Un componente bioattivo dell'Aconitum Pendulum attenua l'infiammazione correlata all'artrite reumatoide nei ratti tramite la regolazione delle vie PI3K/Akt

Sommario

Utilizzando la farmacologia di rete e il docking molecolare, sono stati identificati componenti anti-artrite reumatoide (AR) di A. pendulum . Studi in vivo hanno dimostrato che gli alcaloidi diterpeni, in particolare la smirnotina A, alleviano i sintomi dell'AR nei ratti tramite la via PI3K/Akt.

Abstract

Nella medicina tradizionale cinese e in varie pratiche mediche etniche, le radici del pendolo Aconitum N. Busch sono comunemente utilizzate per la loro capacità di scavare meridiani, dissipare il reumatismo, favorire la circolazione sanguigna e alleviare l'artralgia. Di conseguenza, questa pianta medicinale è diventata un trattamento molto apprezzato per distorsioni e malattie reumatiche in diversi sistemi medici etnici. Questo studio ha indagato i meccanismi con cui sei composti precedentemente isolati di A. pendulum migliorano l'infiammazione correlata all'artrite reumatoide (AR) utilizzando approcci sia in vitro che in vivo . È stata impiegata una combinazione di tecniche, tra cui la farmacologia di rete, l'aggancio molecolare, il saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA), la colorazione di ematossilina ed eosina (H&E), la reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (q-PCR) e il western blot (WB). I risultati hanno dimostrato che la smirnotina A, uno dei sei composti, allevia i sintomi dell'AR mirando alla via di segnalazione PI3K/Akt e sopprimendo la risposta infiammatoria. Questi risultati forniscono una base scientifica per comprendere la base materiale e l'azione meccanicistica alla base dell'uso tradizionale di A. pendulum nel trattamento della RA.

Introduzione

L'artrite reumatoide (AR) è una malattia autoimmune cronica caratterizzata da infiammazione sinoviale, iperplasia del rivestimento sinoviale, infiltrazione delle cellule immunitarie, formazione di tessuto pannus invasivo e conseguente distruzione ^{articolare 1,2,3}. Con una prevalenza globale dello 0,5%–1%, l'AR rappresenta un significativo onere per la salute pubblica e impatta gravemente sulla qualità della vita dei^pazienti 4,5,6,7. Le terapie convenzionali—come il metotrexato (MTX), i glucocorticoidi, gli inibitori della Janus chinasi (JAK) e i farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS)—sono spesso limitate da effetti avversi e dalla risposta variabile del paziente, sottolineando la necessità di trattamenti^innovativi.

I prodotti naturali, in particolare gli alcaloidi, hanno attirato l'attenzione per i loro meccanismi multi-bersaglio e i profili di sicurezza favorevoli nella gestione dell'AR. Alcalioidi come berberina, sinomenina e matrina modulano vie infiammatorie chiave, tra cui proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK), fattore nucleare kappa B (NF-κB), fosfatidilinositolo 3-chinasi/protein chinasi B (PI3K/Akt), e Janus chinasi/trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione (JAK/STAT) e sottoregolano citochine come fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), interleucina (IL)-1β e IL-6, dimostrando potenziale^{terapeutico 9. 10}.

Nella medicina tibetana, l'AR è classificata come brum bu (artralgia dell'umidità), attribuita a uno squilibrio dei tre umore e all'accumulo di acqua gialla immatura nelle^{articolazioni 11,12} (Figura 1). L'Aconitum pendulum N. Busch è un'erba tradizionalmente utilizzata per espellere l'umidità, favorire la circolazione e alleviare il dolore^13,14. Sono state documentate oltre 50 formulazioni classiche tibetane contenenti questa erba, con una storia di uso clinico che si estende per oltre 300^{anni 15,16}. Tuttavia, i suoi componenti bioattivi e i suoi meccanismi rimangono poco caratterizzati.

Qui, combiniamo farmacologia di rete e aggancio molecolare per prevedere i costituenti anti-RA di Aconitum pendulum N. Busch e i loro potenziali bersagli e percorsi. Queste previsioni vengono successivamente validate sperimentalmente (Figura 2). Questo approccio integrato mira a chiarire la base materiale e le basi meccanicistiche dell'Aconitum pendulum N. Busch nel trattamento dell'AR, fornendo una base per lo sviluppo futuro di farmaci.

Protocollo

Cinquanta ratti maschi specifici di Sprague-Dawley privi di patogeni (SPF) (dal peso 180–200 g) sono stati forniti dal Centro Provinciale di Controllo e Prevenzione delle Malattie di Hubei (Accademia Provinciale di Medicina Preventiva dell'Hubei) (Wuhan, Cina; Certificato di Licenza per Animali n. SCXK(JB) 2023-0005). Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state condotte in rigorosa conformità con la Guida degli Istituti Nazionali di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (8ª edizione, 2011). Il protocollo dello studio è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico Sperimentale degli Animali della Tianjin Genink Biological Technology Co., Ltd. (Approvazione n. GENINK-20250074). I principali reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali allegata.

Coltura cellulare
La linea cellulare MH7A per l'artrite reumatoide umana (AR) è stata coltivata nel mezzo Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con siero fetale bovino (FBS) al 10% (v/v) e mantenuto a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO^₂17.

Animali e trattamenti
Gli animali venivano tenuti in una struttura standard specifica priva di patogeni (SPF) con un sistema di gabbia ventilata individualmente (IVC) in condizioni ambientali rigorosamente controllate: temperatura climatizzata di 21,0–25,0 °C, umidità relativa del 40–70%, fotoperiodo di 12 ore e rinnovamento completo dell'aria 15 volte all'ora. Dopo un periodo di acclimatazione di 7 giorni, i ratti sono stati divisi casualmente in sei gruppi sperimentali, riservando altri ratti come riserva per circostanze impreviste. Un modello acuto di artrite infiammatoria adiuvante (AA) è stato indotto tramite iniezione sottocutanea di 100 μL di adiuvante di Freund completo (CFA; 10 mg·^mL-1) nella zampa posteriore^{destra 18}. I gruppi sperimentali sono stati progettati come segue: gruppo di controllo a vuoto, gruppo modello AA, gruppo di controllo positivo (metotrexato, 0,9 mg·^kg-1)¹⁹ e tre gruppi di trattamento con smirnotina A somministrati a bassi livelli (0,962 mg·^kg-1), medi (1,923 mg·^kg-1) e ad alta dose (3,846 mg·^kg-1) basati sul valore IC₅₀.

Previsione di malattie e bersagli composti
Sulla base dello screening preliminare dell'attività condotto dal nostro gruppo di ricerca, sono stati selezionati per l'indagine sei composti che dimostrano una bioattività favorevole: cinque alcaloidi diterpenoidi (Figura 3), benzoiloconina (1), 14-benzoil-8-O-metilaconina (2), (−)-(A-b)-14α-benzoilossi-N-etil-13β, 15α-diidrossi-1α,6α,8β,16β,18-pentametossiaconitano (3), smirnotina A (4) e aconitina (5), insieme a un derivato della coumarina, scopoletina (6)²⁰. Le notazioni semplificate del sistema molecolare di input line-entry (SMILES) di questi composti sono state recuperate dal database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/) o generate utilizzando ChemDraw 18.0. Queste notazioni furono successivamente importate nel database SwissTargetPrediction (https://swisstargetprediction.ch/), con la specie specificata come "Homo sapiens". I potenziali target sono stati identificati selezionando geni con valore di probabilità > 0, e i corrispondenti Target Names e UniProt ID sono stati^{raccolti 21,22.}

Reti PPI
I geni bersaglio sovrapposti sono stati analizzati tramite rete di interazione proteina-proteina (PPI) utilizzando il database STRING (https://string-db.org/)²³. I dati risultanti, formattati in TSV, sono stati poi importati in Cytoscape 3.9.1 per ulteriori visualizzazioni e analisi. I parametri topologici della rete venivano calcolati utilizzando il plugin Network Analyzer integrato. Nella rete visualizzata, la dimensione del nodo e l'intensità del colore sono state mappate al valore di grado, mentre lo spessore dei bordi rifletteva la forza dell'interazione tra i bersagli. I target principali sono stati identificati e classificati in base al loro grado di^{associazione 24}.

Gene Ontology (GO) e analisi dell'arricchimento delle vie della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)
I target comuni sono stati sottoposti al database Metascape (https://metascape.org) per le analisi di arricchimento dei percorsi GO^{e KEGG 25}. I risultati funzionali sono stati visualizzati utilizzando la piattaforma bioinformatica WeiShengXin (https://www.bioinformatics.com.cn).

La costruzione della rete dei "percorsi dei "componenti attivi del farmaco-bersaglio-malattie"
I componenti attivi e i relativi target sono stati sistematicamente selezionati, seguiti da un'analisi di arricchimento funzionale per identificare i principali percorsi di segnalazione e i relativi bersagli. Questi elementi sono stati successivamente integrati utilizzando Cytoscape 3.9.1 per costruire una rete completa "farmaci–componenti attivi–malattia–percorsi". L'analisi topologica veniva poi eseguita con lo strumento Network Analyzer , in cui i nodi venivano classificati in base a parametri chiave, tra cui Degree e Betweenness, per identificare gli elementi centrali all'interno della rete.

Aggancio molecolare di composti chiave a bersagli centrali
Le strutture tridimensionali delle proteine bersaglio centrali, inclusi ESR1 (9BQE), PTGS2 (5F19), EGFR (2XKN), GSK3B (5HLN), SRC (5MTJ) ed ERBB2 (8U8X), sono state recuperate dal RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/; consultato il 7 maggio 2025). Le strutture composte furono costruite in ChemDraw (versione 18.0) e successivamente convertite in formato SDF tridimensionale utilizzando il modulo integrato Chem3D. I risultati dell'aggancio molecolare sono stati visualizzati con PyMOL e le affinità di legame sono state valutate in base all'energia di interazione (kcal·^mol-1)²⁶.

Saggio di viabilità cellulare
Le cellule MH7A nella fase di crescita logaritmica sono state seminate in piastre da 96 pozzi a una densità di 5 × 10³ cellule per pozzo. Al raggiungimento dell'80% di confluenza, le cellule sono state inizialmente trattate con lipopolisaccaridi (LPS) (1 μg·^mL-1) per 6 ore e poi esposte a concentrazioni variabili di smirnotina A (5, 25, 50, 75 e 100 μg·^mL-1). Ogni gruppo di trattamento è stato allestito in quadruplicata e incubato per 24 ore a 37 °C sotto il 5% di CO₂. Dopo l'incubazione, sono stati aggiunti 100 μL di soluzione al 10% di CCK8 in ciascun pozzo, seguiti da un'ulteriore incubazione a 37 °C per 2 ore. L'assorbanza a 450 nm veniva misurata utilizzando un lettore di microplacche.

Test ELISA nelle celle MH7A
Il soprantantante è stato raccolto tramite centrifugazione a 2000 × g per 20 minuti a 4 °C. I livelli di citochine infiammatorie, inclusi IL-6, IL-1β, TNF-α e IL-10, sono stati quantificati nel surnatante utilizzando i corrispondenti kit ELISA, rigorosamente secondo le istruzioni del produttore.

Misurazione del gonfiore delle dita
Il grado di gonfiore della zampa posteriore destra è stato valutato misurando il volume della zampa ogni 3 giorni dopo la modellazione. Le misurazioni sono state effettuate due volte per ratto e mediate. La risposta infiammatoria è stata quantificata come la percentuale di aumento del volume delle zampe rispetto al valore di base.

Misurazione dell'indice dell'organo
Tutti i ratti sono stati anestetizzati ed eutanasiati 24 ore dopo l'amministrazione finale. Viene adottato il metodo umano riconosciuto dalla comunità veterinaria internazionale. Innanzitutto, una concentrazione elevata (5%) di isoflurano viene utilizzata per anestetizzare profondamente l'animale. Una volta che perde conoscenza e tutti i riflessi, il petto si apre e il cuore viene tagliato, assicurando che l'animale muoia senza dolore e senza alcuna sensazione. Milza e timo furono prontamente rimossi e pesati. Dopo il risciacquo con soluzione salina normale, l'eccesso di umidità sulle superfici tissutali è stata rimossa con un tamponamento con carta filtrante, e i pesi umidi degli organi sono stati^{registrati 27,28}.

Ematossilina ed eosina (HE)
Per preservare l'integrità dei campioni di tessuto delle zampe, l'intera porzione distale rispetto all'articolazione della caviglia destra di ciascun ratto veniva raccolta e conservata. Per la sezione, si utilizzava il tessuto gonfio delle zampe. La procedura di campionamento fu la seguente: il tessuto circa 1 cm sopra l'articolazione della caviglia destra fu completamente dissezionato, il pelo rimosso e il fusto osseo fu tagliato all'estremità prossimale. Il campione è stato immediatamente fissato in una soluzione di paraformaldeide al 10%. Dopo la fissazione, il tessuto è stato inserito in una soluzione decalcificante al 15% di EDTA. La decalcificazione veniva monitorata ogni 3 giorni e la soluzione veniva aggiornata secondo necessità fino a quando il tessuto si ammorbidiva, indicando il completamento della decalcificazione. Il tessuto è stato poi disidratato tramite una serie di etanolo graduato (75% per 4 ore, 85% per 2 ore, 90% per 1,5 ore, 95% per 1 ora e due variazioni di etanolo al 100% per 0,5 ore). Le sezioni sono state deparafinizzate, reidratate con etanolo, colorate con ematossilina per 10 minuti, risciacquate con acqua del rubinetto, differenziate in acido cloridrico–etanolo per 10 secondi, risciacquate con acqua del rubinetto, blu, nuovamente risciacquate, immerse nell'85% di etanolo per 5 minuti, controcolorate con eosina per 5 minuti, risciacquate con acqua del rubinetto per 3 secondi, disidratate, pulite e montate per l'osservazione²⁹.

Saggio ELISA sul siero per ratti
I campioni di sangue sono stati centrifugati a 2000 × g per 20 minuti a 4 °C, e il soprantantante risultante è stato raccolto per l'analisi delle citochine. Le concentrazioni di IL-1β, IL-6 e TNF-α sono state determinate utilizzando kit ELISA commerciali, rigorosamente in conformità con i protocolli del produttore. Una curva standard veniva generata e adattata utilizzando il software cvxpt32, e i livelli di espressione di ciascuna citochina venivano calcolati interpolando i valori di assorbanza nella corrispondente equazione della curva standard. Le concentrazioni finali di proteine sono state calcolate dalle misurazioni sperimentali effettive.

Analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR)
L'RNA totale è stato isolato dalle cellule sinoviali utilizzando il reagente TRIzol, con separazione di fase ottenuta tramite aggiunta di^{cloroformio 30}. Fu quindi impiegato un kit commerciale di trascrizione inversa per sintetizzare cDNA dall'RNA isolato, seguendo rigorosamente le istruzioni del produttore. qRT-PCR veniva eseguita utilizzando un reagente SYBR Premix. La gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stata utilizzata come gene di riferimento endogeno, e i livelli relativi di espressione genica sono stati calcolati con il metodo ^2-ΔΔCt . Sono state utilizzate le seguenti sequenze di innesco: GAPDH Forward: ACAGCACAGGGTGTGGGGAC, e GAPDH Reverse: TTTGAGGGTGCAGCGAACTT; IL-17A Avanti: CTGATGCTGTTGCTGCTGCTATGA e IL-17A Retromarcia: TGGAACGGTTGAGGTAGTCTGA; TRAF6 Avanti: ACATTTCCCTCTTTGTCCACACAC, e TRAF6 Retromarcia: TTAGCATCATGACCTCTTCGT; IL-10 Avanti: CTGCAGGACTTTAAGGGTTATT, e IL-10 Retro: CTTGCTTTTATTCACAGGGGA; IL-1β Avanti: CCTGTGTGATGAAAGACGGC, e IL-1β Retromarcia: TATGTCCCGACCATTGCTGT; IL-6 Avanti: GTTGCCTTCTTGGGACTGATG, e IL-6 Retromarcia: TACTGGTCTGTTGTGTGTGGT.

Estrazione proteica e western blotting
Il tessuto sinoviale è stato lisato in un tampone RIPA integrato con radioimmunoprecipitazione (RIPA) con fosfatasi/inibitori proteasi, e le concentrazioni proteiche sono state misurate con un kit di analisi per l'acido bicinconinico (BCA). Per il Western blotting, i lisati contenenti quantità uguali di proteine sono stati sottoposti all'elettroforesi del gel di dodecil solfato di sodio-poliacrilamide (SDS-PAGE) e successivamente trasferiti sulle membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF). Dopo il blocco con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata con 0,1% Tween (TBST) per 2 ore a 25 °C, le membrane sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari (GAPDH 1:50000; P-PI3K 1:1000; PI3K 1:1000; P-AKT 1:3000; AKT 1:6000). Dopo un ampio lavaggio con TBST, le membrane sono state reattive con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) (Anti-IgG Mouse 1:10000; Anti-coniglio IgG 1:1000) per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo un'altra serie di lavaggi TBST, le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un substrato a chemiluminescenza avanzata (ECL). Le intensità delle bande venivano quantificate con il software ImageJ e normalizzate su GAPDH come controllo di carico.

Analisi statistica
Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando il software Graphpad Prism 9.5 e sono presentati come la deviazione media ±± standard. I confronti statistici sono stati effettuati utilizzando ANOVA unidirezionale quando appropriato. Un p-valore inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Rispetto al gruppo di controllo: ^*p < 0,05, ^**p < 0,01, p < 0,001 e p < 0,0001; Rispetto al gruppo Modello/LPS: ^#p < 0,05, ^##p < 0,01, ^###p < 0,001 e ^####p < 0,0001.

Risultati

Effetti dei derivati di A. pendulum su bersaglio anti-AR
Le strutture 3D dei sei composti sono state recuperate in formato SDF e i numeri SMILES sono stati caricati nel database SwissTargetPrediction per la previsione del bersaglio. I target con probabilità superiore a 0 venivano mantenuti e i risultati venivano esportati come file CSV. Dopo la rimozione dei duplicati, sono stati identificati in totale 97 potenziali bersagli correlati al composto.

Discussione

Questo studio integrato fornisce nuove intuizioni meccanicistiche sull'attività anti-artrite reumatoide dello smirnotino A, un alcaloide C19-diterpenoide dell'Aconitum pendulum N. Busch. I nostri risultati dimostrano che la smirnotina A migliora l'infiammazione dell'AR attraverso l'inibizione mirata della via di segnalazione PI3K/Akt, rappresentando un meccanismo distinto rispetto agli alcaloidi diterpenoidi precedentemente segnalati.

La combinazione ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	Vazyme	D111
Anticorpo monoclonale di topo AKT (60 kDa)	Biotecnologia Wuhan Sanying	60203-2-IG
Kit per il test proteico BCA	Biotecnologia Guangzhou Jiebeisi	G3522
BSA Standard	Biotecnologia Guangzhou Jiebeisi	G8532
Mezzo completo per cellule MH7A	Shanghai Fuheng Biotechnology	FH-MH7A
Kit ELISA per IL-10	Biotecnologia Lunchangshuo	ED-13626
Kit ELISA per IL-17A	Biotecnologia Lunchangshuo	ED-10344
Kit ELISA per IL-1 e beta;	Biotecnologia Lunchangshuo	ED-10351
Kit ELISA per IL-6	Biotecnologia Lunchangshuo	ED-10377
Kit ELISA per TNF-& alpha;	Biotecnologia Lunchangshuo	ED-11776
Sistema di PCR Quantitativo a Fluorescenza	Biosistemi applicati	ViiA-7
Anticorpo monoclonale di topo GAPDH	Biotecnologia Wuhan Sanying	60004-1-IG
Centrifuga refrigerata ad alta velocità	Attrezzatura per strumenti di Hunan Kecheng	HI-16KR
HiScript II Q Select RT SuperMix per qPCR	Vazyme	R223
Anticorpo secondario anti-topo marcato con HRP	Biotecnologia Wuhan Sanying	SA00001-1
Anticorpo secondario anti-coniglio marcato con HRP	Beyotime Biotechnology	A0208
Linea di sinoviociti simili a fibroblasti per l'artrite reumatoide umana MH7A	Biotecnologia Qisai	QS-H075
Lettore di microplacche	BioTek	MQX200
Microscopio	Leica	FLEXACAM C1
Lettore di micropiastre multimodale	Dispositivi molecolari	FlexStation 3
Anticorpo policlonale P-AKT (60 kDa) anticorpo policlonale del coniglio	Biotecnologia Wuhan Sanying	28731-1-AP
Microtomo di Paraffina	Leica	RM 2016
Amplificatore PCR	Biosistemi applicati	proFlex
Soluzione salina tamponata con fosfato (1 e volte; PBS)	Biotecnologia Qisai	QS-S001
Anticorpo policlonale del coniglio PI3K (85 kDa)	Affinità	AF6241
Anticorpo policlonale P-PI3K (85 kDa) anticorpo policlonale del coniglio	Affinità	AF3242
Smirnotine A	isolata e identificata dal nostro laboratorio	C39H49NO11
Disidratatore di tessuti	Wuhan Junjie Electronic	JT-12J
Macchina per l'incassamento dei tessuti	Wuhan Junjie Electronic	JB-L6
Macchina per la diffusione dei tessuti e la panificazione	Wuhan Junjie Electronic	JK-6
Trizol	Ambion	15596-026
Soluzione digerente delle cellule di tripsina (0,25% tripsina e nbsp; con EDTA, senza fenolo rosso)	Biotecnologia Qisai	QS-S401