Cella singola elettroporazione in vivo all'interno del cervello intatto in via di sviluppo

Sommario

Elettroporazione di singole cellule (SCE) è una tecnica specializzata che consente la consegna di DNA o di altre macromolecole in singole celle all'interno del tessuto intatto, anche in preparati in vivo. Qui dettaglio la procedura di SCE di un colorante fluorescente o DNA plasmidico in neuroni all'interno del cervello intatto della Xenopus laevis girino.

Abstract

Elettroporazione di singole cellule (SCE) è una tecnica specializzata che consentono la fornitura di DNA o di altre macromolecole in singole celle all'interno del tessuto intatto, anche in preparati in vivo. Il vantaggio di questa tecnica è che le manipolazioni sperimentali può essere eseguita su singole cellule, lasciando inalterato il tessuto circostante, in modo da distinguere cellule effetti autonomi e da quelli risultanti da trattamenti globali. Se combinati con avanzate tecniche di imaging in vivo, SCE di marcatori fluorescenti permette la visualizzazione diretta della morfologia cellulare, la crescita cellulare, ed eventi intracellulari su scale temporali che variano da secondi a giorni. Mentre questa tecnica è utilizzata in una varietà di preparati in vivo ed ex vivo, abbiamo ottimizzato questa tecnica per l'utilizzo in girini Xenopus laevis. In questo articolo video, abbiamo dettaglio la procedura di SCE di un colorante fluorescente o DNA plasmidico in neuroni all'interno del cervello intatto l'albino Xenopus girino. Abbiamo anche discutere i metodi per ottimizzare la resa, e mostrare esempi di vivere a due fotoni imaging di fluorescenza dei neuroni fluorescente da SCE.

Protocollo

Attrezzature di set-up:

1. Le apparecchiature elettriche richieste per questa tecnica sono uno stimolatore, un oscilloscopio e un supporto micropipetta dotato di un filo d'argento per essere inserito nella micropipetta. Usiamo tipicamente un assone strumenti Axoporator 800A stimolatore, tuttavia altri stimolatori comuni come gli strumenti Grass SD9 stimolatori sono adatti anche per singola cellula elettroporazione. Lo stimolatore è collegato al headstage, che si interfaccia con l'elettrodo filo d'argento per essere collocato all'interno del micropipetta di vetro contenente una soluzione interna direzione d'orchestra. Il piombo altri lo stim....

Discussione

Elettroporazione di singole cellule (SCE) è un potente strumento per determinare la funzione del gene e l'esecuzione di mirati manipolazione genetica. La trasparenza del girino albino e l'accessibilità del cervello fanno di questo sistema modello ideale per la visualizzazione di crescita neuronale e di eventi intracellulari all'interno di un organismo vivo. SCE permette la visualizzazione della crescita di un singolo neurone, e di eseguire manipolazioni cellulari autonoma all'interno di un cervello altrimenti inalterato. Men.......