Articolo metodologico

Valutazione dell'attività metabolica dei ventricoli interi rigeneranti del pesce zebra ex vivo utilizzando un saggio extracellulare di flusso

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DOI:

10.3791/70459

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17 aprile 2026

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1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

In questo articolo

Sommario

In questo articolo descriviamo un protocollo dettagliato per quantificare il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare dei ventricoli adulti ex vivo per caratterizzare la loro capacità metabolica ossidativa e glicolitica.

Abstract

La capacità dei pesci zebra di rigenerare il cuore durante l'età adulta è in parte attribuita ad adattamenti metabolici. Sebbene sia stato ipotizzato che il cuore di pesce dipenda in modo significativo dalla glicolisi, studi recenti hanno scoperto un profilo metabolico più complesso in cui il metabolismo ossidativo emerge come componente essenziale della ridifferenziazione cardiomiocitaria e della rigenerazione cardiaca avanzata di successo. Nel 2025, abbiamo adottato un metodo ad alto rendimento per valutare il profilo metabolico dei ventricoli interi del pesce zebra ex vivo, utilizzando il saggio Seahorse (saggio di flusso extracellulare). Questo metodo consente una valutazione rapida e in tempo reale del tasso di consumo basale e massimo di ossigeno (OCR) e del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) utilizzando il test di stress MITO XF sull'analizzatore Seahorse XFe24. In questo articolo descriviamo un protocollo dettagliato per eseguire l'analisi del flusso extracellulare su ventricoli interi del pesce zebra. La capacità di quantificare l'OCR e l'ECAR in cuori interi vivi ex vivo offrirà l'opportunità di chiarire il metabolismo cardiaco in momenti critici dello sviluppo, della progressione della malattia e della rigenerazione.

Introduzione

A differenza degli esseri umani, i pesci zebra (Danio rerio) mantengono la capacità di rigenerare il tessuto cardiaco perso durante tutta la loro vitaadulta 1. In caso di lesione cardiaca, i cardiomiociti nella zona di confine della ferita si dedifferenziano e rientrano nel ciclo cellulare 2,3 per ripristinareil numero 4 dei cardiomiociti e ripopolare la ferita. Recentemente, è stata riconosciuta l'importanza della ridifferenziazione cardiomiocitaria nel processorigenerativo 5. Entrambi questi processi sono strettamente regolati dai cambiamenti metabolici nel cuore del pesce zebra, con la glicolisi che favorisce laproliferazione 6,7 e la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) che promuovela differenziazione 8. Sebbene i metodi farmacologici e genetici per manipolare il metabolismo siano diffusi nel campo dellarigenerazione 6,7, la validazione degli effetti metabolici di tali perturbazioni rimane difficile a causa delle dimensioni ridotte del cuore del pesce zebra, che richiede una configurazione complessa e personalizzata per la canulazione 9,10,11 o l'aggregazione di più cuori per la spettrometriadi massa 12 o la spettroscopia NMR 8, 13.

Per aggirare queste limitazioni, abbiamo recentemente descritto l'uso dell'analizzatore Seahorse XFe24 per la profilazione metabolica ad alta produttività dei ventricoli interi del pesce zebra exvivo 8. Il saggio extracellulare a flusso è progettato per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) di cellule, isolotti pancreatici e sferoidi. Questo avviene tramite sensori a stato solido che rilevano le variazioni nella concentrazione di ossigeno e protoni (pH) nei mezzi che risultano rispettivamente dall'utilizzo della catena respiratoria di trasporto elettronico della produzione di ossigeno e lattato dipendente dalla glicolisi (Figura 1A)14.

L'analisi extracellulare del flusso può essere eseguita su una configurazione a 96 pozzi (XFe96 e XF Pro), minipiastre a 8 pozzi o varie iterazioni di piastre a 24 pozzi (XFe24). Sebbene le piastre a 96 pozzi offrano una maggiore produttività, la distanza di lavoro tra il sensore e il fondo del pozzo non è adatta ad ospitare un intero ventricolo di pesce zebra. Inoltre, nel formato a piastre a 96 pozzi, non è prevista la possibilità di fissare il ventricolo sul fondo del pozzo per impedirne di galleggiare nel mezzo e interferire con i sensori. D'altra parte, la micropiastra di cattura dell'isolotta XFe24 è stata originariamente progettata per la caratterizzazione metabolica degli isolotti pancreatici primari e, di conseguenza, consente il deposito del tessuto sul fondo del pozzo, che viene poi fissato da uno schermo (griglia). A causa della piccola dimensione del cuore del pesce zebra, siamo riusciti ad adattare la micropiastra di cattura degli isolotti per essere utilizzata sui ventricoli dei pesci zebra, che rimangono fissati sotto la griglia per tutta la durata del saggio.

Per valutare la capacità respiratoria mitocondriale, abbiamo utilizzato il test di Mito Stress, in cui sono stati utilizzati quattro inibitori della catena di trasporto elettronico e della sintasi di adenosina trifosfato (ATP) (Figura 1A). Innanzitutto, si ottengono misurazioni di base dell'OCR (Figura 1B, magenta). Successivamente viene iniettata oligomicina, un complesso inibitore del V. L'oligomicina inibisce l'attività dell'ATP sintasi e quindi porta a una riduzione dell'OCR, attribuibile alla produzione di ATP (Figura 1B, verde). Il consumo residuo di ossigeno è il risultato di una respirazione non accoppiata e di un consumo di ossigeno non mitocondriale (Figura 1B, rispettivamente arancione e grigio)15. Dopo l'oligomicina, viene iniettato FCCP, che dissipa il gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale (Figura 1A). Nel tentativo di ripristinare il gradiente protonico, i mitocondri aumentano il consumo di ossigeno fino alla loro massima capacità (Figura 1B, blu). Infine, viene utilizzata una miscela di rotenone e antimicina A che inibisce rispettivamente i complessi I e III (Figura 1A). Questa combinazione di farmaci porta allo spegnimento completo dell'attività della catena di trasporto degli elettroni respiratori mitocondriali a causa della mancanza di flusso elettronico dai complessi I e III al complesso IV15. Questo permette di misurare il consumo di ossigeno non mitocondriale (Figura 1B, grigio).

Nel complesso, utilizzando la micropiastra di cattura degli isoli con il test di Mito Stress, siamo stati in grado di valutare rapidamente e riproducibilmente la capacità metabolica ossidativa e glicolitica dei ventricoli interi del pesce zebra ex vivo. Descriviamo di seguito il protocollo dettagliato di questa procedura. Infine, mostriamo la sopravvivenza di ventricoli isolati di tipo selvatico e non lesionati ex vivo nell'analizzatore di flusso extracellulare, e convalidiamo il test di stress Mito a 14 giorni dopo la criolesione (DPCI) ventricolitransgenici 8.

Protocollo

Tutte le procedure descritte di seguito che coinvolgono gli animali sono state eseguite in conformità con l'Animals (Scientific Procedures) Act 1986 nel Regno Unito e la Direttiva 2010/63/UE in Europa e sono state approvate dal Comitato Centrale per la Cura degli Animali e la Revisione Etica dell'Università di Oxford.

NOTA: Questo protocollo è stato eseguito utilizzando un analizzatore Seahorse XFe24 e il mezzo DMEM Seahorse senza fenolo rosso né bicarbonato.

1. Criolesione cardiaca dei pesci zebra (opzionale)

  1. Ottieni l'approvazione etica appropriata dall'istituzione locale e dalle autorità nazionali prima di iniziare l'esperimento.
  2. Eseguire una criolesione sui cuori dei pesci zebra come descrittoin precedenza 16,17,18.

2. Idratazione della cartuccia sensore

  1. Apri il kit di analisi extracellulare per flusso e carica la piastra utilitaria a 24 pozzi (Figura 2A) pipettando 500 μL della soluzione calibrante per pozzo.
  2. Chiudi la piastra di utilità usando la cartuccia sensore e il servo idroalimentatore (Figura 2A).
  3. Incubare la cartuccia e la piastra di utilità in un incubatore umidificato a 37 °C durante la notte (18–72 ore). Tieni il coperchio sulla cartuccia sensore durante l'incubazione.

3. Preparare le soluzioni farmacologiche e i media

  1. Preparare soluzioni standard dei farmaci: sciogliere l'oligomicina nel dimetilsolfosido (DMSO) a una concentrazione di 10 mM, il cianuro carbonilico 4-(trifluorometossi)fenilidrazono (FCCP) in DMSO a una concentrazione di 5 mM, il rotenone in DMSO a una concentrazione di 10 mM e l'antimicina A nell'etanolo a una concentrazione di 10 mM e conservare a -20 °C se non usato immediatamente.
    NOTA: Si consiglia di preparare soluzioni fresche di oligomicina, rotenone e antimicina ogni 2–3 mesi, e una soluzione FCCP ogni volta prima dell'esecuzione del test.
  2. Preparare la concentrazione operativa dei farmaci (500 μM oligomicina, 300 μM FCCP, 450 μM ciascuna miscela rotenone/antimicina A) diluendo la soluzione standard in mezzo DMEM. Assicurarsi che il volume finale per le concentrazioni operative sia di 1,5 mL per oligomicina, 1,65 mL per FCCP e 1,8 mL per rotenone/antimicina A, consentendo il caricamento di 30 porte (24 porte per inibitore sulla cartuccia più 6 porte extra per farmaco per correggere errori di pipettatura).
    NOTA: Alcune precipitazioni si manifesteranno nella rotenone/antimicina A, ma dopo aver miscelato bene, queste saranno ridotte al minimo. Si noti che le concentrazioni indicate in 3.2 sono 10 volte la concentrazione finale dei farmaci quando verranno iniettati nei pozzi.
  3. Prepara il mezzo DMEM (pH 7,4) per contenere 10 mM di glucosio, 1 mM di piruvato e 2 mM di glutammina, e conservarlo a -20 °C fino all'uso.

4. Attivazione dell'analizzatore di flusso extracellulare

  1. Accendi l'analizzatore dal pulsante laterale durante la notte prima del test per permettere l'equilibrio della temperatura con l'ambiente.
  2. Accendi il computer e apri il software Wave.
  3. Seleziona il test di stress Mito sul software.
  4. Spegni il riscaldatore nell'angolo in basso a sinistra del software in modo che la temperatura nell'analizzatore scenda sotto i 37 °C e raggiunga i 28–29 °C per avvicinarsi alla temperatura standard dell'allevamento dei pescizebra 19.
  5. Imposta la strategia di iniezione nella pagina delle definizioni del gruppo (nella scheda delle strategie di iniezione ) aggiungendo i composti che verranno depositati in ciascuna porta dal catalogo dei composti. Per il test di stress Mito, aggiungere oligomicina nella porta A, FCCP nella porta B e rotenone/antimicina nella porta C. C'è la possibilità di aggiungere un altro farmaco nel porto D, che non viene utilizzato in questo protocollo.
  6. Elimina tutte le altre strategie predefinite presenti nella scheda strategie di iniezione una volta definita la strategia sperimentale. Specificare i gruppi sperimentali (ad esempio, wild-type e mutante) sul lato Gruppi della pagina e specificare la strategia di iniezione che riceveranno (quella definita nel passo 4.5). Assicurati che le strategie di iniezione corrispondano tra i gruppi e corrispondano anche a quella progettata.
  7. Nella pagina della mappa delle placche , specifica la posizione di ogni campione sulla piastra a 24 pozzi cliccando su ogni gruppo e poi sui pozzi che conterranno i campioni.
    1. Si noti che quattro dei pozzi non sono adatti alla deposizione del campione (Figura 2B) e servono come spazi vuoti che verranno utilizzati per la correzione di background. Assicurati che i campioni in ciascun gruppo siano distribuiti uniformemente sulla piastra per uniformare il potenziale bias posizionale nelle misurazioni o nelle condizioni ambientali.
  8. Nella pagina del protocollo , rimuovere la scheda Control o Experimental se non viene utilizzato alcun inibitore aggiuntivo diverso da quelli sopra indicati e assicurarsi che le porte software corrispondano alle posizioni dei farmaci sulla cartuccia.
  9. Il software imposta automaticamente 3 cicli di miscelazione, attesa e misurazione per ogni condizione. Modificare il numero di cicli a 10 misurazioni basali (non trattate), 3 di oligomicina, 7 di FCCP e 9 di rotenone/antimicina A per consentire tracce stabili e per permettere agli inibitori di agire sul tessuto 3D. Assicurati che ogni ciclo consista in 3 minuti di miscelazione, 2 minuti di attesa e 3 minuti di misurazione.

5. Calibrazione dell'analizzatore

  1. Rimuovi la cartuccia e la piastra di utilità dall'incubatore umidificato (vedi passaggi 2.1–2.3).
  2. Rimuovere l'idroamplificatore e il coperchio (Figura 2A) dalla cartuccia e posizionare la cartuccia sensore sulla piastra di supporto contenente il calibrante.
  3. Pipetta delicatamente gli inibitori nelle rispettive porte toccando la parete laterale della porta con la punta della pipetta, garantendo un flusso regolare del liquido: 50 μL di oligomicina nella porta A, 55 μL di FCCP nella porta B e 60 μL di rotenone/antimicina A nella porta C (Figura 2C).
    1. Si noti che il liquido è tenuto in posizione solo dalla tensione superficiale al foro della porta, quindi evita di pipettare o attaccare bruscamente la cartuccia da questo passaggio in poi. Assicurati che nessun liquido entri nella porta del sensore (Figura 2C) perché questo danneggerebbe l'analizzatore.
  4. Clicca su start run sul software, dai un nome all'esecuzione e salvala sul computer. A questo punto, la vassoia dell'analizzatore si apre per posizionare la cartuccia e la piastra di servizio.
  5. Posizionare la cartuccia caricata con i farmaci e la piastra di distribuzione contenente il calibrante sul vassoio dell'analizzatore secondo la mappa della lastra sul vassoio (A1 well in alto a sinistra) e assicurarsi che si adatti correttamente. Rimuovi il booster dell'idrante e il coperchio (Figura 2A) dalla piastra prima di caricarlo sul vassoio. Il mancato rispetto danneggerà l'analizzatore.
  6. Una volta pronto, istrui il software a iniziare il test premendo run assay. A questo punto, l'analizzatore prenderà la vassoia carica e avvierà la calibrazione.
  7. Inizia l'isolamento cardiaco (vedi passaggi 6.1–6.12). La calibrazione durerà circa 40 minuti, ma la piastra può rimanere nell'analizzatore per tutto il tempo necessario per isolare i cuori e posizionarli nella micropiastra di cattura dell'isolotta (Figura 2B,D).

6. Isolare i cuori di pesce e caricarli sulla piastra dell'isolotto a 24 pozzi

  1. Apri la micropiastra di cattura dell'isolotta e carica la piastra a 24 pozzi con 500 μL di DMEM (10 mM di glucosio, 1 mM di piruvato, 2 mM di glutamina) a temperatura ambiente.
  2. Posizionate tutte le griglie in una piastra di Petri da 35 mm contenente materiale DMEM a temperatura ambiente, assicurandosi che siano completamente immerse e prive di grandi bolle.
  3. Prepara una piastra di Petri aggiuntiva da 35 mm contenente DMEM (10 mM di glucosio, 1 mM di piruvato, 2 mM di glutammina) a temperatura ambiente. Questo servirà a risciacquare i cuori al momento della raccolta e a dissezionare il ventricolo dagli atri e dal bulbo arterioso.
  4. Eliminare un pesce in MS-222 da 5 g/L e controllare l'assenza di riflessi.
  5. Posiziona il pesce su una spugna fissata su una piastra di Petri da 92 mm, apri la cavità cardiaca e disseziona il cuore come descrittoin precedenza 16,20.
  6. Risciacquare i cuori nella piastra di Petri da 35 mm contenente DMEM (10 mM di glucosio, 1 mM di piruvato, 2 mM di glutamina) a temperatura ambiente.
  7. Rimuovere l'atrio e il bulbo arterioso usando le pinze nella piastra di Petri da 35 mm.
  8. Scuoti e stringi delicatamente il ventricolo affinché il sangue si esci dal suo lume. Non danneggiare la parete ventricolare quando si lava il cuore.
  9. Trasferire il cuore al suo pozzo designato sulla micropiastra di cattura dell'isolotta e lasciarlo sprofondare al centro del pozzo appropriato secondo la mappa della placca. Mantieni la piastra a temperatura ambiente. Includere tutti i ventricoli nell'analisi, anche se smettono di battere visibilmente.
  10. Ripeti il processo per tutti i pesci disponibili. Se confronti l'attività metabolica dei diversi gruppi sperimentali, suggeriamo di isolare un cuore per gruppo invece di tutti i cuori di un gruppo prima di passare al successivo. Sebbene i cuori possano sopravvivere almeno 180 minuti nell'analizzatore (Figura 3A), proponiamo che l'isolamento avvenga un cuore per gruppo alla volta come buona pratica per garantire la distribuzione equa del tempo nel mezzo tra i gruppi.
  11. Una volta che tutti i cuori sono stati isolati (circa 60 minuti per una piastra da 20 cuori), posizionarli sul fondo dei pozzi delle micropiastre di cattura degli isolotti (Figura 2B) e posizionarli al centro del pozzo usando pinze sottili (Figura 2D,E).
  12. Usa una pinza per coprirli con la griglia (circa 20 minuti) (Figura 2D). Assicurati che la griglia sia nell'orientamento corretto (la rete rivolta verso il cuore verso il basso) e non contenga bolle grandi, poiché ciò potrebbe interferire con le misurazioni (Figura 2E).
    1. Una volta che la griglia è in posizione, usa la pinza per spingerla in posizione dai bordi finché non si sente un leggero clic. Assicurati di non far sbattere il cuore con la pinza attraverso la griglia.

7. Caricamento dei campioni sull'analizzatore e acquisizione delle misurazioni

  1. Una volta che i cuori sono racchiusi nella micropiastra di cattura dell'isolotto, controlla sul software che tutti i pozzi siano stati calibrati con successo, come indicato dai segni verdi sullo schermo del computer. Ora espelle la piastra di utilità premendo la vassoia aperta.
    NOTA: La cartuccia non verrà espulsa a questo punto, e apparirà solo la piastra di utilità contenente il calibrante.
  2. Sostituire la piastra di utilità con la micropiastra dell'isolotta contenente i campioni sul vassoio dell'analizzatrice. Assicurati che la micropiastra dell'isolotta sia posizionata correttamente (A1 nell'angolo in alto a sinistra) e che il coperchio sia stato rimosso. Il mancato rimozione del coperchio danneggia l'analizzatore.
  3. Una volta posizionata la piastra dell'isolo, istruisci il software a avviare l'esperimento premendo la piastra a cella di carico. Durante circa i primi 10 minuti, i sensori eseguiranno un passaggio di equilibrio, e poi inizieranno le misurazioni.
  4. Una volta completato l'esperimento (circa 4 ore), si preme la cartuccia di espulsione per aprire la vassoia e per espellere la micropiastra e la cartuccia dell'isolot.
  5. Rimuovi la micropiastra e la cartuccia dell'isolotto e premi il punto per far chiudere il vassoio. A questo punto, premi visualizza i risultati per vedere i dati raccolti.
  6. Salva le misurazioni, esportale dal computer analizzatore e caricale sull'interfaccia di analisi per ulteriori analisi e elaborazioni. Questo attiverà l'escissione della piastra e della cartuccia dell'isolotto dall'analizzatore.
  7. Rimuovi la piastra e la cartuccia dall'analizzatore e chiudi la cartuccia usando il coperchio.
  8. Congelare la piastra dell'isolotto su ghiaccio secco o rimuovere i cuori dai pozzi (vedi passo 8.2) e conservare a -20 °C se l'isolamento proteico per la normalizzazione (passo 8) non viene eseguito immediatamente.
  9. Una volta salvati i dati, spegni il software, l'analizzatore e il computer.
  10. Carica i dati sull'interfaccia di analisi e visualizzali selezionando il grafo OCR dall'opzione delle viste standard . Sull'interfaccia, visualizza i dati come livello o tasso OCR ed ECAR, correggi per lo sfondo in base ai pozzi vuoti e seleziona i pozzi da visualizzare cliccando sulla mappa delle lastre per farli apparire o sparire.

8. Isolamento e quantificazione delle proteine per la normalizzazione

  1. Preparare un tampone di radioimmunoprecipitazione contenente inibitore di proteasi (RIPA) dissolvendo una compressa inibitrice della proteasi in 10 mL di tampone RIPA e miscelando bene.
  2. Se non è già stato fatto (passo 7.8), usando lo strumento di inserimento schermo di cattura isole (Figura 2F), rimuovi le griglie dalla piastra dell'isolotto per rilasciare i cuori. Rimuovi i cuori con attenzione, perché potrebbero rimanere bloccati sulla griglia. Se è così, usa le pinze per liberarle. Se la griglia non può essere rimossa usando lo strumento di inserimento schermo, spostare la piastra sotto lo stereoscopio e, usando forbici a microdisezione, tagliare con cura la griglia per liberare il cuore.
  3. Inserire ogni ventricolo in un tubo da 1,5 mL contenente 200 μL di tampone RIPA arricchito con inibitore della proteasi su ghiaccio.
  4. Omogeneizza il cuore usando un omogeneizzatore con penetti usa e getta su ghiaccio.
  5. Preparare gli standard diluendo l'albumina sierica bovina (BSA) fornita nel tampone RIPA nelle seguenti concentrazioni: 2000 μg/mL, 1500 μg/mL, 1000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 25 μg/mL, 0 μg/mL.
  6. Prepara la soluzione operativa Pierce BCA (50:1, reagente A: reagente B, secondo le istruzioni del produttore). Calcola il volume di reagente funzionante necessario usando la seguente formula:
    (numero di standard + numero di campioni) × 2 × 200 μL
    NOTA: Questo volume consente l'uso di 200 μL di soluzione di lavoro per campione e standard, e consente l'acquisizione di misurazioni duplicate per campione e standard.
  7. In una piastra da 96 pozzi, si aggiungono 25 μL di ogni standard e ogni campione per pozzo in duplicati.
  8. Aggiungi 200 μL di soluzione di lavoro per pozzo.
  9. Incubare il piatto a 37 °C per 30 minuti.
  10. Lascia raffreddare il piatto a temperatura ambiente per 10 minuti e sigillalo usando un sigillante per piatti. Assicurati che non ci siano bolle nei pozzi, perché potrebbero ostruire il lettore di placche. Se si formano un numero limitato di bolle, usa una punta o una pinza sottile per farle scoppiare.
  11. Misura l'assorbanza a 562 nm usando un lettore di piastre.
  12. Genera una curva standard basata sull'assorbanza degli standard e calcola la concentrazione proteica dei campioni.
  13. Registra la concentrazione proteica nella scheda di normalizzazione (Figura 2G) dell'interfaccia di analisi per ogni pozzo.

9. Analisi dei dati

  1. Dopo aver normalizzato rispetto al contenuto proteico, esporta i dati dall'interfaccia di analisi come file Excel o Prism per ulteriori analisi utilizzando il pulsante cloud nell'angolo in alto a destra del grafico.
  2. Utilizzando i dati normalizzati, calcola l'OCR e l'ECAR di base come media delle misurazioni di base, escludendo le prime tre acquisizioni, poiché il segnale potrebbe essere instabile alle prime misurazioni.
  3. Utilizzando i dati normalizzati, per specificare il massimo OCR ed ECAR, calcola le medie delle prime tre acquisizioni del trattamento FCCP.

Risultati

Questo protocollo consente la quantificazione dell'OCR e dell'ECAR dei ventricoli interi del pesce zebra. Abbiamo validato la sopravvivenza dei ventricoli in contesto ex vivo incubando ventricoli di tipo selvatico KCL non lesionati nell'analizzatore in assenza di qualsiasi trattamento farmacologico (Figura 3A). I dati indicano che i ventricoli hanno un OCR e un ECAR stabili, che sono significativamente elevati rispetto alle misurazioni di base dei pozzi vuoti per almeno 180 minuti (Figura 3A). Questi dati suggeriscono che i ventricoli mostrano una normale funzione respiratoria e sopravvivenza in questo contesto ex vivo .

Abbiamo effettuato diverse misurazioni OCR utilizzando diverse concentrazioni di farmaci e formulazioni di mezzi per identificare il dosaggio ottimale per i ventricoli (Figura 3B). Abbiamo osservato un lieve aumento della variazione della piega OCR (FCCP/basale) utilizzando le combinazioni [oligomicina] 10 μM, [FCCP] 8 μM e [rotenone/antimicina] 25 μM, e un aumento leggermente maggiore di [oligomicina] 50 μM, [FCCP] 30 μM e [rotenone/antimicina] 45 μM (Figura 3B). Di conseguenza, abbiamo proceduto con queste ultime concentrazioni per i nostri esperimenti. Poiché il ventricolo è una struttura 3D, è possibile che i farmaci agiscano fortemente sulle cellule esterne del tessuto senza raggiungere quelle sul lato luminale del ventricolo. Per affrontare questo problema, abbiamo eseguito una fase di permeabilizzazione in cui abbiamo trattato i cuori con saponina allo 0,5% per 30 minuti prima dell'incubazione in DMEM (10 mM di galattosio, 1 mM di piruvato, 4 mM di glutammina). Ciò ha portato a una riduzione sostenuta della OCR e all'assenza dell'aumento previsto dell'OCR dopo l'iniezione FCCP (Figura 3C), suggerendo che i cuori fossero metabolicamente insufficienti. Di conseguenza, non abbiamo permeato i ventricoli per i nostri esperimenti.

Inoltre, presentiamo qui le tracce normalizzate del nostro esperimentooriginale 8. Sfruttando la variazione naturale del potenziale rigenerativo di sette ceppi di pesci zebra selvatici, abbiamo identificato l'mdh1ab, la deidrogenasi malato citosolica 1Ab, come beneficiosa sulla rigenerazione tramite la ridifferenziazione cardiomiocitaria. Per convalidare questo risultato, abbiamo prodotto pesci zebra transgenici che sovraespressono mdh1ab in modo specifico per cardiomiociti (mdh1ab cOE) e pesci di controllo che sovraesprimono proteine fluorescenti verdi (GFP c OE). Abbiamo criolesionato i loro ventricoli, raccolto a 14 dpci e indagato il loro metabolismo usando il test di sforzo Mito (Figura 3D). Il trattamento con oligomicina non ha alterato significativamente la OCR, anche se è stato osservato un lieve aumento della CIR. L'iniezione di FCCP nel mezzo ha portato all'aumento previsto di OCR ed ECAR, con i campioni di mdh1ab c OE che hanno mantenuto la massima capacità respiratoria massima (Figura 3D). Infine, rotenone/antimicina ha portato al completo arresto del metabolismo in entrambi i gruppi. Nel complesso, questo metodo ci ha permesso di identificare differenze significative nella capacità metabolica dei ventricoli sovraespressori di mdh1ab e tra sette diversi ceppi di pesci zebraselvatici 8.

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Figura 1: Metabolismo del glucosio durante un test di stress di Mito. (A) Rappresentazione schematica del metabolismo del glucosio. Il glucosio entra nella cellula attraverso i trasportatori GLUT e viene convertito in piruvato tramite glicolisi. Il lattato deidrogenasi (LDH) converte il piruvato in lattato e i protoni risultanti vengono secreti dalla cellula. Il piruvato viene convertito in acetil-CoA ed entra nel ciclo mitocondriano e TCA per alimentare la catena respiratoria di trasporto elettronico nella membrana mitocondriale interna. Gli inibitori dei complessi I, III e V, così come il disaccoppiatore FCCP, sono indicati in rosso. Gli elettroni trasferiti attraverso la catena respiratoria di trasporto elettronico sono indicati da frecce blu, che alla fine portano alla conversione di ossigeno e protoni in acqua. (B) Schema dei risultati del test di stress Mito. La respirazione basale è nota nel magenta. All'iniezione di oligomicina, l'OCR diminuisce, permettendo di calcolare la respirazione legata all'ATP (verde) così come la perdita di protoni (arancione). FCCP aumenta l'OCR fino alla massima capacità respiratoria delle cellule (blu). L'iniezione di rotenone e antimicina A provoca l'arresto della respirazione mitocondriale e permette solo la respirazione non mitocondriale (grigia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Disposizione delle micropiastre di cattura dei sensori e isolotti. (A) Immagine del complesso cartuccia-sensore coperchio-idrobooster-piastra di utilità (in alto) e della cartuccia sensore invertita (in basso). Barra di scala: 1 cm. (B) Immagine di una micropiastra di cattura di isolotti carica di ventricoli di pesce zebra. I cerchi rossi indicano i pozzi vuoti che non contengono ventricoli e fungono da correzione di fondo durante l'analisi. Barra di scala: 1cm. (C) Rappresentazione schematica della disposizione delle porte nella cartuccia sensore XFe24. Il porto A contiene oligomicina, B contiene FCCP e C contiene la miscela rotenone/antimicina. Il porto D può essere lasciato vuoto, oppure aggiungere un farmaco extra. S indica la porta del sensore, che non dovrebbe contenere liquidi per non danneggiare l'analizzatore. (D) Immagine rappresentativa di un ventricolo zebra al fondo del pozzo, racchiuso dalla griglia (a sinistra) e senza griglia (a destra). Barra di scala: 5mm. (E) Sezione trasversale schematica della micropiastra di cattura dell'isolotto contenente un ventricolo, la griglia (gialla) e la cartuccia sensore (verde). P indica le porte e S il sensore. La linea ondulata rappresenta il medium. (F) Lo strumento di inserimento schermo di cattura isolotta. Barra di scala: 1 cm. (G) Icona della scheda di normalizzazione sull'interfaccia di analisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Misurazioni rappresentative di OCR ed ECAR dei ventricoli del pesce zebra. (A) Tracce rappresentative di OCR ed ECAR di ventricoli selvatici di pesci zebra non lesionati (ceppo KCL) che non sono stati trattati con gli inibitori utilizzati nel test (n = 2, linea rossa). Le tracce risultanti da pozzi vuoti che non contengono alcun materiale biologico sono presentate in grigio (n = 4); OCR, misure ripetute a doppio senso ANOVA, fattore di tempo P = 0,0200, interazione tempo × pozzo P = 0,0196, fattore di pozzo P < 0,0001, fattore di gruppo P < 0,0001; ECAR misure ripetute bidirezionali ANOVA, fattore di tempo P = 0,1323, tempo × interazione del pozzo P = 0,0216, fattore del pozzo P = 0,0009, fattore di gruppo P<0,0001; dati presentati come media ± SEM. (B) variazione del pieghe OCR in base a varie concentrazioni di farmaci e mezzi utilizzati. ANOVA unidirezionale (P = 0,0032) con il test di confronti multipli di Tukey. [O] 5 μM, [F] 4 μM, [RA] 2 μM, n = 6; [O] 10 μM, [F] 8 μM, [RA] 25 μM, n = 8; [O] 25 μM, [F] 16 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 50 μM, [F] 30 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 100 μM, [F] 60 μM, [RA] 90 μM, n = 8. O, oligomicina; F, FCCP; RA, rotenone/antimicina. (C) Tracce di ventricoli permeabilizzati dalla saponina (rossi, n = 4) rispetto a ventricoli non trattati (grigi, n = 4); misure ripetute bidirezionali ANOVA, fattore temporale P < 0,0001, interazione temporale × campione P < 0,0001, fattore di trattamento P < 0,0001, fattore campione P = 0,824; dati presentati come media ± SEM.OCR massimo dei ventricoli trattati con saponina rispetto a quelli non trattati; test t dello studente non accoppiato (P = 0,0850). (D) Tracce rappresentative di OCR ed ECAR da ventricoli mdh1ab cOE (rosso, n = 8) e GFP cOE (grigio, n = 8) 14dpci. OCR, misure ripetute bidirezionali ANOVA, fattore temporale P < 0,0001, tempo × interazione campionaria P < 0,0001, fattore genotipo P < 0,0001, fattore campione P = 0,1098; ECAR, misura ripetute a doppio rapporto ANOVA fattore temporale P < 0,0001, tempo × interazione campionaria P = 0,7507, fattore campione P = 0,2154, fattore genotipo P < 0,0001. Dati adattati da Lekkos et al., 20258 e presentati come media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui descriviamo in dettaglio il protocollo per l'analisi dell'OCR e dell'ECAR dei ventricoli ex vivo dei pesci zebra utilizzando l'analizzatore Seahorse XFe24 e il test di stress Mito. Il metabolismo dei cardiomiociti svolge un ruolo essenziale nella rigenerazionecardiaca 21,22,23,24. Tuttavia, la validazione del fenotipo metabolico del cuore rigenerante del pesce zebra è stata difficile e spesso manca nellepubblicazioni 6,7. A causa delle dimensioni ridotte del cuore del pesce zebra, tecniche come la spettroscopia NMR o la spettrometria di massa richiedono l'aggregazione di più ventricoli per acquisire un segnaleadeguato 8,12,13. Al contrario, il metodo che descriviamo qui consente l'acquisizione di misurazioni OCR ed ECAR da più ventricoli individuali, aumentando così la potenza statistica.

I metodi classici di profilazione metabolica, come la metabolomica, forniscono un'istantanea del profilo metabolico del tessuto al momento della raccolta. Attraverso il test di Mito Stress siamo riusciti a raccogliere dati in tempo reale e in tempo reale su come i ventricoli si stanno adattando a varie sfide metaboliche, inclusa la loro massima capacità respiratoria, cosa che non è evidente con altre metodologie. Per ottenere la fenotipizzazione viva dei ventricoli del pesce zebra, è stata tentata la perfusione del cuore del pescezebra 9,10,11. Ciò richiede attrezzature complesse e personalizzate e tecnici altamente qualificati per ottenere la canulazione pur rimanendo un metodo a bassa produttività. L'analizzatore offre un'alternativa più semplice utilizzando un apparecchiature commercialmente disponibile per la fenotipizzazione ad alta produttività (20 ventricoli alla volta). Per quanto ne sappiamo, non è stato fatto alcun confronto diretto tra il metodo descritto in questo articolo e altre tecniche di ossimetria viva, come un elettrodo di tipo Clark.

È importante sottolineare che il metodo che descriviamo è adattabile a seconda della domanda di ricerca. Il saggio è stato utilizzato in precedenza per caratterizzare embrioni interi di pescezebra 25,26. Oltre al test di Mito Stress descritto qui, il test Mito Fuel Flex è stato ottimizzato per valutare l'utilizzo metabolico del carburante nelle fette cardiacheumane 27. Inoltre, il test del fenotipo di energia cellulare è stato adattato per caratterizzare la capacità glicolitica dei cuori rigeneranti di Astyanax mexicanus 28. Prevediamo che questo protocollo sarà utilizzato per altre strutture 3D come gli organoidi cardiaci, ed è utile per convalidare la perturbazione genetica delle vie metaboliche nei cuori di pesci zebra non danneggiati.

Riconosciamo che questa tecnica presenta alcune limitazioni. Per quanto riguarda le sfide tecniche, dopo l'isolamento, i cuori sono stati maneggiati in un mezzo DMEM a temperatura ambiente e non mantenuto a 28 °C, che è la temperatura ottimale per il pescezebra 19. Abbassare la temperatura dell'acqua a 18 °C può avere effetti significativi sulla funzione del cuore in situ del pesce zebra 29,30. Tuttavia, non ci aspettiamo che un'esposizione a breve termine a temperatura ambiente abbia un effetto significativo sulla fisiologia dei ventricoli isolati, poiché i ventricoli tornano rapidamente all'analizzatore a 28 °C. Nelle nostre mani, la maggior parte dei ventricoli ha smesso di battere visibilmente dopo la dissezione dell'atrio, indicando la mancanza di stimoli del pacemaker come un'eziologia della non contrazione. Inoltre, durante il periodo di isolamento, il mezzo non è stato ossigenato, il che può portare a lieve ipossia, che torna a livelli normali di ossigeno dopo aver miscelato l'analizzatore prima della prima misurazione.

Un'ulteriore considerazione pratica riguardo alla temperatura dei cuori riguarda anche lo spegnito del riscaldatore nell'analizzatore, portando così a una riduzione della temperatura da 37 °C a 28–29 °C. L'analizzatore non consente la riduzione della potenza del riscaldatore alla temperatura desiderata. Tuttavia, quando l'analizzatore è in funzione, la temperatura all'interno del vassoio è 6–7 °C superiore a quella della stanza. Questo intervallo di temperatura coincide con la temperatura ottimale per l'allevamento dei pescizebra, 19.

Questo saggio viene eseguito su ventricoli di pesci zebra in massa. Di conseguenza, è impossibile distinguere i contributi dei singoli tipi cellulari ai cambiamenti osservati nell'OCR e nell'ECAR. Questo potrebbe rivelarsi di grande importanza nell'indagine dei tassi metabolici dei primi momenti di rigenerazione, quando l'elevato afflusso di celluleimmunitarie 31 potrebbe mascherare i cambiamenti OCR dei cardiomiociti. Inoltre, il sangue residuo rimasto nel lumen ventricolare potrebbe influenzare le letture metaboliche. Permettere al cuore di sanguinare in presenza dieparina 7 potrebbe ridurre ulteriormente l'influenza della coagulazione delle cellule sanguine nel cuore. Inoltre, per aumentare la diffusione degli inibitori usati verso le cellule interne del ventricolo, abbiamo tentato una fase di permeabilizzazione usando la saponina. La permeabilizzazione della saponine ha portato a un calo sostenuto della OCR durante tutto il saggio, portando i ventricoli a insufficienza respiratoria. Queste limitazioni potrebbero essere evitate con l'isolamento, la coltura e l'analisi di cardiomiociti isolati, anche se questo approccio richiede una coltura prolungata dellecellule 32 , che potrebbe non essere ottimale per un contesto rigenerativo.

Il tessuto lesionato potrebbe influenzare il metodo di normalizzazione utilizzato. In questo studio, normalizziamo l'OCR tramite μg proteina/mL utilizzando il saggio BCA. Sebbene il saggio BCA non reagisca fortemente con le proteine del collagene a causa della loro composizione ricca di idrossiprolina e prolina, che sono poco rilevate tramite il coper, la presenza di altri componenti della ferita privi di cellule potrebbe influenzare la normalizzazione. Studi futuri potrebbero considerare l'uso del DNA33 totale come riflesso accurato delle cellule vive nel ventricolo.

Inoltre, non siamo riusciti a riprodurre la prevista riduzione della OCR causata dall'inibizione dipendente dall'oligomicina del complesso V15. Sebbene alcuni studi mostrino una riduzione della OCR tramite trattamento con oligomicina di cardiomiocitiisolati 32,34,35, i dati qui somigliano alla mancanza di risposta riportata in uno studio recente su cardiomiociti adulti di topo isolati 36. Poiché la concentrazione di oligomicina che utilizziamo è significativamente più alta di quella riportata negli studi sopra menzionati, non è chiaro se aumentare la concentrazione finale a più di 50 μM avrebbe un effetto.

Infine, sebbene il consumo di ossigeno dipenda principalmente dalla respirazione, l'acidificazione extracellulare non è determinata esclusivamente dal lattato prodotto dalla glicolisi, ma anche dalla conversione dell'anidride carbonica in acido carbonico. È stato riportato che nei mioblasti alimentati con glucosio, un terzo dell'acidificazione extracellulare deriva da anidride carbonica nelle condizioni di base37. Di conseguenza, consigliamo cautela nell'interpretazione delle misurazioni ECAR derivanti dall'analizzatore Seahorse se non è stata effettuata alcuna correzione per la proporzione di acidificazione causata dallarespirazione 38.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Siamo grati a Nick Howe (Agilent Technologies) e Thomas Nicol (University of Oxford) per il loro supporto e la discussione critica durante lo sviluppo di questo metodo. Desideriamo ringraziare il personale della nostra struttura per animali al Livello 1 (University of Oxford, Biomedical Services Unit) e dell'Institute of Developmental and Regenerative Medicine (University of Oxford) per aver mantenuto e trasferito il pesce zebra. Questo lavoro è stato supportato dal Medical Research Council (MR/W006731/1 a KL), dal King Faisal Specialist Hospital & Research Centre (borsa di studio post-dottorato all'RA), dal Wellcome Institutional Strategic Support Fund (204826/Z/16/Z a JSOM), dalla British Heart Foundation IBSRF (FS//17/58/33072 a LCH), dal Consiglio Europeo della Ricerca (ERC) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea (715895, CAVEHEART, ERC-2016-STG a MTMM), finanziamenti per progetti della British Heart Foundation (PG/15/111/31939 e PG/23/11189 a MTMM), MTMM riconosce il sostegno del BHF Oxford Centre of Research Excellence, Università di Oxford (RE/24/130024) e del BHF Centre of Regenerative Medicine (RM/13/3/30159).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,5 ml tubi Eppendorf StarlabS1615-5550
piastra a 96 pozzi  ThermoFisherAB-0800
Antimicina AChemCruz & nbsp;SC-202467A
Mezzo DMEMAgilent1035755-100
DMSOSigma-Aldrich D2650-100mL
Ghiaccio secco 
EtanoloSupelco1.00983.2500
Kit per il Saggio di Flusso Extracellulare  Agilent103518-100Pack contiene una piastra utilitaria, un idrobooster, una cartuccia sensore, un coperchio (viene fornito con le piastre a isolot)
FCCPSigma-Aldrich C2920
GlucosioAgilent103577-100
GlutaminaAgilent103579-100
Incubatore
Micropiastra di cattura a isoliAgilent101122-10025 griglie incluse nel pacchetto
Strumento per l'acquisizione dello schermo dell'isolottoAgilent101135-100
Pinze per microdissezioneideal-tek3131760Dimensione 5-S (saranno necessarie 2x per isolare il ventricolo dal bulbus arteriosus e dall'atrio)
Forbici per microdissezioneFST15009-08
MS-222Sigma-Aldrich E10521
OligomicinaMP 151786
Omogeneizzatore mottor per pestello VWR431-0100
PestelliVWR431-0094
Piastra di Petri 35mmGreiner Bio-One627102
Piastra di Petri 92mmStarstedt82.1473
Kit per il test BCA PierceThermo Scientific23227
Mini compresse per inibitori di proteasi e fosfatasi, Pierce Proteasi e Inibitori della Fosfatasi, Prive di EDTAThermo ScientificA32961
PiruvatoAgilent103578-100
Buffer di lisi RIPABabbo NataleSC-364162
RotenoneMP 02150154-CF
Interfase Agilent di Seahorse AnalyticsAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
Analizzatore Seahorse XFe24Agilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
SigillanteThermo ScientificAB-0558
SPECTROstar NanoMG LABTECH GmbH601-0298
SpugnaFai un'incisione abbastanza lunga e profonda da far rientrare il pesce sul lato ventrale
Wave (versione 2.6.1.56)Agilenthttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
XF calibrant Agilent100840-000

Riferimenti

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