Test riproducibile di migrazione del glioblastoma 3D con localizzazione sferoide mediata da nanoparticelle magnetiche in condizioni ipossiche

Sommario

Presentiamo un modello di migrazione del glioblastoma 3D utilizzando gliomasfere magnetiche derivate dal paziente generate da tumori appena diagnosticati e ricorrenti. Questa piattaforma consente la visualizzazione delle dinamiche migratorie specifiche del paziente e la valutazione dell'efficacia terapeutica. Il saggio può essere multiplexato dopo la migrazione per valutare la localizzazione e i modelli di espressione delle proteine.

Abstract

Descriviamo un saggio di migrazione 3D riproducibile per modellare il potenziale migratorio e invasivo delle glioblastome gliomasferiche derivate dal paziente da tumori appena diagnosticati e ricorrenti in condizioni ipossiche clinicamente rilevanti. Le gliomasfere di dimensioni uniformi vengono trasferite su uno strato sottile di matrice extracellulare e co-colte con nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro, che ne consentono la localizzazione centralizzata all'interno dei pozzi di coltura tramite il posizionamento su un supporto per placche magnetiche. L'inclusione di nanoparticelle di ossido di ferro magnetico durante la semina facilita un'imaging precisa e localizzata delle gliomasfere derivate da singoli pazienti tramite una lieve forza magnetica e ottimizza le pipeline di elaborazione automatica delle immagini riducendo la variabilità posizionale. Questo saggio supporta uno studio dettagliato del comportamento migratorio del glioblastoma in un microambiente fisiologicamente rilevante e consente il confronto diretto tra potenziale invasivo e comportamento migratorio tra gliomasfere di nuova diagnosi e ricorrenti derivate da pazienti. Il metodo è compatibile con l'imaging a cellule vive e l'analisi multiplexata, offrendo una piattaforma scalabile per l'indagine preclinica sulla migrazione del glioblastoma, il potenziale invasivo e la risposta terapeutica.

Introduzione

Il glioblastoma rimane una delle sfide più significative in neurooncologia. Questa malattia è guidata da un'ampia eterogeneità tra e intra i pazienti, una robusta evasione della risposta agli standard di cura, la resistenza all'induzione apoptotica e una notevole plasticità in risposta alle condizioni^ambientali. Più recentemente, la complessità del microambiente tumorale (TME) ha attirato notevole attenzione, in particolare la natura dinamica delle cellule staminali gliomatiche (GSC), che possono cambiare fenotipo e stato cellulare in risposta ai cambiamenti^{microambientali 2,3}. Questa plasticità fenotipica favorisce la progressione tumorale e contribuisce a una recidiva inevitabile nonostante un trattamento aggressivo e standard di prima linea. La resezione chirurgica rimane l'intervento più efficace per migliorare la prognosi del paziente, tuttavia, a causa della natura altamente infiltrativa e microscopica del glioblastoma, la rimozione completa del tumore non è^{realizzabile 4}. Modellare la dinamica invasiva dei campioni di pazienti in vari stadi di malattia e in condizioni specifiche del tumore faciliterà una comprensione più profonda della capacità dinamica e plastica della migrazione del glioblastoma e quindi aiuterà a identificare approcci terapeutici innovativi^{efficaci 5}. Pertanto, sviluppare modelli fisiologicamente rilevanti che catturino dinamiche specifiche di invasione e migrazione dei pazienti è essenziale per migliorare la ricerca preclinica e portare avanti questi obiettivi. Inoltre, tali modelli sono fondamentali per valutare l'efficacia di nuove terapie antitumorali, che in teoria potrebbero essere sviluppate per l'uso in combinazione con la chirurgia per prevenire l'invasione microscopica residua e, in ultima analisi, ridurre il rischio di recidiva. La complessità del glioblastoma giustifica la necessità di modelli preclinici complessi avanzati in grado di riprodurre caratteristiche architettoniche tumorali chiave. I modelli tridimensionali derivati dal paziente hanno ricevuto maggiore attenzione per la loro capacità di preservare le interazioni cellula a cellula, mantenere gradienti di nutrienti, ossigeno e agenti terapeutici, e replicare l'integrità strutturale dei tumori^{nativi 6,7}. Tuttavia, visualizzare questi modelli 3D presenta sfide tecniche, tra cui il posizionamento degli sferoidi, la variabilità dell'imaging e la riproducibilità del saggio.

Qui descriviamo un modello di migrazione del glioblastoma 3D specifico per il paziente, eseguito in condizioni ipossiche, che consente di indagare la dinamica migratoria tra campioni derivati da vari sottotipi tumorali e stadi della malattia del paziente, inclusi campioni tumorali ingenui e ricorrenti in trattamento. Questa piattaforma consente la valutazione delle risposte differenziali agli agenti terapeutici e supporta l'analisi multiplex post-migrazione tramite segmentazione delle immagini, consentendo la valutazione quantitativa della dinamica migratoria, della crescita degli sferoidi e dell'espressione proteica. L'incorporazione di nanoparticelle di ossido di ferro magnetico consente una centralizzazione costante degli sferoidi all'interno di ogni pozzo applicando una lieve forza^{magnetica 8}. Gli sferoidi coltivati in piastre standard multipozzo spesso mostrano una tendenza a spostarsi verso i bordi del pozzo, un comportamento ritenuto influenzato dalla formazione di menischi liquidi e dall'evaporazione periferica, specialmente nei pozzi al perimetro^{delle placche 9,10,11}. Questi fenomeni introducono artefatti di imaging e rumore di fondo, in particolare durante la microscopia a luce trasmessa, che possono complicare l'imaging in timelapse delle dinamiche di invasione. A differenza delle colture monostrato 2D, dove per l'imaging si possono selezionare regioni di densità cellulare uniforme, i saghi di invasione di singoli sferoidi richiedono una posizione precisa e coerente dell'intera area sferoidea e migratoria all'interno del campo di imaging. Questo aggiunge una sfida aggiuntiva, poiché deriva o posizionamento irregolare all'interno del pozzo può compromettere la qualità e la riproducibilità dei dati. Pertanto, centralizzare costantemente gli sferoidi all'interno delle lastre multiwell minimizza queste sfide e migliora non solo la qualità dell'imaging ma anche la coerenza sperimentale, le pipeline di elaborazione delle immagini e le analisi post-migrazione. Inoltre, l'avvio di colture sferoidi a densità cellulari uniformi in queste piastre specializzate di coltura sferoidi favorisce la formazione di sferoidi riproducibili, riducendo la variabilità in morfologia, tasso di crescita e integrità^{strutturale 10,11}. In termini pratici, le gliomasfere tipiche utilizzate in questi saggi variano da 150 a 300 μm di diametro, formandosi riproducibilmente sotto densità cellulari standardizzate. Le colture vengono mantenute in condizioni ipossiche (1%–2%_O2).

La piattaforma descritta qui supporta formati da media ad alta produttività, come piastre a 96 pozzi, che consentono repliche multiple per campione di paziente, ed è scalabile per screening farmacologico o test^{multi-condizione 12} . Ottimizzare il posizionamento degli sferoidi e le condizioni di coltura è quindi essenziale per aumentare la robustezza e la rilevanza clinica dei modelli preclinici 3D utilizzati per studiare il potenziale invasivo del glioma e altri processi cellulari dinamici.

Protocollo

Le cellule di glioblastoma derivate dal paziente sono state fornite da Erasmus MC, Rotterdam, Paesi Bassi, e dall'Hospital for Sick Children (Toronto, Canada). I campioni primari di questi cateterici sono stati prelevati come parte di resezioni di routine da pazienti con il loro consenso informato (numeri di approvazione etica, MEC-2013-090, 0020010404).

1. Preparazione delle gliomasfere magnetiche derivate dal paziente (Figura 1)

1. Almeno 30 minuti prima della dissociazione della gliomasfera, si fornisce un sufficiente mezzo enzimatico per distacco cellulare e mezzo della gliomasfera per l'esperimento (tipicamente 1 mL per fiaschetta T75 confluente) e porti entrambi alla temperatura ambiente.
2. In condizioni sterili, raccogliere gliomasfere dalla fiaschetta di coltura tramite aspirazione gentile utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL e un ausilio per pipetta e trasferirle in un tubo conico da 15 mL. Centrifuga a 300 x g per 3 minuti. Scartare con cura il soprantantante senza disturbare la pellet cellulare.
3. Risospendere il pellet in 1 mL di mezzo enzimatico di distacco cellulare a temperatura ambiente e incubare per 10–15 minuti, agitando delicatamente ogni 2-3 minuti pipettando con una pipetta P1000 per facilitare la dissociazione in una sospensione monocellulare.
4. Aggiungere un volume uguale di mezzo gliomasferico per disattivare l'enzima. Centrifugare la sospensione monocellulare a 300 x g per 3 minuti a 37 °C, poi risospendere delicatamente la pellet cellulare in 3–5 mL di mezzo completo della gliomasfera, a seconda della dimensione della pellet cellulare, annotando il volume esatto utilizzato per il conteggio cellulare successivo.
   NOTA: Il tempo di incubazione del mezzo enzimatico dipenderà in gran parte dalla dimensione delle gliomasfere in coltura, ispezionare sempre visivamente prima dell'uso e adottare di conseguenza.
5. Prendi un'aliquota rappresentativa da 10 μL della sospensione a singola e mescola delicatamente con 10 μL di Trypan Blue in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Carica 10 μL di questa miscela in un emocitometro o in un contatore automatico per determinare le cellule vitali.
6. Semina 500 cellule singole di glioblastoma per pozzo in una micropiastra sferoidea a 96 pozzi con attacco ultra basso. La densità ottimale di semina può variare tra i campioni del paziente.
7. Aggiungere 1 μg/mL di Propidium Ioduro (PI) e 0,05 μL di nanoparticelle di ossido di ferro per pozzo (ad esempio, utilizzare 1,5 μL di nanoparticelle magnetiche per 20 sferoidi, corrispondenti a circa 10.000 singole cellule). Assicurarsi che le nanoparticelle di ossido di ferro siano omogeneizzate prima dell'aggiunta pipettando su e giù con un P100 impostato a 100 μL.
   NOTA: Il volume di nanoparticelle di ossido di ferro utilizzato può essere ottimizzato a seconda della linea cellulare utilizzata, tuttavia, in questo caso, 1,5 μL ogni 10.000 cellule è stato sufficiente per localizzare centralmente gli sferoidi. Questa configurazione garantisce una dimensione coerente degli sferoidi tra i campioni di pazienti, facilitando il confronto diretto delle dinamiche di invasione e crescita durante il test di invasione.
8. Incubare le piastre per 48 ore in un incubatore di colture cellulari umidificate a 37 °C, 5% di_CO2 e 21% di_O2 per consentire la formazione della gliomasfera.

Figura 1: Gliomasfere di dimensioni e localizzazione uniforme co-colte con nanoparticelle di ossido di ferro. (A) Le gliomasfere derivate da tumori di pazienti appena diagnosticati e ricorrenti mostrano fenotipi doppi e associazioni casuali da cellula a cellula. (B) Rappresentazione schematica della formazione delle sferoidi di dimensioni uniformi entro 48 ore dalla semina. (C) Immagini di luce trasmessa di gliomasfere coltivate per 48 ore in micropiastre sferoidi con fondo rotondo senza (pannello superiore) e con nanoparticelle di ossido di ferro (pannello inferiore). Si noti l'aspetto scuro e maculato delle gliomasfere contenenti nanoparticelle di ossido di ferro. (D) Posizionamento della gliomasfera che mostra una localizzazione casuale delle gliomasfere coltivate senza nanoparticelle (in alto) rispetto alla localizzazione centrale costante di quelle coltivate con nanoparticelle (in fondo), con conseguente riduzione del rumore di fondo e qualità dell'immagine migliorata. Barra della scala = 100 μm. Schema realizzato usando Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione di piastre multi-pozzetto rivestite con matrice extracellulare (ECM) (1 ora prima del test di migrazione)

1. Accredita e conserva l'ECM come indicato dal produttore. Scongelare una aliquota di 1 mL di ECM (diluizione 1:10) lentamente sul ghiaccio durante la notte a 4 °C. Immediatamente prima della placcatura, si prepara una soluzione lavorativa finale a 1:100 (v/v) eseguendo un'ulteriore diluizione 1:10 del calcio 1:10 in un mezzo neurosferico completo gelido. Tieni sempre l'ECM diluito sul ghiaccio per prevenire una polimerizzazione prematura. Tieni sempre questa diluizione sul ghiaccio perché l'ECM polimerizzerà rapidamente a temperatura ambiente.
2. Dispensare 50 μL della soluzione di lavoro 1:100 ECM in ciascun pozzo di una piastra a 96 pozzi, trasparita, a fondo piatto o μClear-bottom. Incubare la piastra a 37 °C per almeno 1 ora per permettere all'ECM di fissarsi e formare una matrice sottile in ogni pozzo.
3. Dopo l'incubazione, rimuovere con cura 30 μL da ogni pozzo, lasciando 20 μL di ECM polimerizzato (concentrazione finale 1:100 v/v) a ricoprire il fondo di ogni pozzo. L'ECM deve essere mantenuto il più freddo possibile durante questo periodo, poiché polimerizza rapidamente a temperatura ambiente. La piastra di imaging può anche essere pre-raffreddata e conservata sul ghiaccio durante questo processo.
    

3. Installazione di piastre per immagini e imaging a cellule vive

1. Il giorno del test (48 ore dopo la semina della gliomasfera) posizionare la micropiastra rivestita ECM su un azionamento magnetico a 96 pozzi a piastra, come mostrato nella Figura 2B,C. Sterilizza la piastra magnetica spruzzando con etanolo al 70% e asciugandola, non ammollare.
2. Ispeziona visivamente gli sferoidi per la qualità e l'uniformità. Utilizzando una pipetta, trasferire 80 μL di mezzo contenente la singola gliomasfera da ciascun pozzo e pipettare delicatamente sulla piastra con la superficie ECM.
   NOTA: Per sferoidi particolarmente grandi, si presti attenzione a minimizzare lo stress di taglio durante il trasferimento; ciò può essere ottenuto tagliando 1-2 mm dalla punta di una pipetta P100 con forbici per allargare l'apertura e ridurre i danni meccanici. Assicurati che le forbici siano state sterilizzate ai raggi UV prima dell'uso. Soprattutto, minimizza l'aggiunta di bolle d'aria, poiché questo ha un grande impatto sull'imaging.
3. Trattare gli sferoidi secondo il disegno sperimentale. Preparare le soluzioni di trattamento alle concentrazioni desiderate in volumi di 20 μL, poi aggiungere questi 20 μL a ciascun pozzo contenente gli sferoidi per raggiungere un volume finale di 100 μL.
   NOTA: Trattare le gliomasfere in questo modo riduce la pipettura e riduce al minimo il rischio di rimuovere gli sferoidi dal pozzo.
4. Trasferire la placca, pur rimanendo sul drive magnetico, al sistema di imaging per l'imaging in tempo reale. Fai attenzione quando rimuovi la piastra dal supporto magnetico e mantieni il più dritto possibile per minimizzare il movimento degli sferoidi dal centro del pozzo.
5. Eseguire immagini in tempo reale utilizzando un microscopio programmabile a cellula inversa con cellula viva equipaggiata con un obiettivo Plan-Apochromat 5x/0,35 NA, un obiettivo a tubo 0,5x, una fotocamera Axiocam 506 (binning = 2) e utilizzando il software Zen 3.1 (Blue Edition). La calibrazione Pixel a micron è integrata nel sistema di imaging ed è gestita automaticamente dal software, quindi non è necessaria alcuna calibrazione manuale. In questo caso, eseguire immagini a un ingrandimento di 2,5x (obiettivo 5x con lente a tubo 0,5x), con la fotocamera binetta a 2 x 2, ottenendo una calibrazione di 1 pixel = 3,645 μm.
6. Regola i controlli ambientali in modo che ci sia l'1% di ossigeno e il 5% di_CO2 con un flusso d'aria molto lento dal miscelatore a gas. Questo aiuta a prevenire l'evaporazione indesiderata quando l'aria in ingresso passa attraverso una bottiglia umidificante.
7. Per prevenire lo spostamento della gliomasfera durante il periodo iniziale di imaging, ridurre l'accelerazione e la velocità dello stadio del microscopio al 10%, minimizzando il movimento sulla superficie dell'ECM prima dell'adesione degli sferoidi.
8. Carica delicatamente la piastra multipozzetto senza azionamento magnetico nel microscopio. Se applicabile, assicurarsi che il materiale della lastra sia selezionato nel software per garantire che l'ottica sia adattata a corrispondere.
9. Utilizza un ingrandimento adeguato che copra l'intero campo visivo invasivo. Ad esempio, su Cell Discoverer 7 sono stati selezionati l'obiettivo 5x e l'obiettivo a tubo 0,5x per ottenere un ingrandimento di 2,5x.
10. Individua ogni gliomasfera, focalizza e assegna una posizione che includa le coordinate x-y-z. L'autofocus hardware, se disponibile, dovrebbe essere utilizzato per garantire un'immagine coerente dello stesso piano focale durante tutto l'esperimento.
11. Controlla sia il contrasto del gradiente di fase (luce trasmessa) sia quello di fluorescenza e regola il tempo di esposizione e l'intensità della luce per assicurarti che non ci sia sovraesposizione. Eccitare iodio propidio (colorazione a cellule morte) usando un LED da 590 nm. Raccogliere l'emissione utilizzando un filtro passa-banda quadrupla, catturando la banda di lunghezza d'onda 618–756 nm. Questo può variare su altri microscopi, a seconda dei filtri e della sorgente luminosa presenti.
12. Imposta per scattare immagini ogni ora per il numero di giorni desiderato.

Figura 2: Descrizione dell'installazione della piastra per l'imaging. (A) Diagramma schematico che rappresenta il protocollo descritto. (B) Immagine di una piastra multipozzo adiacente all'azionamento della piastra magnetica e semplice montaggio della piastra multipozzo sopra la trasmissione magnetica, con ogni singolo magnete localizzato al centro di ogni pozzo, facilitando la localizzazione della gliomasfera. Schema realizzato usando Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Fissazione degli sferoidi dopo un saggio di invasione per l'analisi multiplexata delle proteine (Figura 3)

1. Dopo il completamento del test d'invasione, lavare ogni pozzo con 100 μL di PBS. Questo porterà il volume a 200 μL/pozzo. Ripetere questo passaggio rimuovendo successivamente 100 μL di PBS e sostituendoli con altri 100 μL di PBS.
2. Rimuovere con cura 200 μL di substrato, poi aggiungere 100 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% in ciascun pozzo e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente sotto una cappa a fumi.
   ATTENZIONE: Il paraformaldeide è una sostanza chimica tossica e bisogna prestare attenzione per minimizzare il rischio o l'esposizione.
3. Dopo la fissazione, rimuovi il PFA da ogni pozzo e lava 3 volte con PBS rimuovendo il PFA e aggiungendo 100 mL di PBS ogni volta.
4. Aggiungi le macchie immunitarie come indicato dal produttore. In alternativa, per la conservazione a lungo termine, si aggiunge azide di sodio (0,02%) al PBS per mantenere la sterilità e sigillare la piastra con un film trasparente. Conserva a 4 °C fino a quando è necessario.

Figura 3: Analisi rappresentativa delle proteine dopo il saggio di migrazione delle gliomasfere situate al centro rispetto al bordo del pozzo. Microscopia confocale a scansione laser di gliomasfere ricorrenti immunocolorate con un anticorpo che prende di mira il marcatore delle cellule staminali Glioblastoma CD44 dopo la migrazione. CD44-FITC (verde) e Hoechst (nuclei, blu). Barra della scala = 100 μm. Le punte di freccia indicano il bordo del pozzo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Pipeline di elaborazione delle immagini delle dinamiche di migrazione derivate dal paziente

NOTA: Per esperienza con il nostro dataset, raccomandiamo che il computer di elaborazione abbia un processore multicore con una frequenza base di core elevata e una quantità sostanziale di memoria, poiché l'elaborazione WEKA si adatta molto bene a un alto numero di core e utilizzerà la memoria disponibile a seconda della dimensione del dataset.  Specifica usata e raccomandata come elencata di seguito.  Si noti che l'elaborazione GPU non viene utilizzata da questo flusso di lavoro.
CPU: >= 6 core | >= 2 GHz (consigliato); 32 nuclei | 2,1 GHz (utilizzato)
Memoria: > 32 GB (consigliato); 192 GB (usati)

1. Open^{Fiji 13} [attualmente viene utilizzato per l'analisi l'eseguibile ImageJ-win64.exe incluso]. Apri l'immagine navigando verso – File > Apri Seleziona file immagine time-lapse multi-canale multi-scena (.czi) si apre sull'interfaccia Fiji (se si utilizza lo script, questo è il File Supplementare 1).
2. Seleziona le immagini richieste nell'interfaccia grafica. Funziona meglio se le gliomasfere più invasive dell'esperimento allenano inizialmente il classificatore (cioè controllare bene – DMSO), poiché questa immagine fornirà dettagli su ogni segmento dell'immagine, cioè l'aspetto delle cellule invasive/migranti vs sferoidi vs sfondo.
3. Poi naviga su Immagine > Colore > Canali Divisi : questo separa l'immagine in due canali – uno in questo caso con colorazione di Propidio Ioduro e l'altro con luce trasmessa.
4. Seleziona il canale per la segmentazione – in questo caso, il canale luminoso trasmesso che rappresenta la dinamica della migrazione. Naviga su Plugin > Segmentazione > Segmentazione WEKA Allenabile¹⁴.
5. Rinominare le due classi predefinite come: Classe 1: Gliomasfera; Classe 2: Invasione/Migrazione. Aggiungi una terza classe chiamata Background (opzionale ma consigliata) navigando su Impostazioni > Nuova classe > Background.
6. Utilizzando lo strumento Freeline, annota le regioni di addestramento all'interno di ogni pila di immagini e classe attingendo alle regioni rappresentative, cioè disegna un vortice nello sferoide e clicca su Aggiungi allo Sferoide , ripeti questo per l'area d'invasione e lo sfondo finché tutte le regioni non sono rappresentate in ogni classe. Addestra il classificatore cliccando su Classificatore Treno. Ulteriori immagini possono essere annotate per addestrare ulteriormente il classificatore e migliorare la precisione se necessario.
7. Quando soddisfatto, salva il modello addestrato del classificatore usando un nome di file come CellLine_Treatment_Classifier.model. Chiudi la finestra di segmentazione quando è completata.
8. Per nuove immagini che utilizzano questo classificatore salvato, vai su Plugins > Segmentation > Trainable WEKA segmentation >Load Classifier> Open Saved Classifier CellLine_Treatment_Classifier (questo salva un file .model . È un requisito per il File Supplementare 2 averlo preparato prima che lo script venga eseguito. Quando lo script viene avviato, deve essere selezionato il file di esempio appropriato).
9. Naviga per ottenere probabilità sull'interfaccia di segmentazione WEKA addestrabile - Questo produce mappe di probabilità per ogni classe selezionata, cioè Gliomasfera, Invasione/Migrazione, Sfondo, indicando la probabilità che ogni valore di pixel assegnato all'immagine appartenga alla specifica classe o regione dell'immagine. Questo genererà un file di 3 immagini separate di mappe di probabilità (Gliomasfera, Invasione, Fondo) con una gamma dinamica di 32 bit per ogni immagine.
10. Seleziona la mappa di probabilità corrispondente a Invasione/Migrazione. Naviga su Image > Hyperstacks > ridurre la dimensionalità. Seleziona Conserva Fonte.
11. Sblocca i canali ma mantiene i Frame - questo riduce la mappa a un solo canale nel tempo – in questo caso, la mappa di probabilità Invasione. Seleziona la mappa di probabilità corrispondente alla Gliomasfera.
12. Ripeti i passaggi 5.10-5.11. Ora ci saranno due mappe di probabilità corrispondenti all'immagine originale di time lapse della luce trasmessa per una scena dell'area della migrazione e dell'area sferoide. Salva entrambi con la seguente convenzione di nome file: ImageName_Scene_Gliomasphere_ProbabilityMap e ImageName_Scene_Invasion_Probability Map in una cartella corrispondente all'esperimento selezionato, cioè CellLine_Treatment.
13. Imposta la soglia per creare una maschera binaria: vai su Immagine > Regola > Soglia. Scegli un metodo di soglia (ad esempio, Yen, Otsu). Mantieni il metodo selezionato uguale su tutte le immagini elaborate.
14. Naviga per analizzare > impostare le misure. Seleziona le misure desiderate; Area del tick, Densità Integrata e Media poi premi Ok. Naviga per analizzare > analizzare particelle. Per Invasione/Migrazione, dimensione del set: 0 – infinito; circolarità: 0,00 – 1,00. Per le gliomasfere, dimensione impostata: tipicamente, 1500 – Infinito (regolare secondo necessità in base alla dimensione degli sferoidi nella linea cellulare/trattamento - le sfere di controllo crescono naturalmente); circolarità: 0,05 – 1,00. Seleziona le unità di pixel per tutti.
15. Naviga per analizzare>Analizza i pixel> Mostra: seleziona le maschere. Dopo aver generato le maschere, verifica l'area segmentata di interesse su tutto lo stack timelapse per garantire un tracciamento accurato. Applicare operazioni binarie tramite Process > Binary > ... (ad esempio, selezionare Riempire i Spazi durante la perfezione della maschera sferoide), seguito da navigare su Analizza > Analizza Particelle > Mostra > Seleziona Nulla e seleziona Riassumi. Questo fornirà una finestra di riepilogo delle misurazioni selezionate.
16. Salva i risultati cliccando su File > Salva come > Risultati. Salva come file .csv. Apri in un foglio di calcolo o in altri software di analisi.
17. Ripetere la soglia e l'analisi delle particelle per tutte le classi segmentate (ad esempio, gliomasfere, invasione) per estrarre le rispettive misurazioni nel tempo.  L'output .csv fornisce area (in pixel o micron a seconda della calibrazione) nel tempo.
18. Seleziona il canale di fluorescenza che rappresenta la colorazione PI (ad esempio, canale 2).  Applicare la soglia e l'analisi delle particelle come sopra per identificare le cellule morte. Usa il plugin Calculator Plus per moltiplicare le maschere di cellule PI-positive con la maschera della gliomasfera e separatamente con le maschere d'invasione per quantificare le cellule morte nelle regioni specifiche.
19. Esporta maschere, mappe di probabilità e tabelle riassuntive come file TIFF e CSV con nomi chiari e descrittivi per documentazione e analisi a valle. Quando si utilizza lo script fornito nel supplemento si può trovare la seguente convenzione di denominazione: ad esempio FileName_Scene#_(PI-)Invasion_Summary.csv (dati per oggetti nel tempo), FileName_Scene#_(PI-)Invasion.zip (regioni definite con analisi delle particelle).
    NOTA: Il File Supplementare 1 genererà file tif singoli con immagini timelapse per ogni scena. Il Supplementary File 2 eseguirà la classificazione dei pixel WEKA basata su un file modello di classificazione predefinito su tutte le scene e tutte le immagini di ogni time lapse, fornendo mappe di probabilità per la Gliomasfera e anche per le celle invasori. Il Supplementare File 3 segmenterà tutte le immagini in gliomasfere e cellule invasori e quantificherà le aree coperte così come la partizione delle aree coperte da cellule morte (PI-positive). Il File Supplementare 4 da eseguire assume un metodo di soglia specifico e anche una regione specifica da analizzare, mentre il File Supplementare 3 permette all'utente di impostare la soglia e regolare la regione per ogni scena. La soglia non dovrebbe essere modificata con metodi diversi per ogni scena, ma può essere impostata su metodi diversi per ogni oggetto.

Figura 4: Sfida dell'elaborazione riproducibile dell'immagine dovuta a una scarsa segmentazione della gliomasfera. La pipeline di elaborazione delle immagini usando il plugin di segmentazione WEKA addestrabile su Fiji che mostra (A) gliomasfera localizzata centralmente con maggiore segmentazione dell'area di migrazione rispetto allo sfondo rispetto a (B) gliomasfera localizzata al bordo porta a una scarsa segmentazione dell'immagine e a una replica inutilizzabile. Garantendo la coerenza nella localizzazione della gliomasfera, l'elaborazione delle immagini tra repliche biologiche appare come mostrato in (A), migliorando notevolmente la riproducibilità e l'automazione del saggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Utilizzando il test di migrazione 3D descritto in condizioni ipossiche, le gliomasfere di tumori ricorrenti sono state trattate con veicolo o con il Farmaco X, e la dinamica dell'invasione è stata monitorata ogni ora per 72 ore. La Figura 5 descrive l'analisi di segmentazione WEKA delle dinamiche di invasione, rivelando che il Farmaco X riduce significativamente il potenziale invasivo delle gliomasfere ricorrenti rispetto ai controlli del veicolo in condizioni ipossiche clinicamente rilevanti.

Per valutare ulteriormente l'impatto del Farmaco X sulle caratteristiche delle cellule staminali dopo la migrazione, le gliomasfere sono state fissate e immunocolorate per l'espressione e la localizzazione del marcatore delle cellule staminali del glioblastoma CD44, come mostrato nella Figura 6. Questa analisi multiplexata facilita la visualizzazione della dinamica di migrazione e dell'espressione dei marcatori delle cellule staminali, fornendo informazioni su come il Farmaco X moduli sia il potenziale invasivo sia le proprietà simili a quelle stemiche dei modelli ricorrenti di glioblastoma in condizioni ipossiche clinicamente rilevanti.

Figura 5: Il test di migrazione ottimizzato evidenzia l'efficacia del nuovo Farmaco X nel prevenire la migrazione ricorrente della gliomasfera. Il paziente ha riportato gliomasfere ricorrenti trattate con veicolo o Farmaco X per 72 ore in condizioni ipossiche. Le dinamiche d'invasione sono state catturate ogni h per 72 ore. (A) Immagini rappresentative trasmesse della luce della dinamica dell'invasione a 0 h e 72 h nel pannello superiore - Veicolo trattato e pannello inferiore - Farmaco X trattato. (B) Mappe di probabilità rappresentative dell'area di invasione utilizzate nell'analisi di segmentazione. (C) Le gliomasfere ricorrenti trattate con il Farmaco X hanno mostrato un potenziale invasivo significativamente inferiore rispetto a quelle trattate da veicoli. La quantificazione dell'area invasiva a 72 ore ha rivelato una diminuzione significativa dell'invasione nelle gliomasfere trattate con il Farmaco X, rappresentata come area totale coperta al momento della fissazione. I dati rappresentano l'area di invasione nel tempo da n=3 repliche indipendenti. La significatività statistica è stata valutata utilizzando un test t non accoppiato; p < 0,005 è indicato da **. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Migrazione ed espressione dei marcatori delle cellule staminali dopo il trattamento. Le gliomasfere descritte nella Figura 5 sono state fissate dopo la migrazione e immunocolorate utilizzando un anticorpo che prende di mira il marcatore delle cellule staminali del glioblastoma CD44 dopo il trattamento sia con veicolo che con il farmaco X. Questa figura dimostra il tipo di analisi multiplexata post-migrazione che può essere eseguita utilizzando le tecniche standard di immunocolorazione. Le immagini mostrano CD44-FITC (verde) e Hoechst (nuclei, blu). Barra della scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Salvataggio dei file CZI multiscene dal microscopio come singola scena come file TIF.Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 2: Generazione di mappe di probabilità usando un modello Weka.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Analisi di segmentazione senza soglia. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 4: Analisi di segmentazione con soglia. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Modellare la dinamica invasiva di tumori altamente aggressivi come il glioblastoma è fondamentale per migliorare la comprensione dei processi patologici e identificare strategie terapeutiche più efficaci. La natura complessa, adattativa e plastica della migrazione delle cellule del glioblastoma richiede modelli preclinici che possano catturare con precisione i comportamenti dinamici delle singole cellule gliomache durante la loro migrazione dalla massa tumorale centrale. È importante sottolineare la modellazione di questi processi su campioni derivati da pazienti provenienti da diversi stadi della malattia che consente ai ricercatori di affrontare meglio la sfida dell'eterogeneità tumorale e di identificare eventuali cambiamenti specifici nella dinamica dell'invasione a stadio.

Data questa complessità, è ragionevole supporre che i modelli preclinici debbano possedere un livello equivalente di sofisticazione. Qui descriviamo un metodo raffinato per generare gliomasfere derivate da pazienti di dimensioni uniformi, co-colte con nanoparticelle di ossido di ferro. Questo approccio consente la localizzazione controllata delle gliomasfere al centro di ogni pozzo, consentendo l'imaging automatizzato delle dinamiche di invasione con cellule vive. Diversi studi hanno evidenziato una significativa variabilità nella dimensione, forma e cinetica della crescita degli sferoidi utilizzando metodi convenzionali di coltura 3D; Sayde e colleghi hanno dimostrato che gli sferoidi possono mostrare ampie distribuzioni diametrali tra quelli derivati da popolazioni di cellule staminali tumorali non selezionate e classificate, riflettendo una variabilità intrinseca nella formazione^{degli sferoidi 15,16}. Questa eterogeneità è stata anche identificata come una delle principali fonti di problemi di riproducibilità negli saggi di screening farmacologico basati sugli sferoidi, sottolineando ulteriormente l'importanza di generare popolazioni sferoidi^{omogenee 12}. Questi risultati sottolineano la necessità di standardizzare le condizioni di formazione degli sferoidi prima di condurre analisi funzionali, sfide che questo metodo affronta direttamente. Standardizzando sia la dimensione che la posizione degli sferoidi, questo metodo migliora significativamente la riproducibilità e minimizza la variabilità tipicamente associata ai sistemi di coltura cellulare 3D, dove la formazione disomogenea degli sferoidi può influire sull'analisi a valle.

Durante lo sviluppo iniziale di questo saggio, abbiamo osservato una notevole variabilità nella localizzazione degli sferoidi tra le repliche, richiedendo l'uso di un gran numero di pozzi per esperimento ma anche di molte repliche biologiche per ottenere risultati statisticamente significativi. Questo non solo aumentava sostanzialmente il carico di lavoro, ma generava anche una quantità significativa di dati inutilizzabili, riducendo l'efficienza e la riproducibilità del saggio. La variabilità risultante rifletteva quindi la perdita di dati quantificabili piuttosto che differenze nel comportamento di invasione. Centralizzando le gliomasfere all'interno di ogni pozzo, la localizzazione magnetica garantisce che le immagini di tutte le repliche possano essere segmentate e analizzate in modo coerente, anche quando si osservano differenze biologiche nella dinamica di invasione tra i campioni.

L'incorporazione di nanoparticelle di ossido di ferro introduce una lieve forza magnetica che centralizza costantemente le gliomasfere su tutti i pozzi, migliorando notevolmente le prestazioni della pipeline di elaborazione delle immagini, dell'elaborazione dati e delle analisi post-migrazione, senza influire sulla biologia o la vitalità della^{gliomasfera 8}. Un vantaggio chiave di questo sistema è la sua compatibilità con l'analisi multiplexata post-migrazione; ad esempio, la Figura 6 rappresenta l'analisi della visualizzazione del marcatore delle cellule staminali CD44 del glioblastoma, che consente la valutazione dell'espressione delle cellule staminali dopo la migrazione e il trattamento tra i campioni di pazienti. Questa capacità evidenzia il potenziale della piattaforma per studi integrativi che colleghino fenotipi invasivi a caratteristiche molecolari, una considerazione importante data la plasticità fenotipica delle cellule staminali del glioblastoma in risposta a segnali microambientali e la loro capacità di eludere il trattamento, favorendo l'inevitabile recidiva tumorale.

Sebbene questo saggio migliori notevolmente la riproducibilità della visualizzazione delle dinamiche di invasione di singoli sferoidi, rimangono alcune limitazioni critiche da considerare per l'ottimizzazione futura del saggio. Matrigel è un modello ampiamente utilizzato della membrana basale, tuttavia è un complesso sostituto della matrice extracellulare (ECM) indefinito derivato dai sarcomi murini, che non riproduce completamente il microambiente cerebrale^{umano 17}. L'ottimizzazione futura del saggio potrebbe incorporare modelli ECM specifici per il cervello per imitare meglio il microambiente del tumore cerebrale, che riteniamo essere un passo di ottimizzazione imperativo dei modelli di invasione cerebrale^{in vitro 18,19}. Sebbene Matrigel rimanga un modello ampiamente adottato di ECM, rappresenta una matrice extracellulare non specifica del cervello derivata dal sarcoma murino. Di conseguenza, non riproduce completamente le proprietà biochimiche e meccaniche del microambiente cerebrale umano. È importante sottolineare che la strategia di localizzazione magnetica descritta qui è indipendente dalla matrice e potrebbe essere facilmente adattata ai sistemi ECM specifici del cervello in studi futuri per aumentare ulteriormente la rilevanza fisiologica.

Altre considerazioni del saggio sono i potenziali requisiti di addestramento di un nuovo modello di segmentazione WEKA per ciascuna linea cellulare a causa dell'eterogeneità del campione e della variabilità nella morfologia dell'invasione. Inoltre, sia la densità di semina che la concentrazione di nanoparticelle dovrebbero essere ottimizzate per ciascuna linea cellulare e tipo di sferoide per mantenere uniformità e vitalità prima di eseguire saggi di migrazione ad alta produttività. Nonostante queste limitazioni, questa piattaforma offre un quadro scalabile e adattabile per studiare l'invasione specifica del glioblastoma e la risposta al trattamento specifica del paziente. La sua compatibilità con l'imaging a cellule vive, pipeline di segmentazione automatizzate e analisi multiplexata post-assay apre opportunità per uno screening ad alto contenuto di nuove terapie, terapie combinate e studi meccanicistici di invasione da campioni altamente eterogenei di tumori di pazienti. Inoltre, estendere questo saggio a sistemi di cocoltura, come cellule cerebrali residenti come astrociti, neuroni e microglia o modelli di interazioni emato-encefalica barriera fornisce ulteriori informazioni sulle interazioni stroma-tumori che favoriscono la progressione e la recidiva del glioblastoma.

Durante lo sviluppo del saggio sono stati identificati diversi passaggi tecnici come determinanti critici della riproducibilità e delle prestazioni complessive del saggio. Standardizzare la densità di semina delle linee cellulari prima del saggio garantisce che la dimensione iniziale della gliomasfera sia coerente, consentendo così di comparare la dinamica della crescita degli sferoidi tra linee cellulari, trattamenti e condizioni. Senza questa fase di standardizzazione, le dimensioni iniziali degli sferoidi aggiungeranno un livello significativo di variabilità, che potrebbe riflettere risposte variabili delle gliomasfere alle condizioni sperimentali. La localizzazione centrale precisa delle gliomasfere all'interno di ogni pozzo è un requisito chiave per l'acquisizione automatica accurata delle immagini e la segmentazione a valle. Gli sferoidi fuori centro causavano un rumore di imaging notevole e impediscono l'uso della segmentazione WEKA come mezzo per segmentare le immagini in regioni chiaramente definite. Assicurando che tutte le gliomasfere siano localizzate al centro, lo stesso classificatore WEKA può essere utilizzato più volte poiché il rumore si riduce sostanzialmente e la qualità dell'immagine migliora drasticamente. Una rappresentazione di questo è mostrata nella Figura 1. L'incorporazione di nanoparticelle di ossido di ferro magnetico è quindi un metodo per garantire la localizzazione centrale delle gliomasfere, minimizzando la variabilità posizionale e migliorando sostanzialmente l'elaborazione e la comparabilità delle immagini tra repliche. Infine, l'addestramento del modello di segmentazione all'interno della pipeline WEKA rappresenta un ulteriore passaggio critico di standardizzazione. A causa dell'eterogeneità inter-pazienti e delle differenze nella morfologia dell'invasione, un singolo modello di segmentazione potrebbe non generalizzare su tutti i campioni. Il riaddestramento o il raffinamento dei parametri di classificazione per ciascuna linea cellulare garantisce mappe di probabilità accurate delle aree invasive e previene errori di quantificazione.

Nel complesso, questo saggio fornisce una piattaforma riproducibile e scalabile per studiare in tempo reale i comportamenti dinamici invasivi dei campioni di glioma derivati dal paziente. La sua compatibilità con l'imaging multiplexato e le analisi molecolari a valle lo rende uno strumento potente e versatile sia per la ricerca sul glioma di base che per quella traslazionale, che aumenterà notevolmente la rilevanza traslazionale dei modelli preclinici di glioblastoma.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
KIT DI BIOSTAMPA A 96 POZZI, TRASPARENTE	Greiner	655840
Accutase	Invitrogen	00-4555-56	n/a
Supplemento B-27 (50X), siero e nbsp; Gratis senza vitamina A	Gibco	12587010	10%
Fattore di crescita dei fibroblasti di base, umano e nbsp; (bFGF)	PeproTech	100-18B	20  ng/ml
Celldiscoverer  7	Zeiss	-
Micropiastre sferoidi di Corning	Corning	CLS4515
Matrice di Matrigel di Corning	Corning	354234	Diluizione finale 1:100
Contatore Automatico delle Celle della Contessa	Invitrogen	-
DMEM-F12  (500ml)	Termofischer	11320-074	n/a
Fattore di Crescita Epidermica Umana (EGF)	PeproTech	AF-100-15	20  ng/ml
FITC Mouse Anti-Human CD44	BD Pharmingen	555478	1:100
Micropiastre di coltura cellulare in polistirene a 96 pozzi Greiner CELLSTAR con F-fondo/Camino e micropiastre Trasparente, nero, TC, sterile, con coperchio	Greiner	655090
Eparina	Termofischer	A16198	5µ g/ml
Hoechst 33258	Sigma Aldrich (Merck)	861405	1µ g/ml
NanoShuttle-PL	Greiner	657841	1,5  & micro; 1/10.000 celle
Penicillina - Streptomycina	Merck	P4333	1%