Articolo metodologico

Isolamento dei cardiomiociti ventricolari da un modello murino di cardiotossicità da dossorubina

DOI:

10.3791/70411

⸱

27 febbraio 2026

 ,  ,  , 
1Advanced Institute for Medical Sciences, Dalian Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Xi'an Jiaotong University, 3East China Normal University Health Science Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo riproducibile e privo di Langendorff per isolare cardiomiociti ventricolari adulti di topo vitali da un modello di cardiotossicità indotto dalla doxorubicina. Impiega una perfusione antegrade diretta del ventricolo sinistro seguita da una digestione enzimatica controllata per ottenere miociti a forma di bastoncello tolleranti al calcio, adatti ad analisi strutturali, molecolari e funzionali.

Abstract

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La dossorubicina (DOX) è un farmaco chemioterapico efficace la cui applicazione clinica è limitata da una progressiva cardiotossicità doso-dipendente che colpisce prevalentemente il miocardio ventricolare. Studiare i meccanismi di lesione cellulare in questo contesto richiede un isolamento affidabile dei cardiomioci adulti, un processo tecnicamente complesso nei cuori malati o strutturalmente fragili. Qui descriviamo un protocollo semplificato e riproducibile senza Langendorff per l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari funzionali di topi con cardiotossicità indotta da DOX. Dopo aver stabilito il modello DOX nei topi C57BL/6, il cuore viene rapidamente estanciato e l'aorta viene clampata ex vivo. La perfusione antegrade non circolante viene eseguita direttamente attraverso il ventricolo sinistro utilizzando tamponi privi di calcio e contenenti enzimi. Una dissociazione meccanica delicata del tessuto ventricolare digerito produce cardiomiociti individuali, seguita da una reintroduzione controllata del calcio per ripristinare la tolleranza al calcio. Questo metodo fornisce cardiomiociti di alta qualità, validi e a forma di bastoncello, compatibili con saghi a valle, inclusi immunofluorescenza, analisi dell'organizzazione dei sarcomeri, rilevamento di apoptosi e studi di segnalazione molecolare. Eliminando la necessità di apparecchiature specializzate per la perfusione Langendorff, questo protocollo offre una soluzione accessibile e ad alto rendimento per i laboratori che indagano i meccanismi della lesione cardiaca indotta dalla DOX.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La doxorubicina (DOX) è un potente agente chemoterapeutico di antracciclina, ma la sua utilità clinica è limitata dalla cardiotossicità cumulativa che può evolvere in cardiomiopatia dilatata e insufficienzacardiaca 1,2. L'apoptosi cardiomiocitaria è un processo patogeno chiave in questa tossicità 3,4,5, e lo studio di questi eventi cellulari richiede un accesso affidabile ai cardiomiociti funzionali degli adulti derivati da cuori lesionati dalla DOX. Tuttavia, l'esposizione alla DOX rende i cardiomioci strutturalmente fragili e metabolicamentecompromessi 6, aumentando notevolmente la loro suscettibilità allo stress enzimatico e meccanico durante l'isolamento e con una bassa vitalità. Nella letteratura più ampia, la perfusione di Langendorff rimane il metodo predominante per l'isolamento dei cardiomiocitinegli adulti 7. Tuttavia, presenta limitazioni notevoli quando applicato al miocardio danneggiato. Il metodo richiede hardware specializzato, una canulazione aortica precisa e notevole competenza tecnica; nei cuori trattati con DOX, lo sforzo meccanico aggiuntivo introdotto durante la perfusione di Langendorff può aggravare ulteriormente il danno cellulare, producendo risultati incoerenti e spessosubottimali.

Per superare queste sfide, abbiamo stabilito un protocollo semplificato e accessibile per isolare i cardiomiociti ventricolari adulti tolleranti al calcio da un modello murino di cardiotossicità acuta indotta daDOX 9. Eliminando la necessità della perfusione convenzionale di Langendorff e implementando invece una perfusione controllata ex vivo antegrade direttamente attraverso il ventricolo sinistro, questo metodo minimizza l'esposizione ischemica e riduce la manipolazione meccanica del miocardio. Queste caratteristiche dovrebbero migliorare la coerenza procedurale e aumentare la sopravvivenza dei cardiomiociti vulnerabili derivati da cuori compromessi 7,10.

L'approccio attuale si basa sui progressi emergenti nell'isolamento dei cardiomiociti senza Langendorff, estendendo questi concetti alle cellule ventricolari adulte, che richiedono la conservazione di un'architettura contrattile matura e delle proprietà di gestione del calcio, caratteristiche che non sono adeguatamente supportate da metodi di digestione semplificati sviluppati principalmente per i cuorineonatali 11,12. Questo protocollo, quindi, offre un'alternativa pratica e riproducibile per laboratori privi di sistemi di perfusione specializzati. I cardiomiociti isolati mantengono la loro integrità strutturale e sono ben adatti a diverse applicazioni a valle, tra cui l'analisi dei sarcomeri, l'imaging a immunofluorescenza e gli studi di segnalazione dell'apoptosi, consentendo un'indagine meccanicistica diretta della lesione cardiaca indotta dalla DOX in un contesto fisiologicamente rilevante. Collettivamente, questo protocollo affronta un bisogno critico e insoddisfatto di isolare i cardiomiociti vitali dai cuori danneggiati dalla DOX.

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Protocollo

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Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo le linee guida istituzionali e nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state esaminate e approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali dell'Università Jiaotong di Xi'an (Approvazione n. XJTUAE2022-1441). I consumabili, i reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Stabilimento del modello di cardiotossicità acuta indotta da DOX nei topi C57BL/6

  1. Preparazione animale: Utilizzare maschi C57BL/6 topi maschi di 8-12 settimane (24-28 g). Animali domestici in condizioni standard con un ciclo di 12 ore luce/scuro e accesso ad libitum a cibo e acqua. Assegnare casualmente i topi a gruppi di controllo trattati con DOX o con soluzione salina (n = 3 per gruppo).
  2. Amministrazione DOX
    1. Prepara una soluzione DOX fresca a 1,5 mg/mL in soluzione salina sterile. Proteggi la soluzione dalla luce avvolgendo il contenitore con della carta stagnola.
    2. Pesare ogni topo e calcolare il volume di iniezione per una singola dose intraperitoneale (i.p.) di 15 mg/kg 13,14.
    3. Trattieni delicatamente il topo e somministra la soluzione DOX tramite iniezione intraperitoneale. Riporta il topo nella gabbia e procedi secondo il programma sperimentale.
      ATTENZIONE: DOX è un agente citotossico. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale appropriata (camice da laboratorio, guanti, protezione per gli occhi) e maneggia il reagente in un'area designata per la sicurezza chimica.
  3. Tempistica e monitoraggio: monitora i topi quotidianamente per la salute generale e il comportamento. Registra il peso corporeo a giorni alterni. Esegui l'isolamento cardiomiocitario 7 giorni dopo l'iniezione DOX.

2. Preparazione di soluzioni e strumenti chirurgici per l'isolamento dei cardiomioci

  1. Preparazione del tampon: Vedi la Tabella Supplementare 1 per i metodi dettagliati di preparazione di queste soluzioni.
    1. Prepara il buffer di perfusione e il buffer EDTA. Regola il pH di tutte le soluzioni a 7,4 usando NaOH.
    2. Prepara una soluzione digestiva enzimatica contenente collagenasi di tipo II, collagenasi di tipo IV e proteasi XIV con tampone per perfusione.
    3. Prepara a interrompere il buffer integrando il buffer di perfusione con siero bovino fetale al 5% (FBS).
    4. Prepara un mezzo di coltura completo aggiungendo albumina sierica bovina (BSA) allo 0,1%, insulina-transferrina-selenio (ITS), 10 mM 2,3-Butanedione monossame (BDM), concentrato lipidico e penicillina/estreptomicina (P/S) al mezzo M199.
    5. Preparare i tamponi di reintroduzione del calcio aggiungendo mezzo di coltura completo al tampone di perfusione a concentrazioni finali di calcio rispettivamente di 0,34 mM, 0,68 mM e 1,02 mM.
      NOTA: Preparare tutte le soluzioni in condizioni sterili utilizzando una filtrazione a 0,22 μm. Conservare le soluzioni a 4 °C, protette dalla luce, per un massimo di due settimane. Per l'isolamento di un cuore di topo, preparare 50 mL tampone EDTA, 100 mL tampone per perfusione (60 mL per la soluzione di collagenasi, 10 mL per il tampone di arresto, il resto per perfusione e sedimentazione gravitazionale), 60 mL tampone di collagenasi e 10 mL tampone di arresto.
  2. Preparazione degli strumenti chirurgici: sterilizza tutti gli strumenti chirurgici tramite autoclavaggio prima della procedura. Disporre sequenzialmente i seguenti strumenti nell'area chirurgica: forbici sottili, forbici curve, pinze, pinze emostatiche curve (Figura 1A) e pompa per siringa (Figura 1B).

3. Isolamento dei cardiomiociti dai cuori trattati con DOX

NOTA: Una panoramica schematica della procedura di isolamento dei cardiomiociti è mostrata nella Figura 2. Dopo aver verificato che tutti gli strumenti, le attrezzature e le soluzioni chirurgiche siano pronti, inizia l'isolamento.

  1. Clampaggio aortico ed escissione cardiaca
    1. Anestesiare il topo con isoflurano al 3% e confermare l'anestesia controllando la mancanza di risposta a un pizzicare al ditodel piede 15.
    2. Fissa il topo in posizione supina sulla tavola di disezione.
    3. Fai un'incisione mediana attraverso la pelle e la parete toracica per esporre il cuore, e taglia l'aorta discendente.
    4. Perfondere 7 mL di EDTA buffer a velocità controllata e costante nella base del ventricolo destro per circa 1 minuto per rimuovere rapidamente il sangue dai ventricoli minimizzando l'esposizione ischemica e preservando l'integrità strutturale cardiaca, in particolare nei cuori fragili con lesioni DOX (Figura 2A).
    5. Clampare rapidamente l'aorta ascendente (Figura 2B), rimuovere il cuore e trasferirlo immediatamente in una piastra da 100 mm contenente un buffer EDTA ghiacciato.
      NOTA: Il tempo totale dalla toracotomia al trasferimento cardiaco è idealmente mantenuto sotto i 2 minuti per minimizzare l'ischemia.
  2. Configurazione per perfusione
    1. Rimuovi con attenzione il tessuto circostante.
    2. Metti il cuore in una ciotola di dissezione contenente un tampone di perfusione ghiacciato.
    3. Perfondi 10 mL di EDTA buffer costantemente attraverso l'apice del ventricolo sinistro usando un ago residente per 6 minuti per destabilizzare le connessioni extracellulari.
    4. Trasferire il cuore in un altro piatto da 100 mm e rimuovere l'EDTA residuo dalle camere cardiache perfondendo 3 mL di buffer di perfusione attraverso lo stesso catetere per 2 minuti.
      NOTA: Osservare il gonfiore cardiaco durante la perfusione e fissare l'aorta con forze emostatiche curve per stabilire un sistema di perfusione chiuso. Controlla attentamente la velocità di perfusione e la pressione per evitare una forza idrostatica eccessiva e minimizzare il rischio di rottura dell'atrio sinistro.
  3. Digestione enzimatica
    1. Trasferire il cuore esposto in una piastra da 100 mm contenente 5 mL di soluzione digestiva enzimatica.
    2. Collega l'ago in permanenza a una siringa da 20 mL riempita con la soluzione digestiva enzimatica e fissa saldamente l'ago alla superficie dell'armadietto di biosicurezza usando un nastro indicatore di sterilizzazione.
    3. Inserire la siringa in una pompa di microiniezione e avviare la perfusione a una velocità controllata di 3 min/mL (Figura 2C).
    4. Perfondi il cuore attraverso il ventricolo sinistro con la soluzione enzimatica per 60-90 minuti fino a raggiungere la digestione completa, indicata da una totale perdita di elasticità tissutale e una colorazione pallida della superficie ventricolare (Figura 2D). Se dopo la perfusione iniziale si osserva una digestione incompleta, somministrare ulteriori 15-20 mL di soluzione enzimatica per la digestione continua.
      NOTA: Evitare lo stacco dell'ago durante il cambio della siringa; se spostato, si reinserisce nel sitiere originale del ventricolo sinistro per preservare il percorso di perfusione.
  4. Dissociazione tissutale
    1. Trasferire il cuore digerito in una ciotola da 60 mm contenente 5 mL di tampone di arresto.
    2. Strappare il tessuto ventricolare in piccoli pezzi usando pinze fini (Figura 2E).
    3. Triturare delicatamente la sospensione del tessuto ventricolare con una pipetta da 5 mL per dissocere i singoli cardiomiociti (Figura 2F).
    4. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 100 μm per rimuovere i frammenti di tessuto di grandi dimensioni.
    5. Risciacqua il colino con altri 5 mL di buffer di arresto per massimizzare la resa della cella.
      NOTA: Eseguire tutti i passaggi di triturazione con delicatezza e limitare la pipettura a non più di 50 ripetizioni per evitare danni meccanici ai cardiomiociti.
  5. Reintroduzione del calcio
    NOTA: Lasciare che i cardiomiociti subiscano 3-4 periodi consecutivi di sedimentazione gravitazionale di 15 minuti in tubi centrifughe da 15 mL (Figura 2G). Dopo ogni sedimentazione, rimuovere con cura l'80% del sovrantantante e risospendere il pellet in 3 mL del successivo tampone di reintroduzione del calcio. Aumentare progressivamente la concentrazione di calcio utilizzando le soluzioni a gradiente preparate a ognipasso 16.
  6. Conteggio delle celle e placcatura
    1. Quantificare la densità cellulare usando un emocitometro e calcolare la proporzione di cardiomiociti a bastoncello rispetto aquelli arrotondati 1,9 (Figura 2H).
    2. Placca 1-5 × 105 celle in mezzo di placcatura in piastre a 6 pozzi pre-rivestite con laminina (10 μg/mL) per 1 ora a 37 °C e lavate con soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Prepara i piatti con un giorno di anticipo e conserva a 4 °C se necessario. Cambia il substrato in un substrato fresco e preriscaldato dopo 1 ora e ogni 48 ore successivamente.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa dopo il passo 3.6. Le cellule possono essere mantenute in coltura a breve termine fino a 6 ore per esperimenti immediati.

4. Valutazione dell'integrità strutturale dei cardiomiociti tramite immunocolorazione

  1. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.
  2. Lava le cellule tre volte con PBS, 5 minuti ciascuna.
  3. Permeabilizza le cellule con 0,1% di Triton X-100 in PBS per 10 minuti e lava tre volte con PBS, 5 minuti ciascuna.
  4. Blocca il legame non specifico con l'1% di BSA in PBS per 1 ora.
  5. Incubare cellule con anticorpi primari contro la α-actinina sarcomica durante la notte a 4 °C.
  6. Lavare delicatamente tre volte con PBS, poi incubare con l'anticorpo secondario fluorescente appropriato per 1 ora a temperatura ambiente.
  7. Lava delicatamente tre volte con PBS, poi controcolora i nuclei con DAPI per 5 minuti.
  8. Montare i coprirossi su vedute di vetro usando un mezzo di montaggio antifade.
  9. Acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza per visualizzare i pattern di colorazione.

5. Analisi della segnalazione apoptotica in cardiomiociti isolati

  1. Estrazione e quantificazione delle proteine
    1. Cardiomiociti di lisi in tampone a base di RIPA integrati con inibitori di proteasi e fosfatasi.
    2. Centrifugare l'omogenea a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Raccogli il soprantantante per un'analisi successiva.
    3. Determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio colorimetrico con acido bicinconinico.
  2. Analisi del western blot
    1. Separare 30 μg di proteine su gel SDS-poliacrilamide e trasferire le proteine risolte sulle membrane PVDF.
    2. Bloccare le membrane con il 5% di latte scremato nel TBS contenente l'1% Tween-20, poi incubarle durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro Bax, Bcl-2 e caspasi-3 scrostata, marcatori proteici chiave comunemente valutati negli studi di cardiotossicitàDOX 17.
    3. Incubare con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano appropriati. Rilevare segnali utilizzando reagente chemiluminescenza potenziato e acquisire immagini con un sistema di imagingdigitale 18.
  3. Analisi dei dati
    1. Presentare i dati quantitativi come media ± SEM da tre repliche biologiche indipendenti.
    2. Eseguire analisi statistiche utilizzando GraphPad Prism, applicando ANOVA bidirezionale per confronti tra più gruppi e momenti temporali, oppure un test t a due code non accoppiato per confronti tra due gruppi. Un valore p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

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Valutazione della resa e della vitalità cellulare

I topi che ricevevano DOX mostravano un netto calo del peso corporeo rispetto al gruppo trattato con soluzione salina (Figura supplementare 1A). Il successo dell'istituzione del modello di cardiotossicità indotta da DOX acuta è stato ulteriormente confermato da un marcatore marcato per lesioni cardiache sieriche, inclusi cTnT e CK (Figura Supplementare 1B,C), n...

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Discussione

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L'isolamento riuscito di cardiomiociti adulti di alta qualità e tolleranti al calcio è essenziale per gli studi a livello cellulare della fisiopatologia cardiaca. Questo protocollo fornisce in modo affidabile cardiomiociti funzionali sia da cuori sani che patologici di topo, con due passaggi particolarmente cruciali per preservare la vitalità cellulare. Innanzitutto, ottimizzare e monitorare attentamente la durata della perfusione enzimatica. Una digestione insufficiente produce scarsa d...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro fu sostenuto dalla Natural Science Foundation of China (borsa 82230012 e 81830015 a N. Wang, borsa 82570478 a L. Xiao).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piatti a cluture a celle da 100 mmBio-filtrazione a getto TCD000100
100 & mu; Filtro per cellule MCorning431752
Tubi centrifughe da 15 mLBio-filtrazione a getto CFT011150
Tubi centrifughe da 50 mLBio-filtrazione a getto CFT011500
Vasi di coltura cellulare da 60 mmBio-filtrazione a getto TCD100060
Albumina Sirica Bovina (BSA)Sigma-AldrichA1470 
Collagenasi IISigma-AldrichC6885
Collagenasi IVSigma-AldrichC5138
Pinze emostatiche curveScienze della Vita RWDF22003-10
Forbici a estremità curvaScienze della Vita RWDS12001-09
Forbici finiScienze della Vita RWDS12000-09
PinzaScienze della Vita RWDF13014-12
Cannula residente (26G)Becton, Dickinson and Company381312
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS)MedChemExpressHY-150287
Isoflurane   Scienze della Vita RWDR510-22-10
Laminina (murina)Thermo Scientific23017015
Concentrato lipidico (definito chimicamente)MedChemExpressHY-K3019
M199 MediumSigma-AldrichM4530
Penicillina-StreptomicinaMedChemExpress  HY-K1006
Proteasi XIVSigma-AldrichP5147
Nastro indicatore di sterilizzazioneEstrazione e produzione del Minnesota (3M)CT060934701
Pompa a siringa (ISPLab01)Pompa di precisione Baoding ShenchenSC-49464A

Riferimenti

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