'etichettatura esterna o la denaturazione delle strutture native.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro di emissione a 488 nm per l'imaging	Chroma Technology Corp.	ET525/50M
Filtro passa-banda da 532 nm per la calibrazione	Thorlabs	FL532-3
Filtro a emissione da 532 nm per l'imaging	Chroma Technology Corp.	ET620/60M
Filtro passa-banda a 580 nm per la calibrazione	Thorlabs	FB580-10
Filtro passa-banda a 633 nm per la calibrazione	Thorlabs	FL632.8-3
Filtro passa-banda a 680 nm per la calibrazione	Thorlabs	FB680-10
Filtro passabanda a 750 nm per la calibrazione	Thorlabs	FB750-10
Beta-mercaptoetanolo	Sigma	M6250
Buffer di imaging BME	NA	NA	7 & mu; L GLOX, 7 e mu; L Beta-mercaptoetanolo e 690 μ Tampone L glucosio
Catalasi dal fegato bovino	Sigma	C100
DABCO (1,4-di-azobiciclo-(2.2.2.)-Ottano)	Sigma	D27802
Buffer di imaging DABCO	NA	NA	65 mM DABCO+30 mM Solfiti di sodio + 30 mM DTT 1 M  nel DNAsi, acqua deionizzata libera da RNAsi. Il solfito di sodio dovrebbe essere disciolto in PBS 10 e volte; a 1 M prima di realizzare il buffer di imaging.
Deplex del DNA per SMLM spettroscopico	IDT	NA	Coppie a 20 basi doppio filo GC_alter, GC_conti, AT_alter e AT_conti. ad esempio GC_alter ha entrambi i fili da 5' - GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC - 3'; GC_conti ha un filo di 5' - GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG - 3' e l'altro come 5' - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3' Tutti i campioni sono nello standard HPLC.
DNA oligonucleotide/DNA doppio filamento	IDT	NA
Oligos del DNA per SMLM spettroscopico	IDT	NA	20-base A, G, C, T; catena AC a singolo filamento a 40 basi (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20);   guanina monofilamento 5, 8, 12, 16 basi. Ad esempio A10C10 è 5'- AAAAAAAAAACCCCC CCCCCAAAAAAAAAA AACCCCCCCCCCCC - 3' Tutti i campioni sono secondo lo standard HPLC.
Acqua distillata senza DNasi/RNase	Invitrogen	10977015
DTT (DL-Ditiotreitolo)	Sigma	43816
GLOX	NA	NA	14 mg di glucosio ossidasi, 50 e mu; L catalasi (17 mg/ml) + 200 & mu; Il tampone L A, che è di 10 mM Tris (pH 8,0) e 50 mM di NaCl.
Buffer di glucosio	NA	NA	50 mM Tris (pH 8,0), 50 mM di NaCl e 10% di glucosio.
Glucosio ossidasi	sigma	G7141
Glucosio, polvere	Thermo Fisher	15023021
PBS (10X)	Thermo Fisher	J62036. K3
PBS (1X)	Gibco	10010023
Cloruro di sodio	Thermo Fisher	424290010
Solfiti di sodio	Sigma	S0505
Tris (1M) pH 8.0	Invitrogen	AM9856