Un protocollo semplificato e robusto per l'isolamento e l'espansione a lungo termine delle cellule epiteliali primarie dell'endometrio umano

Summary

La coltura primaria delle cellule epiteliali endometriali umane (HEEC) è tecnicamente impegnativa. Questo protocollo combina la digestione a enzimi misti con l'inibitore ROCK (Y-27632) per migliorare la sopravvivenza e l'espansione cellulare mantenendo l'identità epiteliale, fornendo una solida piattaforma per la ricerca endometriale e le applicazioni rigenerative.

Abstract

La ricerca sui disturbi endometriali, inclusa l'iperplasia endometriale associata al tamoxifene, è stata limitata dalla mancanza di modelli epiteliali in vitro robusti. I metodi convenzionali per isolare le cellule epiteliali endometriali umane (HEEC) sono spesso inefficienti, tecnicamente impegnativi e poco scalabili. Qui viene descritto un protocollo semplificato, senza alimentatori, che integra la digestione a enzimi misti, la lisi degli eritrociti e il trattamento sostenuto con inibitori ROCK (Y-27632) per consentire un isolamento e un'espansione efficienti degli HEEC primari. L'inclusione di Y-27632 è fondamentale per mitigare l'apoptosi indotta dalla dissociazione e per aumentare l'adesione cellulare nelle prime fasi iniziali. Questo approccio supporta il passaggio seriale mantenendo l'identità epiteliale per almeno 3 passaggi, con la morfologia preservata oltre i 10 passaggi. La caratterizzazione tramite Western blot e immunofluorescenza conferma un'elevata espressione di citocheratina 18 ed E-cadherina, con una progressiva riduzione dei contaminanti stromali positivi alla vimentina in condizioni di coltura selettiva. Affrontando le principali limitazioni tecniche, questo metodo fornisce una fonte affidabile e scalabile di cellule epiteliali per studi meccanicistici, modellazione delle malattie, screening farmacologico e applicazioni rigenerative nella ricerca sull'endometrio. Il flusso di lavoro standardizzato offre un'alternativa ai complessi sistemi di co-coltura, facilitando un accesso più ampio a modelli cellulari primarie di alta qualità.

Introduction

Modelli in-vitro affidabili sono essenziali per far avanzare lo studio dei disturbi endometriali, in particolare quelli associati al tamoxifene (TAM⁾¹. Sebbene la TAM sia ampiamente utilizzata come terapia endocrina per il cancro al seno, la sua attività parziale di agonista estrogenico nell'endometrio aumenta notevolmente l'incidenza di iperplasia endometriale, polipi e, in alcuni casi, trasformazione^{maligna 2}. La gestione clinica attuale della patologia endometriale associata al tamoxifene si basa principalmente sulla terapia con progesterone o su interventi chirurgici, entrambi con limitazioni significative. Il trattamento con progesterone è spesso associato a effetti avversi come sanguinamento intermittente e aumento di peso, mentre gli approcci chirurgici possono causare lesioni endometriali irreversibili e compromettere la^{fertilità 3}. Queste limitazioni sottolineano la necessità di modelli epiteliali robusti che possano supportare studi meccanicistici e aiutare nello sviluppo di strategie terapeutiche migliorate. Tuttavia, i progressi in questo ambito sono stati principalmente limitati da sfide tecniche nell'ottenere cellule epiteliali endometriali umane ad alta purezza ed espansibili (HEEC).

Lavori fondamentali in questo campo sono stati riportati da Arnold et al. (2001), che hanno isolato popolazioni cellulari stromali ed epiteliali tramite digestione della collagenasi e filtrazione sequenziale con setaccio, raggiungendo una purezza superiore al 98% come verificato dall'immunocolorazione⁴. Nonostante il successo, il metodo dipendeva dalla digestione a singolo enzima, richiedeva un trattamento prolungato e si basava sulla filtrazione a passo per rimuovere contaminanti stromali ed eritrociti, rendendo il flusso di lavoro laborioso e difficile da^{standardizzare 4}. Successivamente, Yokomizo et al. (2002) stabilirono un sistema primario di coltura HEEC da campioni di isterectomia utilizzando una co-coltura tridimensionale con cellule stromali^{nutritive 5}. Sebbene il microambiente basato su alimentatori supportasse parzialmente la crescita epiteliale, il sistema permetteva solo passaggi limitati, tipicamente non più di cinque passaggi, il che ne limitava l'utilità per applicazioni che richiedevano un'espansione epiteliale stabile^{su larga scala 5}.

Per superare queste limitazioni, è stato sviluppato un protocollo semplificato e altamente riproducibile per l'isolamento HEEC e la coltura a lungo termine. Guidati da lavori precedenti che dimostravano che l'inibitore ROCK Y-27632 migliora notevolmente l'efficienza della coltura primaria per cheratinociti umani, cellule epiteliali gengivali e cellule epiteliali mammarie, lo stesso principio è stato applicato al tessuto^{endometriale 6,7,8}. Questo approccio incorpora tre caratteristiche chiave: digestione a enzimi misti per promuovere una dissociazione efficiente dei tessuti, un passaggio essenziale di lisi degli eritrociti per ridurre la contaminazione precoce e facilitare l'attacco epiteliale, e integrazione continua con Y-27632 per sopprimere l'apoptosi, sostenere l'adesione e aumentare la capacità proliferativa. Utilizzando questa strategia, gli HEEC possono essere espansi su più passaggi mantenendo la morfologia epiteliale e un'alta espressione di CK18 ed E-cadherin ^9,10. In particolare, il passaggio seriale per almeno 3 generazioni non ha prodotto deriva fenotipica rilevabile, dimostrando la stabilità e la scalabilità del sistema di coltura.

Questo metodo affronta direttamente le sfide tecniche di lunga data nella coltura primaria HEEC, tra cui elevati requisiti di input tissutali, flussi di lavoro complessi, bassa riproducibilità e potenziale di espansione limitato. Preservando l'identità epiteliale e le caratteristiche funzionali durante il passaggio, il protocollo fornisce una piattaforma affidabile per la ricerca sulla rigenerazione endometriale, la fisiopatologia, lo screening ad alto rendimento dei farmaci e le interazioni cellula–biomateriale. Integrando la lavorazione dei tessuti con l'espansione seriale, questo flusso di lavoro standardizzato affronta un collo di bottiglia di lunga data nella biologia riproduttiva e supporta applicazioni future nell'ingegneria tissutale, nella medicina rigenerativa e nella terapia personalizzata.

Questo protocollo richiede campioni di tessuto freschi, preferibilmente processati entro 24 ore dalla raccolta. Le caratteristiche di resa e crescita cellulare possono variare a seconda della fonte del tessuto, come i polipi endometriali rispetto all'endometrio normale. Le fonti comuni di fallimento includono una digestione tessutale incompleta, un'eccessiva contaminazione da eritrociti o un'integrazione insufficiente di Y-27632. Sebbene il sistema supporti l'espansione attraverso più passaggi, potrebbero essere necessarie ulteriori ottimizzazioni per mantenere la stabilità fenotipica durante la coltura estesa.

Protocol

Sono stati prelevati nuovi campioni di tessuto endometriale da campioni di polipi uterini resezionati chirurgicamente da pazienti presso il Primo Ospedale Affiliato dell'Università Medica Cinese dello Zhejiang. Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le linee guida approvate dal Comitato Etico Medico del Primo Ospedale Affiliato dell'Università Medica Cinese dello Zhejiang (Protocollo n. 2025-KLS-569-01; approvato il 14 settembre 2025). La manipolazione dei campioni umani primari è stata effettuata in un armadietto di sicurezza biologica di Classe II utilizzando attrezzature di protezione individuale appropriate, inclusi camice da laboratorio, guanti e protezioni oculari. Tutti i reagenti enzimatici sono stati gestiti in conformità con le normative di sicurezza istituzionali e le linee guida delle Scheda Dati di Sicurezza dei Materiali (MSDS).

1. Acquisizione di tessuto

1. Raccogliere tessuto endometriale fresco da campioni chirurgici ottenuti da donne adulte. Trasferire il tessuto in tubi sterili contenenti 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrati con penicillina/streptomicina (P/S) al 3%.
   NOTA: Tutti i tessuti devono essere processati entro 24 ore dalla raccolta chirurgica.

2. Pretrattamento del tessuto

1. Agitare il tessuto nella soluzione per lavaggio (Tabella 1) per due lavaggi consecutivi di 2 minuti ciascuno per rimuovere muco e coaguli di sangue.
2. Risciacquo brevemente il tessuto con 5 mL di etanolo al 75% per 5 secondi per disinfettare la superficie.
3. Trasferire immediatamente il fattendino in 20 mL di soluzione per lavaggio e lavare per due lavaggi, ciascuno di 5 minuti, per rimuovere l'etanolo residuo.
   NOTA: Poiché l'etanolo è infiammabile, esegui questa fase lontano dalle fiamme aperte e smalta i rifiuti contenenti etanolo secondo le linee guida istituzionali per la sicurezza chimica.

3. Digestione dei tessuti e raccolta cellulare

1. Triturazione dei tessuti
   1. Trita il tessuto endometriale con due lame sterili finché i frammenti (~2^{mm 3}) possono essere aspirati tramite una punta di pipetta da 1 mL (circa 10 minuti).
   2. Trasferire il tessuto tritato in un tubo centrifuga da 50 mL.
2. Digestione enzimatica
   1. Aggiungere 10 mL di soluzione digertiva (Tabella 1) al tubo contenente i frammenti di tessuto.
   2. Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti. Scuoti delicatamente il tubo ogni 15 minuti per facilitare la digestione.
   3. Continuare l'incubazione finché i frammenti di tessuto non sono visibilmente dissociati e la soluzione appare torbida a causa delle cellule rilasciate.
3. Terminazione della digestione
   1. Aggiungere 10 mL di soluzione neutralizzante per interrompere la digestione enzimatica.
   2. Mescola accuratamente pipettando su e giù circa 15 volte usando una pipetta P1000 impostata a 800 μL.
4. Filtrazione e centrifugazione
   1. Filtra la sospensione digerita attraverso un filtro a rete da 100 μm.
   2. Centrifugare a 156 × g per 5 minuti a 25 °C.
5. Lisi dei globuli rossi (RBC)
   1. Aspira con cura il soprandanante senza disturbare il pellet.
   2. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di buffer di lisi dei globuli rossi pre-raffreddati.
   3. Incubare sul ghiaccio (circa 4 °C) per 3–5 minuti con una leggera agitazione.
6. Terminazione della lisi
   1. Aggiungi ≥10 mL di PBS o mezzo intero per fermare la reazione della lisi.
   2. Centrifuga a 156 × g per 5 minuti a 25 °C.

4. Iniziazione della cultura primaria

1. Lavaggio e centrifugazione
   1. Aspira con cura il soprandanante senza disturbare il pellet.
   2. Risospendere il pellet in 20 mL di soluzione neutralizzante.
   3. Mescola pipettando circa 15 volte.
   4. Centrifugare a 156 × g per 5 minuti a 25 °C.
2. Risospensa e posizionamento
   1. Aspira il soprandante.
   2. Sospendere delicatamente la pellet cellulare in 10 mL di mezzo di coltura iniziale contenente 10 μM Y-27632 pipettando lentamente su e giù 8–10 volte con una pipetta da 1 mL.
   3. Placca la sospensione delle celle in una piastra di coltura da 100 mm.
      NOTA: Per una densità di semina ottimale iniziale, si seleziona il recipiente di coltura in base alla resa stimata della cellula. Se la resa attesa è >1 × 10⁶ celle, si utilizza un piatto da 100 mm e, per rese più basse, si utilizza un piatto da 60 mm. Regolare il volume medio di conseguenza (ad esempio, 10 mL per una parabola da 100 mm; 4 mL per una parabola da 60 mm).
3. Condizioni culturali
   1. Incubare il piatto a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂.
   2. Sostituisci il substrato con un nuovo substrato per coltura epiteliale senza Y-27632 ogni 3 giorni.
      NOTA: Monitorare l'attacco e la morfologia cellulare; Rinnova il mezzo ogni 2 giorni una volta che le cellule iniziano a proliferare.

5. Passaggio cellulare

1. Preparazione alla tripsinizzazione
   1. Quando le colture raggiungono l'80%–90% di confluenza, si rimuove il piatto da 100 mm dall'incubatore.
   2. Scartate il mezzo esaurito.
   3. Risciacqua le cellule due volte con 2 mL di PBS.
   4. Aspira con cura e rimuovi eventuali PBS residui.
2. Tripsinizzazione
   1. Aggiungi 2 mL di tripsina allo 0,05% al piatto.
   2. Fai ruotare delicatamente per garantire una copertura uniforme dello strato cellulare.
   3. Incubare a 37 °C per 7 minuti.
   4. Esaminare le cellule al microscopio (obiettivo 40x) per confermare il distacco.
3. Neutralizzazione e raccolta
   1. Aggiungi 8 mL di soluzione neutralizzante per fermare la digestione della tripsina.
   2. Trasferire la sospensione della cella su un tubo centrifuga da 15 mL.
   3. Pipette circa 15 volte per ottenere una sospensione a singola cella.
   4. Centrifugare a 156 × g per 5 minuti a 25 °C.
4. Risospensa e risemina
   1. Aspira il sovrandanante senza disturbare il pellet.
   2. Sospezione delicata della pellet cellulare in 10 mL di mezzo cellulare epiteliale pipettando su e giù circa 10 volte con una pipetta da 1 mL.
   3. Semina 1 × 10⁶ cellule in 10 mL di mezzo cellulare epiteliale in un nuovo piatto da 100 mm.
   4. Regolare la densità di semina per favorire cellule isolate e ben distribuite o piccoli gruppi il giorno successivo, evitando il sovraffollamento.
5. Manutenzione post-passaggio
   1. Incubare in condizioni di coltura standard (37 °C, 5% CO₂).
   2. Osserva regolarmente la coltura e sostituisci il substrato epiteliale ogni 2 giorni.
      NOTA: Le cellule sono tipicamente pronte per applicazioni a valle dopo il primo o il secondo passaggio, una volta ottenuto un monostrato sano e aderente con confluenza dell'≥80%.
      ATTENZIONE: Tutti i materiali che sono entrati in contatto con cellule umane primarie sono stati trattati come potenziali rischi biologici. Prima dello smaltimento o di un'ulteriore lavorazione, questi materiali venivano disinfettati utilizzando candeggina al 10% in conformità con le linee guida istituzionali di biosicurezza.

Results

Il successo dell'istituzione del sistema primario di coltura HEEC è stato confermato tramite valutazioni morfologiche, proliferative e molecolari, come illustrato nella Figura 1. Combinando la digestione a enzimi misti, la lisi degli eritrociti e un inibitore ROCK, questo protocollo ha permesso un isolamento efficiente e un'espansione stabile delle cellule epiteliali dal tessuto endometriale umano.

Le osservazioni morfologiche han...

Discussion

Stabilire un modello affidabile in vitro delle cellule epiteliali endometriali umane (HEEC) è essenziale per indagare la biologia e la patologia^{endometriale 11}. Sebbene siano stati sviluppati diversi metodi per l'isolamento HEEC, la maggior parte rimane limitata dalla complessità tecnica, bassa efficienza e potenziale di espansione^{limitato 4,5}. Molti protocolli si basano anche su layer feeder, che...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Solarbio	CAS: 42613-33-2	Per l'isolamento degli HEEC
Collagenasi di tipo I	Merck	SKU:SCR103	Per l'isolamento degli HEEC
100 & micro; Filtro a mesh M	Solarbio	431752	Per la filtrazione HEEC
coniglio anti-CK18	abcam	ab133263	Per la colorazione immunofluorescenza per verificare il marcatore di differenziazione degli HEEC
coniglio anti-CDH1	abcam	ab40772	Per la colorazione immunofluorescenza per verificare il marcatore di differenziazione degli HEEC
coniglio anti VIM	abcam	ab16700	Per la colorazione immunofluorescenza per verificare il marcatore di differenziazione degli HEEC
4% di paraformaldeide	solarbio	P0099	Per la colorazione immunofluorescenza per verificare il marcatore di differenziazione degli HEEC
Incubatore CO2	Thermo Scientific	42820906	Per incubazione cellulare
Centrifuga	Eppendorf	5404HN133048	Centrifuga a celle
Piatto di coltura cellulare da 100mm	Corning	430167	Per la coltura cellulare
Tubo centrifuga da 50 ml	Corning	430829	Per centrifugazione a celle
Tubi microcentrifughe da 1,5 ml	NIDO	081722CK01	Per la digestione cellulare
Filtro di cellule	Solarbio	431752	Filtrazione cellulare
Soluzione tamponata a fosfato	Tecono	20201033	Soluzione di lavaggio
DMEM	Gibco	8122622	Componente del mezzo di neutralizzazione
Penicillina/Streptomicina	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotici
Siero bovino fetale	Gibco	2556132P	Componente del mezzo di neutralizzazione
0,05% tripsina	Basalmedia	K431010	Per HEECs e nbsp; Dissociazione
Y-27632	Solarbio	IY0040	Inibitore ROCK
Buffer di lisi dei globuli rossi	Solarbio	R1010	Lisi dei globuli rossi
1% Triton X-100	Thermo Scientific	HFH10	Permeabilizzazione a membrana
Asino anti-Coniglio IgG	Thermo Scientific	A32790TR	Anticorpo secondario
DAPI	Thermo Scientific	62248	Colorazione del DNA
1 x PBST	Solarbio	P1031	Tampone di lavaggio
Medium dedicato per HEEC primari	iCell	iCell-f004-002h	Per la cultura HEEC
Microscopio Confocale Rovesciato	Zeiss	LSM880	Utilizzato per l'acquisizione di immagini di immunofluorescenza; equipaggiato con 40x
Linea cellulare MRC-5	iCell	iCell-h146	linea cellulare di adenocarcinoma endometriale umano; Profilo STR.
Linea cellulare di Ishikawa	iCell	iCell-h113	linea cellulare di adenocarcinoma endometriale umano; Profilo STR.