Articolo metodologico

Potenziamento dell'assorbimento del virus adeno-associato ricombinante intestinale tramite una formula di medicina tradizionale cinese

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DOI:

10.3791/70413

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24 aprile 2026

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1Faculty of Traditional Chinese Medicine, Naval Medical University, 2Oncology Department of Traditional Chinese Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University, 3State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Zhongshan Hospital, Fudan University, 4Shanghai Key Laboratory of Gene Editing and Cell Therapy for Rare Diseases, Engineering Research Center of Gene Technology (Ministry of Education), Fudan University, 5Institutes of Integrative Medicine, Fudan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per stabilire un modello di sacco intestinale evertito per valutare le interazioni tra la Medicina Tradizionale Cinese (MTC) e il virus adeno-associato ricombinante (rAAV) durante l'assorbimento intestinale, fornendo una piattaforma ex vivo per ottimizzare le strategie di somministrazione genica orale.

Abstract

La somministrazione orale del virus adenoassociato ricombinante (rAAV) ha un potenziale terapeutico significativo ma è limitata da un assorbimento intestinale inefficiente. La Medicina Tradizionale Cinese (MTC), ampiamente utilizzata nelle formulazioni orali, rappresenta una fonte promettente di potenziatori di assorbimento. Tuttavia, i suoi potenziali effetti sull'assorbimento e la trasduzione del rAAV restano in gran parte inesplorati. Il modello del sacco intestinale evertito fornisce una piattaforma quantitativa ex vivo per indagare queste interazioni. Qui viene presentato un protocollo dettagliato che utilizza il modello del sacco intestinale evertito per valutare quantitativamente la traslocazione del virus adenoassociato (rAAV) attraverso l'epitelio intestinale e la successiva trasduzione genica all'interno del tessuto intestinale in condizioni sperimentali controllate. I passaggi chiave includono il prelievo di segmenti intestinali da roditori di laboratorio, l'evertaggio dei segmenti per formare sacchi e il riempimento di ogni sacco con tampone ossigenato. I sacchi evertiti sono immersi in un tampone ossigenato contenente particelle rAAV e incubati a 37 °C per consentire l'esposizione luminale e il trasporto vettoriale. Le analisi endpoint prevedono il campionamento del fluido interno (serosale) per misurare le particelle rAAV che hanno attraversato l'epitelio, oltre all'analisi del tessuto del sacco per l'espressione del transgene e determinare l'efficienza della trasduzione. Testando più regioni intestinali, il protocollo fornisce informazioni sulle differenze specifiche per segmento nell'assorbimento rAAV. Inoltre, l'inclusione di GZNG, una formula classica TCM, durante l'incubazione consente la valutazione del suo impatto sull'assorbimento e la trasduzione dei vettori. L'approccio del sacco intestinale everted fornisce una piattaforma preziosa per lo screening dei sierotipi rAAV, potenziatori di erogazione e interazioni tra vettori rAAV e componenti TCM. Il suo design semplice e parallelizzabile consente anche screening ad alto rendimento negli studi preclinici.

Introduzione

Il virus adenoassociato ricombinante (rAAV) rappresenta una piattaforma promettente per la terapia genica sistemica, con tre vie principali di somministrazione attualmente esplorate:iniezione endovenosa 1, iniezione intraperitoneale2 e somministrazioneorale 3. Sebbene le vie di iniezione endovenosa e intraperitoneale siano state ampiamente studiate, la somministrazione orale, un approccio non invasivo, rimane relativamente poco esplorata. La fattibilità della somministrazione orale di rAAV è stata dimostrata per la prima volta da Xin et al.4, che hanno riportato una trasduzione riuscita della mucosa intestinale e l'induzione di una risposta immunitaria anti-HIV dopo la somministrazione orale di rAAV2. Analogamente, Hara et al.3,5 hanno dimostrato che rAAV/Aβ orale può trasducere la mucosa gastrointestinale e ridurre la deposizione amiloide cerebrale, mentre Steel et al.6 hanno riscontrato che la vaccinazione orale ha dimostrato una sopravvivenza superiore e un'immunità antitumorale rispetto all'iniezione intramuscolare. Lo stesso studio ha riportato che rAAV6 ha mostrato tropismo intestinale più forte rispetto a rAAV5. Oltre alle applicazioni vaccinali, il potenziale terapeutico è stato raggiunto in altri modelli di malattia. Ma et al.7 e Hao et al.8 hanno dimostrato che rAAV orale ha portato a soppressione tumorale e terapia antifibrotica rispettivamente nel fegato e nello stomaco, dopo trasduzione gastrointestinale. Huang et al.9 hanno identificato il sierotipo ingegnerizzato Rec2 come selettivamente trasducente del tessuto adiposo marrone dopo la somministrazione orale, in contrasto con il tropismo epatico predominante osservato con la somministrazioneendovenosa. Nonostante questi risultati pionieristici, la ricerca sulla somministrazione orale di rAAV rimane limitata, in parte a causa della mancanza di sistemi di screening in vitro per la valutazione su larga scala.

Il modello del sacco intestinale evertito, sviluppato da Wilson e Wiseman nel1954-11, rimane una preziosa piattaforma in vitro per studiare i meccanismi di assorbimento intestinale dei farmaci. A differenza di altri apparecchi di simulazione di assorbimento, questo sistema tiene conto in modo unico di molteplici processi fisiologici oltre la semplice diffusionepassiva 12. Questa caratteristica lo rende particolarmente vantaggioso per lo studio dellaMTC 13. Utilizzando questo sistema, è documentato che i composti della MTC spesso mostrano modelli di assorbimento intestinale dipendenti dai segmenti in tutto il tratto gastrointestinale. Ad esempio, uno studio ha dimostrato che molteplici alcaloidi di Wuwei Qingzhuo San vengono assorbiti selettivamente in diversi segmenti intestinali, con il jegiuno e l'ileo che mostrano l'assorbimento piùattivo 14. Inoltre, la co-somministrazione di costituenti della MTC può modulare l'assorbimento intestinale. Liao et al.15 hanno riportato che la co-somministrazione con estratto di Radix Angelicae dahuricae ha significativamente aumentato l'assorbimento intestinale della puerarina, evidenziando l'influenza delle interazioni della MTC sull'assorbimento segmentare. Pertanto, il modello del sacco intestinale evertito rappresenta uno strumento ideale per chiarire i complessi comportamenti di assorbimento e le interazioni sinergiche insite nelle formulazioni della MTC e in altri farmaci.

La selezione di un modello appropriato per la ricerca sull'assorbimento del rAAV richiede una comprensione sfumata dei compromessi tra accuratezza fisiologica, complessità tecnica e throughput. La tabella sottostante riassume i principali modelli sperimentali utilizzati per studiare l'assorbimento intestinale.

Questo studio fornisce una prova di concetto che il modello del sacco intestinale evertito può essere utilizzato per indagare l'assorbimento intestinale di vettori del virus adenoassociato ricombinante (rAAV). Fornisce preziose informazioni su come la co-somministrazione della MTC influenzi l'assorbimento intestinale dei vettori rAAV, sottolineando la necessità di una ulteriore caratterizzazione delle loro interazioni meccanicistiche in condizioni fisiologicamente rilevanti. Ottimizzare le strategie di somministrazione orale potenziate dalla MTC attraverso questo approccio può facilitare lo sviluppo di terapie rAAV non invasive, migliorando così l'aderenza e l'accessibilità al trattamento per i pazienti.

I ricercatori dovrebbero valutare il modello del sacco intestinale evertito basandosi sui seguenti criteri per assicurarsi che sia allineato ai loro obiettivi sperimentali. Le applicazioni appropriate includono lo screening rapido dei sierotipi, la valutazione da adiuvanti/potenziatori e la cinetica regionale, mentre applicazioni inappropriate e limitazioni includono studi di espressione a lungo termine (>48 h) e farmacologia sistemica.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in stretta conformità con le linee guida approvate dal Comitato di Etica degli Animali della Naval Medical University (approvazione CHEC (A.E)-2025011).

1. Preparazione della soluzione di Tyrode e delle soluzioni virali

  1. Precondizionamento della soluzione di Tyrode:
    1. Prepara due aliquote da 500 mL di soluzione di tirodo (pH 7,4) (vedi Tabella dei materiali).
    2. Raffredda una aliquota a 4 °C e riscalda l'altra a 37 °C.
    3. Riempi ogni aliquota con 95% O₂/5% CO₂.
  2. Preparazione della soluzione virale:
    1. Aggiungere AAV9-CMV-EGFP ricombinante alla soluzione del tirodo a 37 °C per ottenere una concentrazione finale di 1 x 1011 vg/mL (condizione di controllo).
    2. Per la condizione sperimentale, integrare la preparazione AAV9-CMV-EGFP con una formula TCM GZNG (Tabella 2) disciolta nel veicolo fino a una concentrazione finale di 200 mg/mL.
    3. Per il controllo solo GZNG, aggiungere GZNG (200 mg/mL) alla soluzione di Tyrode senza AAV9 CMV-EGFP.
      NOTA: Prepara le diluizioni virali immediatamente prima dell'uso per preservare l'infettività. Il pH della soluzione GZNG è approssimativamente 5,0–6,0.

2. Preparazione animale e prelievo dei tessuti intestinali

  1. Digiuno: Digiunare i ratti Sprague–Dawley di 8 settimane per 24 ore prima dell'intervento. Garantire un libero accesso all'acqua durante questo periodo per mantenere l'idratazione.
    NOTA: Il digiuno aiuta a minimizzare il contenuto intestinale e garantisce una misurazione accurata dell'assorbimento intestinale durante esperimenti ex vivo .
  2. Controlla la salute degli animali prima del digiuno e assicurati che siano in buone condizioni. Escludi dallo studio gli animali con segni di disagio o malattia.
  3. Somministrare pentobarbital sodico (200 mg/kg, intraperitoneale) per indurre anestesia profonda. Verificare che l'animale sia completamente anestetizzato controllando la mancanza di riflessi e respirazione regolare.
    ATTENZIONE: Il Pentobarbital è una sostanza controllata pericolosa; maneggiare con guanti e DPI in una cappa per evitare il contatto con la pelle o l'inalazione e segui le linee guida istituzionali per uno smaltimento sicuro e una risposta alle emergenze.
  4. Eseguire l'eutanasia tramite lussazione cervicale una volta confermata l'anestesia profonda.
  5. Preleva un tampone sulle aree addominali e toraciche con etanolo al 75% per disinfettare la pelle e ridurre la contaminazione miagnica durante l'intervento.
  6. Effettuare un'incisione mediana lungo la regione addominale usando forbici chirurgiche sterili per esporre la cavità peritoneale.
  7. Separare delicatamente ed esponere stomaco e intestini. Utilizzare un drappo sterile per proteggere i tessuti e gli organi circostanti durante la procedura.
  8. Transeccare con cura lo sfintere pilorico per separare lo stomaco dal duodeno prossimale. Assicurarsi che il duodeno rimanga intatto per le procedure successive.
  9. Dissezionare il colon distale alla giunzione retto-anale evitando qualsiasi danno ai tessuti circostanti.
  10. Libera delicatamente gli attacchi mesenterici dall'intestino tenue usando pinze o forbici sottili. Fai attenzione a non allungare o strappare il mesenterio.
  11. Trasferire immediatamente l'intestino tenue intatto in una soluzione gelida di Krebs-Ringer Buffer ossigenato (soluzione di Tyrode, 4 °C).

3. Preparazione ex vivo del sacco intestinale evertito

  1. Selezionare i segmenti intestinali come segue: un segmento di 8 cm situato a 10 cm distale rispetto al piloro è stato designato come segmento duodenale.
  2. Raccogliere un segmento jejunale di 8 cm che inizia da 16 cm distale al segmento duodenale.
  3. Ottenere un segmento ileale di 8 cm iniziando con altri 16 cm distali fino al segmento jejunale.
  4. Per il colon, si preleva un segmento di 8 cm situato a 5 cm prossimale all'estremità cieca del cecal.
    NOTA: Assicurarsi che il tessuto sia elastico e intatto, adatto all'inversione durante la preparazione.
  5. Risciacquo il lumen intestinale con una siringa da 2 mL riempita con soluzione di Tyrode fredda e ossigenata.
  6. Smaltire gli effluenti seguendo i protocolli istituzionali di rifiuti biologici per mantenere la sterilità e prevenire la contaminazione.
    ATTENZIONE: Maneggiare i rifiuti biologici utilizzando guanti e dispositivi di protezione adeguati per evitare l'esposizione a materiale potenzialmente contagioso. Smaltire tutti i rifiuti biologici e gli effluenti seguendo le linee guida istituzionali di sicurezza per i rischi biologici per prevenire la contaminazione ambientale.
  7. Inserire l'estremità prossimale del segmento intestinale su una barra di vetro lucidata da 4 mm. Assicurarsi che la superficie della barra sia liscia per prevenire lacerazioni mucose.
  8. Legare l'estremità distale del segmento con una sutura di seta 2-0 per fissare il tessuto al bastoncino. Confermare che il tessuto rimanga stabile durante l'inversione.
  9. Everti delicatamente il segmento intestinale facendo scorrere il tessuto lungo il bastone finché la mucosa non sarà completamente esposta. Evita allungamenti o torsioni eccessive per mantenere l'integrità dei tessuti.
  10. Iniettare 2 mL di soluzione di Tyrode gelida nel lumen per verificare eventuali perdite. La perdita accettabile dovrebbe essere del <5% entro 1 minuto. Se viene rilevata perdita, regolare le suture e verificare l'inversione completa della superficie mucosa.
    NOTA: Eseguire l'eversione in un ambiente freddo per minimizzare la degradazione enzimatica e preservare la vitalità del tessuto.
  11. Inserire un capillare di vetro da 3 mm lungo 5 cm all'estremità aperta del segmento evertito per servire come ingresso per la perfusione. Avanzare delicatamente la cannula per evitare lacerazioni mucose.
  12. Fissa la cannula con suture di seta 2-0. Assicurati che la cannula rimanga ferma in posizione senza collassare o ostruire il flusso dei liquidi.
  13. Applica una lieve tensione ai punti per mantenere la corretta forma del sacco digestivo. Evita pieghe o torsioni, poiché questi possono interrompere la perfusione e alterare i risultati di assorbimento.
  14. Evitare un tessuti eccessivo, poiché ciò potrebbe danneggiare il tessuto o deformare il sacco. Mantieni una tensione uniforme durante tutto l'esperimento. Esamina regolarmente il sacco evertito per eventuali perdite o danni strutturali. Se la perdita supera il 5%, ripara o sostituisci il segmento prima di continuare.

4. Trasduzione e incubazione dell'AAV

  1. Inserire ogni sacco evertito in un tubo conico da 7 mL contenente 4 mL di soluzione di Tirode ossigenata a 37 °C.
  2. Aggiungere la soluzione virale come segue: Controllo: AAV9-CMV-EGFP da solo; Sperimentale: AAV9-CMV-EGFP + GZNG.
  3. Incubare staticamente a 37 °C per 2 ore, durante le quali una miscela gassa al 95% diO 2/5% CO2 è stata continuamente fatta bollire nella soluzione.

5. Campionamento, elaborazione degli endpoint e analisi

  1. Campionamento temporale
    1. Preleva 50 μL di liquido sieroso da ogni sacco intestinale a 0, 30, 60, 90 e 120 min utilizzando una microsiringa calibrata. Assicurati un campionamento accurato senza introdurre bolle d'aria.
    2. Sostituire immediatamente il fluido ritirato con 50 μL di soluzione di tirodo preriscaldata (37 °C) per mantenere l'equilibrio osmotico e il volume interno. Minimizzare il tempo tra il ritiro e la sostituzione per mantenere condizioni sperimentali coerenti.
      NOTA: Quando si utilizza una microsiringa (ad esempio, la siringa Hamilton), mantenere la sterilità e maneggiarla con delicatezza per evitare danni alla membrana del sacco intestinale.
    3. Effettuare campionamenti tempestivi in ogni momento per minimizzare il disturbo dell'ambiente di incubazione.
  2. Determinazione del titolo del virus
    1. Estrarre il DNA totale dal fluido sieroso utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico animale disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.
    2. Eseguire la quantificazione assoluta del numero di copie genomiche del vettore rAAV tramite qPCR. Utilizzare un SYBR Green Kit con primer ITR. Eseguire l'amplificazione qPCR in una piastra standard a 96 pozzi utilizzando un termociclatore con le seguenti condizioni di ciclaggio: Denaturazione iniziale: 95°C per 10 minuti; Denaturazione: 95°C per 15 secondi; Ricottura ed estensione: 60°C per 1 minuto; 40 cicli in totale
    3. Per quantificare il numero di copie genomiche, generare una curva standard utilizzando diluizioni seriali di plasmidi rAAV-CMVp-gfp (1 ng, 0,1 ng e 0,01 ng). Utilizzare queste diluizioni per calcolare il numero di copie del genoma virale basandosi sui corrispondenti valori della soglia ciclica (Ct).
    4. Determinare il numero di copie genomiche del vettore nel fluido seroso raccolto utilizzando la curva standard. I risultati sono stati riportati come copie genomiche per 100 ng di DNA estratto.
      NOTA: Assicurarsi che tutti i reagenti e le attrezzature siano sterili per prevenire la contaminazione durante l'estrazione del DNA e l'analisi qPCR. Utilizzare controlli appropriati per verificare l'accuratezza della qPCR, inclusi i controlli senza modello (NTC) e gli standard plasmidi.
    5. Esegui la qPCR in triplicata per ogni campione per garantire la riproducibilità e l'affidabilità dei risultati.
  3. Elaborazione terminale del tessuto
    1. Aspira tutto il liquido luminale residuo da ogni sacco intestinale usando una pipetta sterile. Maneggia delicatamente per evitare la rottura del tessuto.
    2. Risciacquare ogni sacco tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente l'1% di penicillina–streptomicina (P/S) per rimuovere il mezzo residuo, i batteri e le impurità. Assicurarsi un lavaggio accurato per mantenere la sterilità per applicazioni a valle.
    3. Taglia il tessuto intestinale in frammenti da 2mm 3 (2 mm * 2 mm * 0,5 mm) usando forbici chirurgiche sterili o lame. Mantieni i frammenti di dimensioni uniformi per un'incubazione costante.
    4. Incubare i frammenti di tessuto in 10 mL di DMEM integrati con 10% FBS e 1% (v/v) P/S a 37 °C per 48 ore in un incubatore umidificato con 5% di CO₂. Il mezzo di coltura dovrebbe essere rinfrescato ogni 12 ore durante l'incubazione.
      NOTA: Questo passaggio mantiene la vitalità dei tessuti e permette il recupero cellulare dopo l'esperimento. Assicurarsi che la mucosa rimanga intatta durante il taglio e il lavaggio. Eseguire tre lavaggi completi con PBS per eliminare detriti e contaminanti microbici. Mantenere una temperatura costante (37 °C) e un'alta umidità per sostenere l'attività metabolica e la salute dei tessuti.
      ATTENZIONE: Maneggiare i frammenti di tessuto con strumenti sterili ed evitare stress meccanico per preservare l'integrità epiteliale.
  4. Analisi post-incubazione
    1. Aliquota A (Analisi istologica):
      1. Fissare i campioni di tessuto nel 4% di paraformaldeide (PFA) per 24 ore a 4 °C per preservare l'architettura cellulare.
      2. Dopo la fissazione, inserire i tessuti nel composto OCT ed eseguire la colorazione di Ematossilina ed Eosina (H&E) per valutare l'integrità e la morfologia dei tessuti.
        ATTENZIONE: Il paraformaldeide è un fissativo pericoloso; maneggiarlo all'interno di una cappa fumaria utilizzando l'attrezzatura di protezione personale appropriata
    2. Aliquota B (Analisi della fluorescenza e quantificazione del genoma):
      1. Congelare rapidamente il tessuto rimanente in azoto liquido e conservare a -80 °C fino a un ulteriore processo.
      2. Utilizzare i campioni congelati per la microscopia a fluorescenza per rilevare l'espressione di EGFP, valutando l'efficienza della trasfezione o l'assorbimento virale.
      3. Eseguire l'estrazione del DNA seguita da qPCR per determinare il numero di copie del genoma virale o l'espressione del transgene.

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Risultati

Questo protocollo è stato utilizzato per valutare l'efficienza della somministrazione genica mediata da AAV9 attraverso diversi segmenti dell'intestino tenue, nonché l'impatto del trattamento GZNG sul potenziamento del trasferimento e dell'espressione genica. Sono stati osservati diversi esiti chiave, che hanno dimostrato sia l'applicazione riuscita del protocollo sia una certa variabilità che può verificarsi in determinate condizioni.

La valutazione dell'espr...

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Discussione

In questo studio è stato sviluppato un nuovo approccio in vitro per valutare l'assorbimento intestinale del rAAV adattando il classico modello del sacco intestinale evertito. Questo metodo consente un'analisi specifica per segmento dell'efficienza della trasduzione dell'AAV attraverso l'intestino tenue in condizioni controllate e la valutazione degli effetti sinergici tra TCM e rAAV. Qui vengono discussi i passaggi critici, la risoluzione dei problemi e le modifiche, le limitazi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare tutti i colleghi e collaboratori che hanno fornito preziose discussioni e assistenza tecnica durante tutto questo studio. Apprezziamo inoltre il sostegno istituzionale che ha reso possibile questo lavoro. Questo lavoro è stato finanziato dal finanziamento #82474349 della National Natural Science Foundation of China (a CL).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMWISENT319-005-CLLiquido, con 4,5 g/L di D-glucosio, con L-Glutamina, fenolo rosso e piruvato di sodio
Primer qPCR della regione CDS EGFPTSINGKEF: 5'-ACTTCTTCAAGTCCGCCATG-3'; R: 5'-TGTCGGCCATGATATAGACG-3'
Siero bovino fetaleWISENT086-550Qualità superiore, grado di coltura cellulare primaria
Penicillina-Streptomicina(P/S)WISENT450-201-ELQuesta soluzione contiene 10.000 unità/mL di penicillina e 10.000 & micro; g/mL di estreptomicina.
PrimeScript RT Master Mix (Tempo Reale Perfetto)TaKaRaRR036A
Kit universale di estrazione RNA TaKaRa MiniBESTTaKaRa9767
TSINGKE TSE401 ArtiCanCEO SYBR qPCR MixTSINGKETSE401Questo prodotto è adatto per esperimenti quantitativi di fluorescenza utilizzando il metodo SYBR Green dye ed è compatibile con vari strumenti di PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale.
TSINGKE TSP202-200 Trelief  Kit di DNA Genomico Animale Hi-PureTSINGKETSP202-200
La soluzione di TyrodeYuan YeR20268-500mlÈ composto principalmente da cloruro di sodio, cloruro di potassio, cloruro di magnesio, fosfati, cloruro di calcio, glucosio e HEPES.

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