Articolo metodologico

Procedura accessibile di sigillatura chip-membrana in silicone per un legame flessibile e affidabile

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DOI:

10.3791/69980

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20 marzo 2026

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1Department of Pathology and Medical Biology, EXPIRE Lab, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 2GRIAC Research Institute, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Department of Biomaterials and Biomedical Technology, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Tissue Engineering and Cells Therapy Group (GITTC), School of Medicine, University of Antioquia, Alma Mater Hospital of Antioquia, 5Department of Pulmonary Diseases, University Medical Center Groningen, University of Groningen

In questo articolo

Sommario

Un nuovo protocollo di sigillatura per produrre sigilli impermeabili a base di silicone per membrane di dispositivi a chip polidimetilsilossano (PDMS). Destinato a laboratori, configurazione di modelli di chip e sviluppo di piattaforme chip su piccola scala. Dimostriamo il protocollo utilizzando membrane tissutali plastiche e native. Questa procedura richiede solo PDMS, toluene, muffa, membrana e una camera a vuoto.

Abstract

Le piattaforme organ-on-chip sono un aspetto in rapida crescita della ricerca biomedica. L'espansione di questo campo ha prodotto una gamma di materiali e metodologie diverse per la loro costruzione e applicazione. Sebbene il numero di dispositivi diversi - sia forniti commercialmente che sviluppati in ambito accademico - continui a crescere, di solito resta un grande passo da compiere per i nuovi ricercatori che entrano nel campo dell'organo su chip. Una delle questioni centrali sia nelle tecnologie dei chip innovative che in quelle in corso rimane la produzione di una sigillatura sicura e priva di perdite dei dispositivi a chip. In questo articolo, offriamo un nuovo percorso per lo sviluppo dei chip presentando un flusso di lavoro di sigillatura dei chip che produce connessioni affidabili e stagne tra chips di silicone e membrane a tre colture di materiali diversi. La procedura presentata è accessibile per lo sviluppo di nuovi chip con materiali di input limitati e fornisce un'interfaccia aria-liquido (ALI) Organ-on-Chip. Questi chip sono destinati alla coltura cellulare alimentata attraverso una membrana porosa e esposti apicicamente all'aria, come in un Intestino, Pelle o, come nel caso presentato qui, Airway-on-Chip. Forniamo due diversi design 3D di stampi a chip, che mostrano il loro legame a membrane plastiche commercialmente disponibili così come a impalcature a matrice extracellulare suina (ECM). Questo Airway-on-Chip può essere prodotto internamente; qui vengono presentati i diversi ostacoli che possono incontrare, e una mostra del loro precedente utilizzo come Airway-on-Chip. Questa nuova procedura di sigillatura prevede l'aspirazione di una malta polidimetilsilossano (PDMS) diluita con toluene, per rimuovere il toluene, che porta a un sottile e resistente rivestimento di silicone incorporato nella plastica porosa o nella superficie della membrana ECM nativa. La seconda novità di questa procedura è la polimerizzazione a temperatura ambiente della malta PDMS per prevenire la rottura delle membrane dovuta a differenze termiche tra i materiali sigillati. Questo porta a una tecnica ampiamente applicabile per legare i materiali testati, producendo chip PDMS multi-camera con membrane di coltura internalizzate.

Introduzione

I dispositivi organ-on-chip stanno diventando una pietra miliare della ricerca biomedica, con una vasta gamma di modelli commerciali e ad accesso aperto sviluppati in laboratori di tutto ilmondo. Man mano che questi modelli diventano una parte chiave della ricerca, continuando a sostituire i tradizionali modelli statici in plastica e animali 2,3, è sempre più importante che questi modelli siano facilmente accessibili e accessibili a ricercatori di vari background in tutto il mondo. Al centro di ciò c'è la possibilità di ottenere uno sviluppo personalizzato e in piccoli lotti, indipendentemente dai costi di input e produzione4, specialmente nei modelli non commerciali oaccademici 1.

Una delle maggiori sfide nelle tecnologie On-Chip è ottenere una sigillatura sicura dei chip senza perdite durante il flusso. Una recente revisione sui test di perdita nei dispositivi a chip ha identificato la perdita tra le camere o verso l'ambiente come modalità principale per il fallimento del modello e degli esperimenti, sia nell'industria che nel mondoaccademico 5,6. Ci sono diverse ragioni per il fallimento nel raggiungere una tenuta di successo: le dimensioni ridotte dei dispositivi, il flusso e la pressione applicati, e principalmente il fatto che questi dispositivi sono composti da materiali diversi sigillati insieme a strati e collegati con processidifferenti 6. La gamma di materiali diversi utilizzati come membrane di coltura nelle piattaforme a chip è ampia quanto la loro applicazione, inclusi polietilene tereftalato (PET), policarbonato (PC), PDMS e membraneECM 1. Di conseguenza, esistono numerose procedure e trattamenti diversi per collegare questi materiali ai dispositivi finali. Queste procedure includono la compressione con colla/PDMS, la chimica del silano mediata dal plasma, la funzionalizzazione chimica delle strutture, l'elettrofilatura e il legame con solventi vaporizzati, a seconda dei materiali coinvolti nel modello7. Il fatto che questi processi richiedano competenze e ambienti di laboratorio diversi impone alcuni limiti all'accessibilità accademica della ricerca On-Chip. È stato identificato che, sebbene i costi e le limitazioni dell'impiego in sistemi commerciali limitino l'accesso accademico, i lunghi processi di costruzione dei chip e delle attrezzature necessarie ne limitano lo sviluppo accademicoindipendente 1,8,9. All'avanguardia di questa ricerca, una delle questioni attuali riguarda la standardizzazione e la validazione dei modelli per la loro riproducibilità10,11. Ma rimane una lacuna nel raggiungere questo punto per molti laboratori che cercano di iniziare lo sviluppo dei chip per rispondere a domande di ricerca specifiche, sostituire i lavori sugli animali e lavorare su modelli più biologicamenterilevanti 12.

In questo articolo presentiamo un flusso di lavoro di sigillatura dei chip che richiede solo competenze e attrezzature disponibili nella maggior parte degli ambienti di ricerca. Questa procedura produce interfacce chip-membrana PDMS stagne per tre diversi materiali a membrana. Il processo richiede solo un tempo di lavoro attivo limitato, può essere utilizzato in ambienti di laboratorio senza chip e può essere scalato da produzione di chip a batch di piccole a medie dimensioni.

La procedura di sigillatura presentata può essere eseguita con membrane plastiche porose o ECM; I chip di esempio forniti sono costruiti con questa procedura per l'applicazione come dispositivo airway-on-chip con esposizione all'aria. Questa procedura può essere utilizzata per altri dispositivi comparabili, a condizione che le membrane contengano pori, essenziali per la procedura. L'applicazione principale dei chip forniti è per la coltura ALI e le cellule epiteliali delle vie aeree, ma può essere utilizzata per altre applicazioni e modelli di co-coltura con cellule mesenchimali o intestinali, ad esempio 8,13. Il primo chip fornito è una via aerea standard su chip con un'area di coltura su larga scala (92mm 2) con due camere di coltura, inclusa una camera apicale per l'esposizione all'aria separata da una membrana porosa dalla camera basale che contiene il mezzo e, opzionalmente, un altro tipo di cellula coltivata sommersa (ad esempio, fibroblasti, cellule endoteliali). Per applicazioni ALI, è essenziale che le cellule a seme apicale siano in grado di mantenere una barriera stretta per prevenire la perdita di materiale nel canale superiore. Il secondo chip ha lo stesso design del primo, con due camere aggiuntive ai lati della membrana, qui con l'uso di ECM suino, per facilitare lo stiramento della membrana di coltura tramite l'applicazione di pressione negativa, imitando l'allungamento di una via aerea nativa.

Il nostro processo di sigillatura riunisce diversi elementi del campo dello sviluppo di chip PDMS con l'aggiunta di nuove condizioni, che sono duplici. Innanzitutto, la rapida applicazione del vuoto alla malta PDMS assottigliata con toluene, che previene l'attacco chimico del toluene alle membrane, favorisce l'intrusione del silicone nei pori o nelle caratteristiche superficiali della membrana e porta a una superficie sottile e resistente allo spostamento. Il toluene produce gonfiore e deformazione sulle superfici solide del PDMS, ma ad alte concentrazioni agisce come solvente, da cui il suo utilizzo per diluire il PDMS liquido in questa procedura. Per plastiche come le membrane PC e PET utilizzate qui, il toluene causerà distorsione e crepe da stress se non rimosso rapidamente. È essenziale prestare attenzione, quando si applica manualmente la malta per applicare solo sopra la parete della semi-chip pre-costruita e non farne mai entrare nell'area di coltura, poiché ciò ostruirà i pori delle membrane della coltura e produrrà aree di PDMS che causeranno disturbi e variazioni della capacità di coltura cellulare. In secondo luogo, l'indurimento della malta PDMS a temperatura ambiente (RT) per oltre 72 ore previene lo spostamento della membrana sia dalla semichip che dalla malta della malta a testa, cosa che può avvenire quando i materiali si restringono in diversi gradi dopo l'espansione termica.

Forniamo due modelli di stampi a chip che possono essere realizzati con una stampante 3D o micro-fresatrice (come descritto nel File Supplementare 1, File Supplementare 2), oltre al metodo per creare una malta sottile da PDMS etoluene 14. Utilizzare questo metodo consente la sigillatura di membrane plastiche commerciali (PET, PC) all'interno di un dispositivo. Inoltre, abbiamo testato l'applicabilità di questo processo creando lo stesso chip con una membrana ECM nativa suina per produrre un chip biologico con capacità di allungamento ciclico. Poiché gli Organ-on-Chip sono pensati per replicare le proprietà fisiologiche dell'ambiente in vivo , i Air-Away-on-Chip che hanno la capacità di produrre le forze meccaniche sperimentate nel corpo durante la respirazione, come le tensioni di taglio dovute al flusso d'aria e il paesaggio meccanico delle vie aeree che si stringono, sono altamente rilevanti dal punto di vistabiologico 16. La membrana utilizzata è composta dalla membrana basale, dalla lamina propria, oltre a collagene, laminina e altre proteine della matrice circostante. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo chip nativo basato a membrana, e il primo con la possibilità di allungamento, facilitando così la simulazione dello stress meccanico di, ad esempio, la respirazione, su una membranaECM non siliconica 15. Questa applicazione innovativa evidenzia la funzione della nostra procedura di sigillatura con plastica e ECM. Infine, presentiamo l'applicazione di questa procedura di sigillatura a chip e membrana come Airway-on-Chip che può essere utilizzata per la coltura cellulareALI 8.

Protocollo

Questo studio era esente dall'approvazione del comitato etico ai sensi dell'Experiments on Animals Act poiché i materiali erano stati reperiti post-mortem e nessun animale veniva sacrificato per scopi scientifici (Wet op de dierproeven). Il protocollo di isolamento delle cellule epiteliali primarie delle vie aeree umane è stato seguito dal codice di ricerca del Centro Medico Universitario di Groningen (https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg consultato il 14 gennaio 2025) e dalle linee guida nazionali ed etiche professionali sull'uso del materiale corporeo umano (https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf consultato il 14 gennaio 2025). Questo studio era esentato dal requisito dell'approvazione del comitato etico poiché il tessuto tracheobronchiale era residuo dei trapianti e completamente anonimizzato in conformità con il Codice Civile olandese e la Wet op de orgaandonatie (legge sui donatori).

1. Preparazione della semichip e della membrana

  1. Produzione di chip
    1. Scarica. File di progettazione STL per le metà superiore e inferiore del chip dal File Supplementare 1 e dal File Supplementare 2 di questo articolo. Lo stampo superiore produce una metà scheggiata profonda 5 mm, quello inferiore una metà scheggiata profonda 3 mm; entrambe le due metà dei trucioli hanno camere di coltura profonde da 1 mm. In alternativa, realizza un progetto di chip utilizzando un software CAD appropriato.
    2. Prepara un file a fetta per la stampa 3D oppure un percorso di fresatura per la microfresatura degli stampi a trucio. Gli stampi microfresati saranno pronti all'uso; Gli stampi stampati in resina richiedono due lavaggi a etanolo al 99,9% da 24 ore prima della reticolazione UV per prepararli adeguatamente all'uso come stampo PDMS.
  2. Produzione del chip half PDMS (Figura 1)
    1. Mescola accuratamente la base liquida PDMS con l'agente di polimerizzazione in un rapporto 10:1 e degas in una camera a vuoto finché tutte le bolle d'aria non vengono rimosse.
    2. Riempi gli stampi con una siringa a ugello largo, degas per ~10 minuti in una camera a vuoto finché tutte le bolle non saranno rimosse. Metti le muffe in forno a secco fino a quando non sono stagionate per 2 ore a 65 °C.
    3. Rimuovi le metà di trucioli solidi dagli stampi con un bisturi e taglia la sfaldura dai bordi. Aggiungi quattro prese nella metà superiore a ciascuna estremità della camera e i due anelli adiacenti che indicano la posizione delle prese inferiori con un punzone per biopsia.
      NOTA: Per i risultati presentati, è stato utilizzato un punzone biopsico da 2 mm e sono stati inseriti tubi in silicone da 2 mm per il mezzo e il flusso d'aria durante la coltura. Gli ingressi da 1 mm e 2 mm facilitano la semina delle celle con una pipetta, corrispondenti rispettivamente alle punte da 200 e 1000 μm. Altre dimensioni di punzoni possono essere utilizzate per diversi sistemi di tubi o pompe.
  3. Preparazione della membrana (Figura 2)
    1. Scarica. File di progettazione STL per lo stencil a membrana dal File Supplementare 3 in questo articolo. Prepara lo stencil tramite stampa 3D o un metodo di fabbricazione equivalente per garantire una forma della membrana coerente.
    2. Posiziona lo stencil sopra la membrana PET o PC, tenendola saldamente mentre la membrana viene tagliata con un bisturi.
      NOTA: A questo punto, le membrane possono essere rivestite con proteine della matrice per la coltura cellulare in una piastra di Petri senza interrompere il legame della membrana. Questo garantirà che solo la membrana sia funzionalizzata per la crescita cellulare, lasciando le pareti del PDMS prive di cellule come descrittoin precedenza 8.

2. Legame a membrana

  1. Preparazione del mortaio PDMS
    1. Mescola PDMS liquido (passo 1.2.1) con toluene in un rapporto 7:5 e mescola accuratamente con una siringa su e giù con una siringa a ugello largo come descrittoin precedenza 14. Sono necessarie solo 8 gocce per ogni chip; Si raccomanda 1,4 mL PDMS con 1 mL di toluene per ogni lotto di malta e sufficiente per 8 chip di questa scala. Un collage costante della malta è importante per un legame a membrana affidabile.
      ATTENZIONE: Il toluene è volatile e altamente infiammabile. L'esposizione può causare danni ai sistemi nervoso e respiratorio. Usa esclusivamente in una cappa a pompa, lontano da qualsiasi fonte di accensione, e gestisci le fuoriuscite con materiali assorbenti e ventilazione. Durante la manovrazione, indossa occhiali protettivi per proteggerti dagli schizzi e guanti impermeabili (nitrile). Lascia tutti i materiali di laboratorio (punte di pipetta, contenitori, ecc.) per 24 ore nella cappa dei fumi, dopodiché il toluene sarà evaporato e tutti i materiali potranno essere smaltiti in contenitori approvati e etichettati tramite servizi specialistici per i rifiuti. Non buttare mai il toluene nel lavandino. Consulta la Scheda Dati di Sicurezza (SDS) per ulteriori informazioni.
      NOTA: Preparare la malta al punto d'uso per prevenire l'evaporazione prematura del toluene e la contaminazione da plastica, in un contenitore non in vetro, preferibilmente usa e getta, e gettala direttamente dopo l'uso. Il PDMS polimerizza la superficie del vetro ed è parzialmente inremovibile; Il toluene si dissolve e danneggia la maggior parte delle plastiche comunemente usate in laboratorio.
  2. Attacco alla membrana PET/PC (Figura 2)
    1. Applica rapidamente la malta sulla superficie della semichip PDMS dove la membrana verrà posizionata con una punta di pipetta.
      NOTA: L'intera area sotto la membrana deve essere bagnata con malta. Bisogna applicare una presa salda con la punta per produrre lo strato più sottile possibile. La microscopia indica strati tra 3 e 5 μm.
    2. Tieni la membrana preparata (passo 1.3) a un'estremità con una pinza pulita, posiziona la punta sulla malta umida nella posizione corretta per il truciolo e lascia che la membrana cada al suo posto.
      NOTA: Non permettere alla membrana di spostarsi dopo questo punto; il PDMS umido che entra nella camera produce pareti irregolari e inutilizzabili sulla membrana. Se si verifica uno spostamento, il silicone coprirà l'area della coltura, interrompendo il potenziale di coltura cellulare su entrambi i lati della membrana, scartando la membrana e ripetendo il passaggio precedente.
    3. Tieni delicatamente la membrana in posizione con la pinza e riapplica la malta PDMS sopra la membrana, allontanandoti delicatamente dalla camera ad ogni colpo per rimuovere le bolle e fissare la membrana senza spostarla dalla posizione originale.
      NOTA: Fai attenzione a non applicare il PDMS nell'area di coltura interna della membrana; Questo è essenziale poiché il silicone impedisce l'adesione cellulare e disturba la superficie naturale della membrana della coltura.
    4. Posiziona le metà di trucioli con membrane subito dopo l'attacco della malta umida in una camera a vuoto e induriscile a temperatura ambiente sotto 25 mBar di vuoto per 72 ore.
      NOTA: Le metà di truciolo con membrane attaccate devono essere polimerizzate a temperatura ambiente. PET/PC e PDMS sperimentano diversi gradi di espansione termica, e il caldo induisce il silicone a espandirsi e poi a restringersi durante il raffreddamento, producendo una membrana gonfia (Figura 3).
  3. Costruzione completa del chip
    1. Le due metà del chip legato a membrana possono ora essere attaccate alla seconda metà del chip. Per risultati più coerenti, esponi entrambe le metà al trattamento con plasmaO2 (320 mBar, 30 s) e premile rapidamente insieme a mano sotto una leggera pressione.
      ATTENZIONE: I forni al plasma di ossigeno producono ambienti saturi di ossigeno, ossidi pericolosi come l'ozono e intensi radiazioni UV. I forni dovrebbero essere installati in un'area ben ventilata o con una cappa a pompa. La finestra del forno dovrebbe bloccare tutte le radiazioni UV, ma si consigliano gli occhiali protettivi. I materiali combustibili e i metalli devono essere tenuti fuori dall'area del plasma di ossigeno per prevenire combustione accelerata o rilascio di fumi tossici. Fare riferimento al documento SDS del plasma di ossigeno è essenziale per l'uso con qualsiasi materiale diverso da quelli menzionati in questo protocollo.
      NOTA: Se non è disponibile un forno al plasma, un legame simile può essere ottenuto con una lancia al plasma oppure applicando malta PDMS sulla seconda metà e indurendo insieme le due metà a temperatura ambiente sotto leggera compressione per 72 ore13. Sebbene meno efficaci rispetto a un forno al plasma O2 completo, queste opzioni possono essere utilizzate anche quando i forni non sono disponibili.

Risultati

Test di integrità della guarnizione della membrana
Per verificare l'integrità del trucio sigillato, la camera superiore di coltura viene riempita con demi-acqua con colorante blu, e la parte inferiore con demi-acqua pura. I trucioli vengono lasciati tutta la notte per valutare la possibile perdita di colorante blu dalla camera superiore attorno alla membrana alla camera inferiore.

I trucioli di silicone completamente costruiti preparati con il nostro metodo possono essere deformati longitudinalmente fino a 35° senza comprometterne l'integrità della membrana, ora racchiusi e legati alla metà superiore con malta PDMS flessibile su entrambi i lati. La deformazione dei chip PDMS è una parte normale dell'uso, ad esempio, quando le metà o i chip si attaccano a una piastra di Petri.

I chip erano collegati a un sistema bidirezionale di pompa di siringhe per testarne le prestazioni con la pressione indotta dal flusso. I chip con membrane PET e PC possono essere utilizzati senza perdite tra camere o rottura dei chip fino a e inclusa 30 kPa (la pressione massima fornita dalle pompe). In studi precedenti, i chip sono normalmente azionati a 150 μL/h, esercitando una pressione di 0,7 Pa sulle camere di ciascundispositivo 8.

Visualizzazione del legame a membrana
Per visualizzare l'intrusione della malta liquida PDMS nei pori a 0,4 μm della membrana sotto il microscopio a seguito della sigillatura sottovuoto RT, la malta PDMS è stata tinta con Rosso del Nilo. Il Nile Red è stato scelto perché è un colorante idrofobo e si mescola bene con il PDMS nella sua forma liquida. La colorazione è stata preparata mescolando accuratamente l'1% di Rosso del Nilo in PDMS liquido per ottenere un colore rosso sotto microscopia optica. La procedura di polimerizzazione RT è stata ripetuta come descritto sopra. Le membrane con malta tinta venivano incorporate nella paraffina e sezionate tramite un microtomo. Le fette a membrana venivano montate su vetrine di vetro e fotografate con un microscopio lucico (Figura 4). Per convalidare la necessità sia di assottigliare il PDMS in malta con toluene sia di applicare un vuoto per l'intrusione del PDMS nei pori della membrana, un confronto tra membrane con e senza questi metodi può essere visto nella Figura Supplementare 3.

Test di Vitalità Cellulare
In uno studio precedente è stata testata la potenziale tossicità chimica derivante dall'uso del toluene nella costruzione dei dispositivi. I chips sono stati preparati con e senza toluene in una mortaia PDMS, le cellule epiteliali di Calu-3 dell'adenocarcinoma polmonare umano sono state cresciute fino alla confluenza in 2 giorni e coltivate per 1 giorno nei chips come descrittoin precedenza 8. La morte cellulare è stata valutata tramite colorazione blu con Trypan, rimuovendo tutte le cellule dal dispositivo e contando le cellule morte (blu) contro le cellule vitali non colorate. La proliferazione è stata valutata incubando i reagenti nel mezzo del chip prima di eseguire un saggio AlamarBlue, leggendo l'assorbimento fluorescente tramite lettore di lastre, che riflette la proliferazione (Figura 5)8.

Attacco della membrana del basamento ECM
Per dimostrare l'applicabilità generale di questa procedura nel produrre un legame forte e flessibile con una gamma di membrane, il protocollo è stato ripetuto con una membrana completamente a matrice extracellulare (ECM) (Figura 6). Una membrana basale contenente impalcature ECM è stata preparata da vesciche urinarie suine come descritto primadel 17. In breve, le vesciche urinarie suine di animali femmine tra i 4 e gli 8 mesi sono state prelevate in un mattatoio locale (Kroon Vlees b.v., Groningen, Paesi Bassi) e processate entro 3 ore dalla preleva. Il tessuto connettivo e il grasso sono stati rimossi dalla vescica, la vescica è stata capovolta al contrario e lo strato epiteliale è stato smussato, mantenendo il tessuto nel PBS a temperatura ambiente. I pontifici ECM sono stati disidratati per la procedura di attacco allamembrana 17. Le impalcature preparate venivano tagliate e legate alle due parti del chip PDMS come descritto nel protocollo sopra. È stato prodotto un nuovo stampo con camere aggiuntive per l'allungamento della membrana all'interno del dispositivo, per dimostrare che i legami in silicone sottovuoto possono anche sopportare sforzi meccanici orizzontali (File Supplementare 2).

Test di integrità della membrana ECM
Il test di integrità della sigillatura a membrana è stato condotto come sopra. Successivamente, il chip di stretching veniva collegato a pompe di siringa, che aspiravano un vuoto nelle camere laterali del dispositivo per produrre 1 mm di allungamento orizzontale sulla membrana ECM durante la notte (Figura 7).

Differenziazione delle cellule epiteliali e co-coltura di fibroblasti nella Airway-on-Chip standard con membrana PET
Per validare le prestazioni del chip fornito come Airway-on-Chip per cellule ALI, cellule epiteliali di Calu-3 del polmone umano (ATCC, Manassas, VA, USA) sono state coltivate fino alla confluenza ed esposte all'aria nel dispositivo, in uno studioprecedente 8. Dopo 10 giorni di esposizione all'aria apicale, si può vedere che le cellule epiteliali di Calu-3 si differenziano in cellule produttrici di muco, dimostrato dalla produzione di muco, misurata dalla colorazione blu alciana (Figura 8)8.

Per convalidare la nostra procedura per flusso senza perdite prolungati e co-cultura, un esempio può essere riportato in una pubblicazione precedente; Per la metodologia completa della coltura cellulare, vedi l'articolo8. Le cellule epiteliali delle vie aeree umane sono state coltivate nella camera di coltura apicale del chip sotto flusso d'aria costante per 21 giorni, con i fibroblasti primari delle vie aeree colti a testa in giù sul lato opposto della membrana. In breve, le cellule epiteliali primarie delle vie aeree sono state isolate tramite trattamento proteasi (0,2 mg/mL in HBSS, 2 ore, 37 °C), raschiamento cellulare e crioconservazione di cellule prelevate dal tessuto tracheobronchiale residuo di 3 donatori polmonari sani, dai quali non erano disponibili ulteriori informazioni. I fibroblasti delle vie aeree (AF) umani sono stati isolati allo stesso modo dal tessuto bronchiale del tessuto polmonare di BPCO trapiantato da un singolo donatore.

Nella Figura 9, si può vedere un grafico del chip e di come appaiono le celle sopra menzionate sia attraverso che lungo le camere del dispositivo.

Coltura di cellule epiteliali in co-coltura con fibroblasti sulla membrana ECM
L'impalcatura basale che contiene la membrana facilita la coltura cellulare epiteliale e mesenchimatica. I cheratinociti umani immortalati (cellule HaCaT) sono stati seminati a una densità di 60 x 103 cellule/cm2 sul lato epiteliale (interno) della membrana, e la vitalità era del 95% dopo 24 ore rispetto al 91% in una fiaschetta di coltura cellulare in plastica (Figura 10A). Successivamente, fibroblasti MRC-5 polmonari umani normali sono stati seminati a una densità di60 x 10 3 cellule/cm2 sul lato stromale (esterno) e coltivati in cocoltura con le cellule HaCat per 14 giorni per valutare la vitalità epiteliale-mesenchimale a lungo termine per la co-coltura sulla membrana ECM nativa (Figura 10D). Le cellule epiteliali formavano uno strato monofluente confluente sul lato interno della membrana, mentre i fibroblasti si distribuivano meno densamente sulla superficie esterna della membrana ECM ma mantenevano la loro caratteristica morfologia simile a fuso (Figura 10C). Il video di ricostruzione 3D può essere visto nel Supplement File 417.

L'attuale studio ha presentato una procedura migliorata di sigillatura a membrana che produce una forte connessione PDMS-membrana, capace di resistere a interruzioni causate dalla maneggiamento manuale del chip e di consentire una coltura a lungo termine sotto flusso utilizzando pressioni fino a 0,7 Pa. Abbiamo dimostrato che queste membrane sono legate da silicone che ha penetrato le membrane della coltura attraverso i loro pori, facilitando i legami covalenti di silano tra le due metà del chip e la malta PDMS sottovuoto. Inoltre, la procedura presentata non induce citotossicità, a condizione che la malta venga applicata correttamente. Inoltre, i chips prodotti hanno facilitato co-colture epiteliali mono- e epiteliali-mesenchimali a lungo termine. Sebbene questa procedura sia applicabile solo alle membrane porose, rimane una procedura a basso input per la produzione di chip ALI affidabili e pronti per la coltura cellulare.

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Figura 1. Grafica della produzione di chip half PDMS e della preparazione della membrana. Per la produzione a chip half di PDMS (passo 1.2), gli stampi a trucioli vengono riempiti con PDMS liquido con una siringa a ugello largo, 4,4 mL nello stampo superiore e 2,4 mL nello stampo inferiore. Le due metà del PDMS vengono stagionate per 2 ore a 65 °C, dopo di che si perforano 4 prese nella metà superiore della camera e i punti indicati nello stampo. Per la preparazione della membrana (passo 1.3) lo stencil stampato della membrana viene tenuto saldamente sulla superficie della membrana. Usando una nuova lama, si taglia intorno allo stencil e si rimuove la membrana a scheggiatura dal materiale circostante. Le membrane possono essere rivestite per la coltura cellulare o utilizzate direttamente nel secondo passaggio. Creato in BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Procedura di legame della membrana. La malta PDMS viene miscelata come descritto sopra immediatamente prima dell'uso. La malta viene gocchiata sui quattro angoli intorno alla camera di coltura e distribuita delicatamente intorno al punto di legame della membrana con l'estremità inclinata di una pipetta. Un'estremità della membrana viene posizionata sulla malta e, una volta allineata con la camera di coltura, viene lasciata delicatamente cadere in posizione. La malta viene riapplicata a goccia e dipinta sui bordi della membrana con grande attenzione a non permettere a alcun silicone di toccare la superficie della membrana all'interno dell'area di coltura. Le membrane legate a mezzi chip vengono immediatamente inserite in una camera a vuoto per rimuovere le microbolle, garantire l'invasione del silicone nella superficie e nei pori e rimuovere il toluene per minimizzare l'attacco chimico sulla membrana. Creato in BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Esempi di posizionamento delle membrane. (A) Collocamento riuscito della membrana, induritura a RT. (B) Legame della membrana indurito in forno (65 °C invece che a RT), la membrana si è vista essersi distesa nella camera mentre il silicone si contraeva dopo il riscaldamento. (C) Chip completi con la corretta posizione della membrana PET e PC. (D) Una posizione errata della membrana farà cambiare il volume di ciascun lato del chip con il movimento della membrana, causando flusso variabile e applicando stress alle celle all'interno del chip così come alle pompe collegate al chip. Creato in BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. Immagini al microscopio luce di membrane di PET e PC tagliate e montate. Mostrando l'invasione del silicone nei pori della membrana come risultato della nostra procedura di cura RT al vuoto. (A) Immagini della stessa membrana senza PDMS applicato alla membrana, pori chiari, così come una superficie pulita nell'immagine polarizzata. (B) La malta PDMS è stata macchiata con il Rosso del Nilo, e il silicone si può vedere in magenta che ha invaso con successo i pori e ricoperto sottilmente la superficie sotto vuoto. Evidenziato in forme bianche/magenta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. La vitalità delle celle nei dispositivi a chip non è stata alterata dalla costruzione con o senza toluene come agente diluente nella malta PDMS. Le cellule di Calu-3 sono state seminate a 6,5 × 104 cellule per chip e, al raggiungimento della confluenza, sono state incubate durante la notte prima che venisse eseguito un saggio AlamarBlue sul soprandanante e TrypanBlue sulle cellule. Le differenze tra i gruppi (n=4) preparati con e senza toluene sono state testate con il test t di Student non accoppiato, p > 0,05 = ns (non significativo)8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6. Chip di membrana del seminterrato. (A) L'integrità della membrana è fallita poiché la malta PDMS/toluene non è stata aspirata abbastanza rapidamente; ciò ha danneggiato le proteine della matrice e interrotto la sigillatura dei chip. (B) La sigillatura a membrana e a truciola è riuscita, ma la membrana è stata sigillata in uno stato allentato. (C) Sigillatura a membrana e trucigliatura riuscita, il chip è funzionale per il flusso e lo stretching. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7. Due immagini del chip ECM sotto stretching. (A) Scheggiatura a riposo. (B) Scatola sotto 1,2 mm di allungamento orizzontale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8. Colorazione Alcian Blue (Nuclei in magenta, muco in blu) delle cellule epiteliali Calu-3 polmonari umane cresciute nei chips dopo l'esposizione all'aria nel dispositivo. Le cellule di Calu-3 sono state cresciute fino alla confluenza e coltivate per 10 giorni con una portata continua di 150 μL/h nel compartimento basale ed esposte a media o aria dal lato apicale. Il flusso è stato prodotto con una pompa peristaltica all'interno di un incubatore a 37 °C e 5% diCO2. Al termine della coltura, le membrane venivano rimosse e colorate. Vista trasversale della colorazione Alcian Blue di cellule di Calu-3 coltivate per 10 giorni immerse (A) e esposte all'aria (B)8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9. Visualizzazione delle cellule epiteliali umane primarie e dei fibroblasti in co-coltura estesa all'interno del dispositivo. I fibroblasti delle vie aeree venivano inseriti nel dispositivo e lasciati attaccarsi durante la notte prima di invertirlo e seminare cellule epiteliali dall'altro lato della membrana. Le cellule sono state cresciute fino alla confluenza, esposte all'aria e coltivate per 21 giorni sotto una portata continua di 150 μL/h prodotta con una pompa peristaltica all'interno di un incubatore a 37 °C e al 5% diCO2. Le membrane sono state rimosse dopo la coltura, fissate, incorporate e montate su vetrini prima della tintura. Le cellule epiteliali sono state colorate per Mucin 5AC (MUC5AC)18, un componente del muco, e per la proteina forkhead box J1 (FOXJ1)19, un fattore di trascrizione coinvolto nella segnalazione per la produzione di cilli. I fibroblasti sono stati colorati con agglutinina germinale del grano (WGA) per visualizzare i bilayer cellulari fosfolipidi. Le cellule sono state incubate con 5 μg/mL in HBSS per 15 minuti e lavate tre volte con PBS prima dell'imaging. Tutti i nuclei cellulari sono stati visualizzati con DAPI. (A) Vista della sezione trasversale: prodotta da una proiezione a Z-stack di immagini di (B) e (C). (B) Colorazione epiteliale MUC5AC/FOXJ1/DAPI su una membrana a chip. (C) Struttura esterna completa dello strato fibroblastico nella camera basale8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10. Viabilità cellulare e cocoltura sull'impalcatura della membrana basale. (A) la vitalità viva/morta delle cellule HaCaT seminate sul lato epiteliale, sono stati testati 3 campioni indipendenti, sono stati catturati 3 campi casuali da ciascun campione (n = 3). È stato eseguito un test ANOVA unidirezionale ordinario con la correzione di Tukey. Il grafico mostra la media con la deviazione standard. Cocultura di (B) cellule HaCaT sul lato epiteliale e (C) fibroblasti polmonari MRC-5 sul lato stromale dell'impalcatura contenente membrana basale circondata da fibre di collagene, le barre di scala sono a 50 μm. (D) Vista 3D della cocoltura dalle viste isometriche dall'alto e dal basso, le barre di scala sono 100 μm, la visualizzazione animata si trova nella Figura Supplementare 4. (E) Spessore dell'impalcatura della membrana basale prima e dopo la decellularizzazione, sono state misurate 14 mucose e da queste 6 (rappresentate da triangoli) sono state prelevate per la decellularizzazione. In ciascuno dei campioni sono stati scansionati tre campi casuali e almeno 10 punti per campo eranomisurati 17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1. Progetti di stampi per trucioli per le parti superiore e inferiore del chip standard PET/PC. (A) Immagine dello stampo inferiore del chip che può essere prodotto dal . STL nel Fascicolo Supplementare 1. (B) Immagine dello stampo superiore del chip che può essere prodotto dal . STL nel Fascicolo Supplementare 2. (C) Immagine dello stencil a membrana per il taglio delle membrane per il chip che può essere prodotto dal . STL nel Fascicolo Supplementare 3. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 2. Design di stampi per trucioli per le parti superiore e inferiore del chip a membrana ECM allungata. (A) Immagine dello stampo inferiore del chip che può essere prodotto dal . STL nel Fascicolo Supplementare 4. (B) Immagine dello stampo superiore del chip che può essere prodotto dal . STL nel Supplementare File 5. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 3. Validazione della procedura di sigillatura: confronto dell'intrusione del PDMS nei pori senza toluene per abbassare la viscosità della malta e polimerizzata a RT senza vuoto. Tutte le condizioni sono legate alle membrane PET (pori di 0,4 μm); dopo il trattamento con PDMS (Nilo Red 1%), le membrane sono state incorporate nella paraffina prima del montaggio e dell'imaging al microscopio luminoso. (A) PDMS non diluito aspirato su una membrana PET. Sulla superficie della membrana si può vedere uno spesso strato di PDMS, mentre nessun PDMS è entrato nei pori (evidenziato da scatole bianche). (B) Malta PDMS diluita aspirata su una membrana PET. Un strato di PDMS è visibile sulla superficie della membrana, mentre nessun PDMS è entrato nei pori (evidenziato da scatole bianche). (C) Malta PDMS assottigliata aspirata su una membrana PET. Un sottile strato di PDMS è visibile sulla superficie della membrana, così come l'intrusione nei pori lungo la membrana (evidenziato da scatole bianche). Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 4. 3D visualizzazione delle cellule di co-cultura HaCat (epiteliali) e MRC-5 (stromali) sull'impalcatura ECM suina. Una vista animata 3D della cocultura dalle viste isometriche dall'alto e dal basso, le cui immagini possono essere viste nella Figura 10D, le barre in scala sono di 100 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1. 3D . File STL dello stampo inferiore. Lo stampo può essere utilizzato per produrre la metà inferiore del chip standard tramite stampa 3D o un metodo di fabbricazione equivalente. Clicca qui per scaricare questo File.

File supplementare 2. 3D . Lime STL dello stampo superiore. Lo stampo può essere utilizzato per produrre la metà superiore del chip standard tramite stampa 3D o un metodo di fabbricazione equivalente. Clicca qui per scaricare questo File.

File supplementare 3. 3D . Fascicolo STL dello stencil a membrana. Lo stencil può essere utilizzato per produrre membrane della dimensione corretta per il chip fornito e può essere prodotto tramite stampa 3D o un metodo di fabbricazione equivalente. Clicca qui per scaricare questo File.

File supplementare 4. 3D . Lime STL dello stampo inferiore del truciolo di stretching. Lo stampo può essere utilizzato per produrre la metà inferiore del chip di stretching tramite stampa 3D o un metodo di fabbricazione equivalente. Clicca qui per scaricare questo File.

Fascicolo supplementare 5. 3D . Lime STL dello stampo superiore del truciolo elasticizzato. Lo stampo può essere utilizzato per produrre la metà superiore del chip stretch tramite stampa 3D o un metodo di fabbricazione equivalente. Clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

Il protocollo di sigillatura dei chip che forniamo qui rappresenta un nuovo modo per produrre sigilli a membrana PDMS impermeabili, validi per la coltura a lungo termine in fermento, che possono essere realizzati con attrezzature limitate e che non richiedono competenze specializzate per essere affrontati. Mostriamo la procedura per produrre wafer a chip con membrane (PET, PC, ECM) legate alla superficie con malta al silicone, e mostriamo che l'applicazione rapida del vuoto facilita l'intrusione del PDMS nei pori e attraverso la superficie delle membrane plastiche. Mostriamo inoltre che i chip risultanti sono ben sigillati e capaci di una vasta gamma di applicazioni in coltura.

Esistono diversi modi per affrontare il legame PDMS-plastica, una strategia comune di legame dovuta alle proprietà beneficie per la coltura cellulare del PDMS, come la permeabilità o la modellabilità ai gas, e le membrane plastiche per la loro vitalitàin coltura cellulare 7. Questi includono l'attivazione superficiale con plasmaO2 , il trattamento con corona o ozono, che facilita la formazione di legami covalenti tra silicone evetro 20. Altrimenti, tecniche di incollaggio chimico che utilizzano organosilani come APTES ((3-Aminopropil)trietossisilano) o MPTMS ((3-mercaptopropil)trimetossisilano) servono a funzionalizzare la superficie dei due materiali aggiungendo gruppireattivi 21. In alternativa, i PDMS e i substrati plastici possono essere incollati con un metodo adesivo che coinvolge resina epossidica o altriadesivi 22. Presentiamo un ibrido tra attivazione superficiale e incollamento chimico, con l'uso di membrane porose e vuoto per produrre una connessione fisica attraverso la membrana che può essere legata solo tramite l'attivazione superficiale del plasmaO2 . Assottigliando il PDMS con toluene, consentiamo l'invasione del PDMS attraverso i pori di una membrana in sottovuoto, il che consente di legare covalentemente diverse membrane tramite legami PDMS-PDMS tra le due parti del chip e la membrana immersa nella morta. Producendo una rete fisica in silicone attraverso questi pori, evitiamo la necessità di trattamento chimico superficiale o di calore e pressione forniti da una macchina di rilievo a caldo, che spesso aiuta questetecniche 23.

Nello studio attuale, è fornito un chip su larga scala a due camere (File Supplementare 1) che può avere una gamma di funzioni. In secondo luogo, un chip capace di allungamento orizzontale ciclico (File Supplementare 2). Questi dispositivi funzionano come Airway-on-Chip, mentre il modello può essere usato anche come gut-on-chip, come mostratoin precedenza 13. Principalmente, viene fornita una guida passo dopo passo con diverse opzioni per la produzione di stampi, la preparazione della membrana e la costruzione dei chip, che potrebbero essere applicate a ulteriori piattaforme di chip innovative in base all'applicazione desiderata dai ricercatori. Si consiglia di utilizzare un forno al plasmaO2 per la sigillatura finale. Tuttavia, un dispositivo portatile al plasma o la compressione manuale con morta PDMS si è dimostrato anch'esso efficace per questo step24. In questo protocollo per questa procedura di sigillatura, sono stati evidenziati ostacoli e specifiche chiave in ogni punto. Questi includono l'opzione di pre-rivestire le membrane, l'importanza dell'uso immediato della malta PDMS/toluene, l'importanza che la malta non entri nell'area di coltura e quanto sia essenziale che la membrana non si muova dopo il collegamento con la malta.

La riproduzione di questa procedura di sigillatura è stata ripetutamente eseguita dagli investigatori con un protocollo scritto; Solo le seguenti chiarimenti sono state necessarie per un sigillamento riuscito al secondo tentativo. A caso di perdite durante test di stress o colture cellulari prolungate, si possono esplorare alcune opzioni. Innanzitutto, il ricercatore dovrebbe assicurarsi che la malta sia preparata fresca con liquido PDMS che non ha ancora iniziato a indurire e sia ben mescolata con toluene. La bassa viscosità della malta è ciò che permette uno strato sottile e liscio che può fluire nei pori della membrana mentre l'aria viene aspirata. In secondo luogo, si dovrebbe applicare abbastanza malta da coprire l'intero fondo e superiore della membrana; se troppa malta la farà fluire nell'area di coltura sotto compressione, troppo poco lascerà spazi che permettono una via di fuga tra camere. In terzo luogo, le membrane devono essere piatte prima e durante l'attacco. Infine, nonostante lo sforzo manuale richiesto, i trucioli devono rimanere in gran parte privi di sporco per garantire un legame finale totale, quindi lavorare in modo rapido e pulito è essenziale.

Sebbene in questo articolo abbiamo mostrato l'attacco di tre diversi tipi di membrane porose, la funzione di questo metodo per altre membrane non può essere prevista. Questo perché diverse resistenze chimiche al toluene, così come altre densità e dimensioni dei pori, influenzeranno l'esito di questa procedura di sigillatura. Tuttavia, mostriamo la prima legame a membrana completamente basata su ECM, che suggerisce un'elevata versatilità del protocollo. Tuttavia, la consistenza delle prestazioni di stretching non è stata verificata in modo affidabile, poiché diverse regioni delle membrane basale, organi e fonti produrranno differenze meccaniche. Inoltre, la vitalità per la coltura cellulare delle membrane ECM è soggetta a variazioni nel tempo, sia in coltura che inconservazione 19. Sebbene questa procedura funzioni per membrane e scheggiature diverse, richiede che la verniciatura manuale della malta sia efficace, il che richiede relativamente poco tempo ma avrà più successo con modelli su scala più grande come quelli che forniamo. Infine, mentre il processo di legame a membrana richiede solo PDMS, toluene, una membrana e una camera a vuoto, la sigillatura finale del chip dipende dall'applicazione del plasmaO2 , che non è universalmente disponibile.

Nonostante le limitazioni, il protocollo fornito è innovativo e non richiede competenze specializzate per essere avvicinato. Per quanto ne sappiamo, la produzione di reti in silicone attraverso i pori della membrana tramite l'aspirazione della malta PDMS a bassa viscosità è la prima del suo genere. A differenza di altri ponti funzionali chimici o meccanici tra i diversi materiali alla base di un chip funzionale, questa soluzione è possibile nella maggior parte degli ambienti di laboratorio.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal consorzio Precision Medicine for More Oxygen (P 4O2) e da finanziamenti da Stichting Proefdiervrij. La mia più profonda gratitudine a Isadora Kraguljac per l'idea di utilizzare la tinta Nile Red, che si sarebbe mescolata con il PDMS per la visualizzazione delle reti in silicone, e a Marjan Reinders-Luinge per il suo talentuoso taglio e montaggio delle membrane. Gli autori esprimono il loro più profondo ringraziamento al dipartimento di Analisi Farmaceutica e a Sabeth Verpoorte per aver fornito accesso al loro Forno al Plasma a Ossigeno, il processo non sarebbe stato possibile senza di esso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 2mL a nazzel largoBD Emereld307727
Punzone per biopsia da 2mmMedicina KAIBP-20F
Linea cellulare Calu-3ATCCHTB-55RRID:  CVCL_0609
HBSS (Soluzione salina bilanciata di Hanks)Gibco14170112
O2 Forno al plasmaHarrick PlasmaPDC-002
Membrane di coltura cellulare incise a traccia PCipCELLCULTURE1000M25/620N403/47
Membrane di coltura cellulare incise con traccia PETipCELLCULTURE2000M23/610N403/47
Base e agente polimerico in elastomero in silicone Polydimetilsilossane/Sylgard 184Dow CorningDOWC25100445
Polimetilmetacrilato (8mm)ColltecN/A
Resina fotopolimerica standard (grigia)(1kg)ElegooN/A
TolueneMerck 1,08,325
Camera a vuotoFisherScientific12080253

Riferimenti

  1. Ugodnikov, A., Persson, H., Simmons, C. A. Bridging barriers: advances and challenges in modeling biological barriers and measuring barrier integrity in organ-on-chip systems. Lab Chip. 24 (13), 3199-3225 (2024).
  2. Singer, M., Akhtar, A. With What Should We Replace Nonhuman Animals in Biomedical Research Protocols. AMA J Ethics. 26 (9), E701-E708 (2024).
  3. Reardon, S. Beyond lab animals. Science. 389 (6761), 676-679 (2025).
  4. Qiu, J., Li, J., Guo, Z., Zhang, Y., Nie, B., Qi, G., et al. 3D Printing of Individualized Microfluidic Chips with DLP-Based Printer. Materials (Basel). 16 (21), 6984(2023).
  5. Survey on reliability of microfluidics-based devices and components. , The Microfluidics Association. https://microfluidics-association.org (2025).
  6. Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. , (2022).
  7. Nahak, B. K., Mishra, A., Preetam, S., Tiwari, A. Advances in organ-on-a-chip materials and devices. ACS applied bio materials. 5 (8), 3576-3607 (2008).
  8. Rae, B., Vasse, G. F., Mosayebi, J., van den Berge, M., Pouwels, S. D., Heijink, I. H. Development of a Widely Accessible, Advanced Large-Scale Microfluidic Airway-on-Chip. Bioengineering (Basel). 12 (2), 182(2025).
  9. Nizamoglu, M., Joglekar, M. M., Almeida, C. R., Larsson Callerfelt, A. K., Dupin, I., et al. Innovative three-dimensional models for understanding mechanisms underlying lung diseases: powerful tools for translational research. Eur Respir Rev. 32 (169), 230042(2023).
  10. Piergiovanni, M., Leite, S. B., Corvi, R., Whelan, M. Standardisation needs for organ on chip devices. Lab Chip. 21 (15), 2857-2868 (2021).
  11. Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. 10, 958582(2022).
  12. Cameron, T. C., Randhawa, A., Grist, S. M., Bennet, T., Hua, J., Alde, L. G., et al. PDMS Organ-On-Chip Design and Fabrication: Strategies for Improving Fluidic Integration and Chip Robustness of Rapidly Prototyped Microfluidic In Vitro Models. Micromachines (Basel). 13 (10), 1573(2022).
  13. Rae, B., Bood, V., Dijk, H. J., Vasse, G. F., Melgert, B. N., Nagelkerke, A., et al. Interorgan Communication Between Lung and Colorectal Epithelial Cells Studied Using a Novel Multi-Organ-On-Chip System. Compr Physiol. 15 (5), e70051(2025).
  14. van der Helm, M. W., Odijk, M., Frimat, J. P., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C. T., van den Berg, A., et al. Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance. J Vis Exp. (127), e56334(2017).
  15. Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Mater Today Bio. , (2022).
  16. Nawroth, J. C., et al. Breathing on chip: Dynamic flow and stretch accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. Materials Today Bio. 21, 100713(2023).
  17. Ramirez, J. A., Estrada, S., Harmsen, M. C., Sharma, P. K. Development of an in vitro platform for epithelial-stromal interactions: A basement membrane-containing scaffold from decellularized porcine bladders. Matrix Biol Plus. 26, (2025).
  18. Bonser, L. R., Erle, D. J. Airway mucus and asthma: the role of MUC5AC and MUC5B. Journal of clinical medicine. 6 (12), 112(2017).
  19. Yu, X., et al. Foxj1 transcription factors are master regulators of the motile ciliogenic program. Nature genetics. 40 (12), 1445-1453 (2008).
  20. Lu, C. Surface modification of polyimide fibers for high-performance composite by using oxygen plasma and silane coupling agent treatment. Textile Research Journal. 92 (23-24), 4899-4911 (2022).
  21. Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. F. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
  22. Borók, A., Kristóf, L., Attila, B. PDMS bonding technologies for microfluidic applications: A review. Biosensors. 11 (8), 292(2021).
  23. Tang, L., Nae, Y. L. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab on a Chip. 10, 1274-1280 (2010).
  24. Young, A. T., et al. Simple design for membrane-free microphysiological systems to model the blood-tissue barriers. Organs-on-a-Chip. 5, 100032(2023).

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