Utilizzo della RMN in soluzione per caratterizzare condensati biomolecolari in condizioni bifasiche

Sommario

Qui presentiamo protocolli per metodologie NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) e CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT) che consentono la caratterizzazione quantitativa e senza etichettatura dei condensati biomolecolari in condizioni bifasiche, rivelando la partizione molecolare, la dinamica dello scambio, l'idratazione del condensato e la struttura delle gocce senza sedimentazione o marcatura.

Abstract

I condensati biomolecolari formati tramite separazione in fase liquido-liquido (LLPS) organizzano l'ambiente intracellulare e regolano diversi processi biochimici. Nonostante la loro importanza, sondare la composizione del condensato, la dinamica dello scambio e l'organizzazione interna rimane una sfida, soprattutto senza tag esterni. La spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) può fornire una finestra unica senza etichette su questi assemblaggi mesoscala, catturando sia il moto molecolare sia l'eterogeneità ambientale. Due metodologie complementari di NMR permettono una caratterizzazione completa dei condensati direttamente nel loro stato bifasico. Per condensati abbastanza dinamici da essere osservabili tramite NMR, l'approccio di scambio di diffusione, la DIffusion REstritricata di speciE INvisible, abbreviata in REDIFINE, utilizza il contrasto di diffusione con lo scambio chimico per quantificare la frazione di molecole suddivisa tra fasi condensata e diluita, determinare la dimensione delle goccioline e la permeabilità dell'interfaccia ed estrarre i tassi di scambio molecolare attraverso il confine di fase. Per condensati più rigidi e invisibili per RMN, il metodo di magnetizzazione-trasferimento semi-solido rilevato dall'acqua, CONdensate DEtectioN tramite SEmi-solid Magnetization Transfer, o in breve CONDENSE-MT, sfrutta il contrasto di rilassamento e lo scambio protonico tra biomolecole condensate e solvente in fase diluita per monitorare i condensati sui protoni d'acqua in massa, fornendo accesso alla partizione relativa, ai tassi di rotazione molecolare, alla dinamica dell'idratazione e al contenuto di acqua legata. Insieme, questi approcci offrono una visione multidimensionale e quantitativa della struttura e della dinamica del condensato in condizioni bifasiche quasi native, senza etichette fluorescenti o di rilevamento. La loro integrazione amplia la cassetta degli attrezzi NMR per studiare la separazione delle fasi biomolecolari e stabilisce una base per collegare le proprietà fisicochimiche del condensato con la loro funzione biologica e la cattiva regolazione patologica.

Introduzione

Le cellule raggiungono la loro straordinaria organizzazione spaziale e temporale compartimentalizzando le reazioni^{biochimiche 1,2,3}. Oltre agli organelli legati alla membrana, molti processi cellulari cruciali avvengono all'interno di compartimenti senza membrana formati dalla separazione della fase liquido-liquido (LLPS) di proteine e acidi^{nucleici 4}. Questi assemblaggi dinamici, spesso chiamati condensati biomolecolari, includono il nucleolo, i granuli di stress, le macchie nucleari e i corpi di elaborazione, che svolgono ruoli essenziali, ad esempio, nel metabolismo dell'RNA, nella regolazione della trascrizione o nella trasduzione^{del segnale 5,6}. La loro capacità di formare, sciogliere e scambiare componenti in risposta ai segnali ambientali fornisce alle cellule un meccanismo versatile per organizzare attività biochimiche senza dipendere dalle membrane lipidiche.

Un ampio sottoinsieme di condensati biomolecolari proviene da proteine che legano l'RNA (RBP) che contengono regioni intrinsecamente disordinate (IDR) e domini di legame all'RNA (RBD)^7,8. Queste proteine possono separarsi in fase sia da sole che in complesso con l'RNA, dando origine a condensati con proprietà materiali e funzioni biologiche diverse. Ad esempio, la proteina nucleocapside (N) del SARS-CoV-2 forma condensati biomolecolari dipendenti da^{RNA 9} implicati nell'imballaggio e nell'assemblaggio del genoma virale, mentre la proteina di legame del tratto polipirimidinico 1 (PTBP1) forma condensati nucleari che contribuiscono al silenziamento^{genico 10}. Inoltre, proteine come FUS e DDX4 subiscono LLPS guidate dalle loro regioni disordinate, influenzando il metabolismo dell'RNA e la formazione dei granuli^{di stress 11,12}. La disregolazione di questi processi è collegata a malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la demenza frontotemporale, dove transizioni di fase aberranti possono portare all'aggregazione e alla perdita di^{funzione 13}.

La condensazione non è limitata a proteine e complessi proteina–RNA. L'RNA da solo può subire LLPS, in particolare nel contesto di sequenze di espansione ripetuta associate a diversi disturbi neurodegenerativi^14,15. Le espansioni ripetute di trinucleotidi ed esanucleotide, come la CAG nella malattia di Huntington o la CUG nella distrofia miotonica, possono formare condensati simili a goccioline sia in vitro che nelle^{cellule 14}. Comprendere la base fisica della condensazione dell'RNA, così come come differisce dai condensati guidati da proteine e proteine-RNA, è fondamentale per chiarire i meccanismi molecolari alla base delle malattie a espansione ripetuta.

Nonostante la loro importanza biologica, la caratterizzazione quantitativa e senza etichettatura dei condensati biomolecolari rimane una sfida^{formidabile 16}. Le tecniche convenzionali di microscopia a fluorescenza e spettroscopia si basano su marcatori esterni, che possono perturbare la struttura, la dinamica o il comportamento delle fasi^{della biomolecola.} Inoltre, alcuni condensati sono invisibili alla NMR a causa del moto molecolare limitato e delle forme linearie ampie, limitando le informazioni accessibili con gli approcci NMR tradizionali. Di conseguenza, è urgente la necessità di strategie sperimentali che possano sondare direttamente i condensati nel loro stato biphasico e nativo, senza etichettatura. Dato l'importante ruolo del confine della fase delle gocce nei processi di scambio e nella maturazione del condensato, è altrettanto importante stabilizzare le gocce biomolecolari all'interno di un dato volume di campione, prevenendo così la sedimentazione della fase densa. Questo può essere facilmente ottenuto utilizzando gli idrogel di agarosio, che imitano il citoscheletro.

Gli sviluppi recenti nelle metodologie basate sulla NMR offrono una soluzione di questo tipo. L'approccio REDIFINE (REstricted DIffusion of INvisible speciEs)¹⁹ combina la NMR per diffusione con l'analisi dello scambio chimico per quantificare la partizione molecolare, la cinetica dello scambio e la dimensione delle gocce nei condensati proteina e proteina–RNA. Parallelamente, la tecnica CONDENSE-MT (CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer)²⁰ rileva condensati invisibili tramite NMR tramite trasferimento di magnetizzazione dell'acqua, permettendo la quantificazione della quantità di materia condensata in date condizioni e rivelando ulteriormente la dinamica dell'idratazione e le velocità di rotazione molecolare all'interno del condensato. Insieme, questi metodi permettono indagini non invasive e senza marcatori su diversi tipi di condensati, solo proteine, proteina–RNA e condensati solo RNA in condizioni bifasiche di equilibrio. Ampliando la cassetta degli attrezzi NMR, aprono la porta a un'esplorazione sistematica e quantitativa della struttura del condensato, della dinamica e delle loro connessioni con la funzione biologica e le malattie.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Scelta del tampone: Utilizzare tamponi testati in cui le biomolecole sono più stabili.
   NOTA: I segnali NMR sono tipicamente più forti a pH più bassi. Come requisito tecnico, aggiungere il 5% di D₂O come blocco di campo a tutti i campioni NMR (v/v finale).
2. Stabilizzare il campione bifasico utilizzando un idrogel di agarosio che imita il citoscheletro come mezzo. Pesa la polvere di agarosio per preparare un calcio di agarosio all'1,5% (w/v) nello stesso tampone. Utilizzare l'agarosio normale come alternativa più economica ai condensati biomolecolari formati da proteine intrinsecamente disordinate (IDP) e RNA che possono resistere a temperature più elevate. Utilizzare agarosio a bassa fusione quando si preparano delicati condensati che coinvolgono proteine che contengono domini^{ripiegati 19}.
3. Preparazione del calcio di agarosio: riscaldare la sospensione a circa 80 °C per 10 minuti e sciogliere completamente l'agarosio mescolando o facendo vortice.
   ATTENZIONE: L'agarosio fuso è caldo e può bruciare; maneggiare con guanti resistenti al calore.
   NOTA: Mantenere l'agarosio fuso caldo (ad esempio, 55 °C per l'agarosio normale e 37 °C per l'agarosio a bassa fusione) in un bagno d'acqua per rimanere liquido prima di mescolarlo con il campione biologico.
   L'agarosio fuso può essere mantenuto caldo per diverse decine di^{minuti 19,21}.
4. Preparare il campione finale biphasic:
   1. Per preparare un campione bifasico stabilizzato con idrogel di agarosio, miscelare stock proteici (e/o RNA) con il rispettivo tampone caldo di agarosio in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml.
      NOTA: La concentrazione finale di proteine/RNA è tipicamente di 50-500 μM per essere adatta al rilevamento NMR.
   2. Trasferisci immediatamente la miscela in un tubo NMR da 3 mm usando una lunga pipetta di vetro. Lascia che l'agarosio si solidifichi poco dopo il trasferimento.
      NOTA: Senza agarosio, il campione biphasico si sedimenta nel tempo, complicando l'acquisizione e l'analisi dei dati NMR perché il campione cambia fisicamente nella scala temporale dell'esperimento.
5. Eseguire un'ispezione visiva: ispezionare il campione in modo visivo. Se avviene una separazione di fase, il campione appare immediatamente torbido e rimane così. Ciò indica che il campione bifasico è stato stabilizzato con successo nell'agarosio.
6. Quando intendi eseguire CONDENSE-MT, prepara un campione di riferimento aggiuntivo di agarosio facendo gli stessi passaggi, ma omettendo l'aggiunta della biomolecola. Aggiungi invece il buffer per ottenere lo stesso volume di campione. Prepara questo campione solo dopo aver preparato il campione di condensato e aver misurato tutti i dati su di esso per assicurarti che il campione di riferimento dell'agarosio non venga incubato più a lungo.

2. Registrazione degli esperimenti REDIFINE

1. Blocca, shim, abbina e sintonizza il ^{canale 1}H come al solito. Calibra la lunghezza dell'impulso di 90° su ¹H usando la tua procedura generale.
2. Registra uno spettro 1D soppresso dall'acqua. Idealmente si osserva un segnale biomolecolare forte (Figura supplementare 1A).
   1. Se non si osserva alcun segnale o molto poco, si assume che la proteina/RNA condensata non sia osservabile nella NMR e che la partizione nella fase condensata sia elevata. In questo caso, non procedere con REDIFINE poiché questa metodologia si basa su un segnale biomolecolare osservabile.
   2. In questa situazione, in linea di principio gli esperimenti CONDENSE-MT dovrebbero funzionare molto bene, quindi si passa immediatamente allo Passo 4 (Registrazione degli esperimenti CONDENSE-MT).
3. Carica l'esperimento convenzionale di Spettroscopia Ordinata per Diffusione (DOSY) che si basa su una procedura convenzionale di Echo Stimolata 2D utilizzando gradienti bipolari (sequenza di impulsi di Bruker: stebpgp1s19). Consulta i manuali utente di Bruker DOSY e Diffusion per maggiori dettagli.
4. Imposta P0, P1 e P27 sulla lunghezza calibrata dell'impulso di 90°. Imposta come regola generale NS a 32 scansioni, DS a 16, TD1 a 16, e regola TD2 e SW2 per ottenere un tempo di acquisizione AQ di 80-100 ms. Imposta d1 a 1,5 s.
   NOTA: I gradienti devono essere calibrati correttamente.
5. Ottimizza il ritardo Watergate d19 come di consueto in base al tuo campo magnetico, per ottenere la massima eccitazione a aromatici (circa 7 ppm) o alifatici (circa 1 ppm). Imposta d20 a 75 ms. La scelta del p30 dipenderà dalla dimensione della proteina/RNA. Per le proteine >20 kDa, si usano 5 ms; Per proteine più piccole, usa 3,5 ms come regola generale.
6. Registra un esperimento DOSY tramite il comando: 'xau dosy 2 95 16 l y y' che ordina la intensità del gradiente di diffusione da 2 a 95% in 16 passi, in modo lineare.
   1. Idealmente, si dovrebbe osservare il decadimento iniziale del segnale derivante dalla fase diluita, mentre il decadimento del segnale della fase condensata dovrebbe stabilizzarsi (Figura 1A e Figura Supplementare 1B).
7. Per continuare ad acquisire dati per l'intero set REDIFINE, crea 9 nuovi stebpgp1s19 copiando i parametri dall'iniziale che hai appena eseguito. In ogni esperimento consecutivo, si modifica solo il ritardo di diffusione d20 in passi variabili per coprire l'intervallo da 100 a 1000 ms (cioè 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 1.000 ms).
8. Esegui ciascuno di questi esperimenti con il comando 'xau dosy 2 95 16 l y n'. L'ultima "n" garantisce che il guadagno del ricevitore sia preservato durante i 10 esperimenti.

3. Elaborazione dei dataset REDIFINE e visualizzazione dei risultati

1. Elaborare ogni esperimento (10 in totale) nel seguente modo:
   1. Imposta qsine di SSB 2 come funzione finestra, estrai la^{quinta fetta} usando qsin; fp, fasi 1D e salva i parametri di fase nel dataset 2D.
   2. Poi elabora il 2D con xf2, fai la correzione di base abs2 ed estrai queste 16 fette con split2D (ulteriori input nella finestra pop-up: r – 16 – 11). Questo estrarrà 16 spettri acquisiti utilizzando diverse intensità di gradiente e li salverà come esperimenti processati 1D da 11 a 26 all'interno dello stesso dataset.
   3. Ripeti lo stesso per i restanti 9 esperimenti. A volte è fondamentale controllare almeno le prime 4-5 fette per assicurarsi che la fase di fase e la correzione di base siano corrette. Se necessario, correggere manualmente – una buona fase e una buona base di base sono prerequisiti per una corretta quantificazione (Figura 1B).
2. Utilizzare il LLPS_REDIFINE_fit di codice Matlab fornito per l'analisi (Figura supplementare 2A). Nel codice, regola secondo i tuoi esperimenti i seguenti: 'Delta' (diffusione per d20), 'P.d' (durata totale del gradiente 2*p30), exp(1,:) a exp(10,:) basandosi sul # degli esperimenti che hai eseguito. Poi imposta P.g in base alle intensità del gradiente della sonda (accessibile nella cartella TopSpin experiment sotto file "difflist").
3. Regola la 'cartella' e il 'percorso' in base alla posizione dei dati. Esegui il codice fino alla riga 40. Questo ti darà la fetta 1D – da qui scegli le regioni di integrazione; Questi dovrebbero includere aromatici o alifatici, e scegliere la regione il più stretta possibile, senza considerare gruppi molecolari diversi come amide.
4. Inserire i confini di integrazione nei punti nelle variabili 'sinistra' e 'destra' di conseguenza (Figura supplementare 2A). Questo serve a integrare i dati per l'analisi quantitativa (Figura 1C). Scegli il nome della matrice in base al campione, alla data di esecuzione e ad alcuni dettagli sperimentali.
5. Esegui tutto il codice. In 'fit0', puoi scegliere i parametri iniziali che la funzione di ottimizzazione userà per avviare la minimizzazione. Inizia con i valori predefiniti e, se non si raggiunge la convergenza, si cambia il secondo valore fit0 (popolazione nella fase condensata) a passi di 0,1 da 0,1 a 1.
   NOTA: A volte il dataset ha diversi minimi locali, e è necessario variare ampiamente i parametri iniziali per iniziare a convergere verso il minimo più globale.
6. Quando è stato raggiunto un fitting soddisfacente, i valori di fitting saranno scritti all'interno della figura (Figura 1D e Figura Supplementare 2B) e possono essere accessibili nella variabile 'fitting'. Traccia ulteriormente questi parametri come un grafico statistico per una visualizzazione migliore.

4. Registrazione degli esperimenti CONDENSE-MT

NOTA: L'obiettivo dell'esperimento è rilevare indirettamente i condensati osservando il segnale dell'acqua del solvente tramite lo scambio^{protonico 20}. Nell'esperimento CONDENSE-MT, viene acquisito e analizzato un profilo MT tramite impronte digitali (Figura 2A⁾²⁰.

1. Registra il tuo spettro preferito 1D soppresso dall'acqua. Se viene osservato pochissimo segnale, è molto probabile che l'esperimento CONDENSE-MT funzioni molto bene.
2. L'analisi quantitativa CONDENSE-MT richiede una determinazione preventiva del tasso R1 dell'acqua. Determina il tasso di_R1 tramite il recupero da inversione T₁ . Copia la sequenza degli impulsi fornita, il set dei parametri di Bruker e la lista vd nelle rispettive cartelle. Carica il parametro "T1_inversion_recovery" e regola potenze e frequenze sul tuo spettrometro NMR (secondo "edprosol").
   1. Calibra l'impulso a 90° di 1H (p1), imposta NS a 2, DS a 0, d1 a 20 s, SW a 10 ppm, TD2 a 16k e TD1 a 24 (della lunghezza della tua lista vd regolata). Abilita un gradiente debole lungo Z (GPZ0 = 0,1 %) per evitare effetti di smorzamento delle radiazioni.
3. Per l'esperimento CONDENSE-MT,
   1. Copia il set di parametri Bruker fornito, la sequenza e la lista delle frequenze nelle cartelle specifiche per Bruker, carichi il set di parametri "CONDENSE-MT" e regola frequenze e potenze secondo il tuo spettrometro.
   2. Imposta P1 alla lunghezza calibrata dell'impulso di 90° e P4 a 1 μs per l'impulso di eccitazione per evitare l'attenuazione delle radiazioni. Imposta NS a 2, DS a 16, d1 a 4 s, SW2 a 20 ppm, TD2 a 8k, TD1 alla lunghezza della lista frequenze (tipicamente 46). Imposta SPNAM10 su Squa100.1000 e la sua durata da p10 a 5 s.
   3. Trova la potenza SP10 che produce irradiazione a 100 Hz (il comando 'pulse 100 Hz' calcolerà la tua potenza sia in watt che in dB). Regola di conseguenza la potenza SP10 dell'impulso di irradiazione ed esegui questo esperimento pseudo-2D usando il comando 'zg'.
      NOTA: L'esperimento utilizzerà la lista di frequenze fornita che copre gli offset di irradiazione dalla risonanza con l'acqua fino alla risonanza molto lontana (100000 Hz) per rilevare il segnale dell'acqua a diversi offset di irradiazione (Figura 2B). Un grafico degli integrali idrici (garantire una corretta fase degli spettri; Figura 2C) rispetto allo spostamento dell'irradiazione si ottiene il profilo CONDENSE-MT mostrato nella Figura 2A.
4. Creare 7 nuovi esperimenti e, in ciascuno consecutivo, aumentare solo la potenza di irradiazione per coprire l'intervallo da 170 Hz a 1000 Hz (cioè 170, 250, 330, 500, 650, 780, 1.000 Hz). In ogni esperimento, usa il comando del punto precedente. Per ogni potenza di saturazione, verrà acquisita l'intera lista di offset (Figura 2D).
   NOTA: l'adattamento condense-MT richiede i dati di riferimento acquisiti sul campione solo di agarosio (mezzo senza condensati biomolecolare). Assicurarsi lo stesso intervallo di tempo tra la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati, e acquisire lo stesso dataset di 8 esperimenti su un campione di riferimento agarosio. Questo serve a garantire che sia il riferimento dell'agarosio che il campione biphasic siano stati incubati per lo stesso periodo di tempo.

5. Elaborazione dei dataset CONDENSE-MT e visualizzazione dei risultati

1. Elaborare ogni esperimento CONDENSE-MT (8 in totale, Figura Supplementare 3A) nel modo seguente.
   1. Imposta qsine di SSB 2 come funzione finestra, estrai la^46ª fetta usando qsin; fp, fasi il picco dell'acqua in 1D e salva i parametri di fase nel dataset 2D, poi elabora il 2D con xf2 ed estrai queste 46 fette con split2D (ulteriori input nella finestra pop-up: r – 46 – 11).
      NOTA: Questo estrarrà 46 spettri 1D acquisiti utilizzando diversi offset di irradiazione e li salverà come esperimenti processati 1D da 11 a 56 all'interno dello stesso dataset (Figura supplementare 3A, mostrata per l'esperimento CONDENSE-MT a 1000 Hz).
   2. Ripeti lo stesso per i restanti 7 esperimenti. Controlla diverse fette di ogni esperimento per assicurarti che la fase e la linea di base siano corrette (Figura 2C). Se necessario, correggete manualmente – una buona fase e una buona base di base sono prerequisiti per una corretta quantificazione!
2. Ripetere gli stessi passaggi sui dati acquisiti utilizzando un campione di riferimento agarosio e per gli esperimenti di recupero per inversione, estraendo la 24ª fetta per la fase e usando split2D (r – 24 – 11).
3. Adatta i dati acquisiti utilizzando il codice Matlab fornito. Segui le istruzioni specifiche del copione.
4. Esegui prima l'analisi di adattamento per il campione di riferimento dell'agarosio per ottenere i parametri di fondo in assenza di condensati. Il codice read_CONDENSE_MT_data legge innanzitutto i dati NMR elaborati e integra il segnale di risonanza dell'acqua nelle fette 1D generate dal comando split2D (Figura supplementare 3B).
5. Stabilire i confini di integrazione individualmente; uno spettro di riferimento 1D sarà tracciato in Matlab per valutare i confini di integrazione (Figura Supplementare 3C). Il codice normalizzerà ulteriormente i dati e adatterà gli integrali normalizzati dell'acqua in funzione dello offset di irradiazione e della potenza al modello^{CONDENSE-MT 20}. Il read_CONDENSE_MT_data memorizzerà gli integrali normalizzati nella variabile integral_water_real_all, che viene poi utilizzata per il successivo adattamento.
6. Determinare il tasso di rilassamento R₁ dell'acqua in presenza di agarosio o condensati prima di adattare i dati CONDENSE-MT.
   NOTA: L'adattamento dell'esperimento di recupero per inversione dell'acqua può essere effettuato all'interno della prima sezione dello script CONDENSE-MT_full Matlab (o dello script CONDENSE_MT_referenceMTpool nel caso dei dati di riferimento dell'agarosio). Il nome del file e il percorso dell'esperimento, così come l'ID dell'esperimento per l'esperimento, possono essere inseriti per eseguire lo script Inversion_Recovery Matlab (Figura Supplementare 4A, sezione 1). Se necessario, il numero di slice 1D e i confini di integrazione possono essere regolati in questo script; quest'ultimo dipende dai parametri di elaborazione utilizzati in TopSpin. Questa sezione determinerà la velocità R1 dell'acqua e la memorizzerà nella variabile P.R1w , necessaria per il successivo adattamento dei dati CONDENSE-MT.
7. Per i dati di agarosio, si usano gli integrali normalizzati in modo semplice per l'adattamento, usando lo script CONDENSE_MT_referenceMTpool (che chiama la funzione function_1MT .
8. Per la quantificazione del condensato, utilizzare i parametri adattati dell'agarosio come input per il fitting globale dei dati acquisiti sul campione condensato (Figura supplementare 4A). Questo fisserà le proprietà fisiche della rete di agarosio come valori costanti dell'adattamento, permettendo la quantificazione dell'effetto aggiuntivo mediato dal condensato di un condensato incorporato nella rete di agarosio (Figura 2E).
9. Effettua la quantificazione del condensato usando lo script CONDENSE-MT_full , che chiama la funzione function_2MT Matlab. I parametri iniziali per l'ottimizzazione computazionale sono dati tramite fit0 (Figura supplementare 4B). L'incertezza dei parametri dell'adattamento sarà calcolata con la matrice di Jacob da cui si deriverà la matrice varianza-covarianza (Figura supplementare 4B).
10. Valutare la qualità dell'adattamento tramite la deviazione dell'adattamento, che somiglia alla deviazione residua della previsione del modello dai dati sperimentali. Per un ulteriore controllo qualità, tracciare l'adattamento insieme ai dati sperimentali (Figura Supplementare 4C).

Risultati

Il protocollo LLPS REDIFINE descritto qui è stato applicato al dominio FUS N-terminale (NTD). La FUS NTD si separa facilmente in condizioni ambientali a concentrazioni^{micromolari 19,21}. Questo campione particolare è stato preparato a una concentrazione di 200 μM in un buffer HEPES da 30 mM contenente 200 mM KCl al pH 7,5, con lo 0,5% di agarosio regolare. Alla separazione delle fasi, i segnali FUS NTD rimangono osservabili nella fase condensata (Figura 1A,B). Questo lo rende un candidato perfetto per studiare LLPS REDIFINE. In particolare, la maggior parte delle proteine inclini a LLPS contiene lunghe regioni intrinsecamente disordinate che di solito rimangono osservabili nella fase condensata; tuttavia, nelle proteine più strutturate, questo non è il caso.

L'adattamento REDIFINE (Figura 1D e Figura 3A,B) ha rivelato molteplici parametri unici per questo campione FUS NTD. In particolare, ha determinato i coefficienti di diffusione nelle fasi diluita e condensata (D_dil e_{D cond}), la popolazione di proteine nella fase condensata (ν_cond), la dimensione media delle goccioline R e la permeabilità dell'interfase p. La dimensione delle goccioline e la permeabilità definiscono il tasso di scambio di interfase dalla fase condensata a quella diluita k_cd=3p/R, permettendoci di ottenere informazioni sulla dinamica dello scambio¹⁹.

Questi risultati possono essere visualizzati in modi diversi (Figura 3B). Utilizzando un diagramma a ragno, si possono confrontare i risultati tra diverse condizioni o campioni. D'altra parte, si possono rappresentare in modo pictorico i parametri REDIFINE nel modello per visualizzarli nel modo più efficace. Si noti che REDIFINE fornisce tutti questi risultati senza etichetta in sole poche ore utilizzando un solo campione.

Poiché il segnale NMR di FUS NTD rimane rilevabile nella fase condensata (Figura 3C), il CONDENSE-MT molto probabilmente non sarà applicabile a causa della mancanza di contrasto di rilassamento. Abbiamo registrato il set di dati CONDENSE-MT su FUS NTD e, infatti, non si osserva alcuna differenza nel profilo MT tra il riferimento agarosio e il campione biphasic FUS NTD (Figura 3C). Questo rende la metodologia CONDENSE-MT inapplicabile a questo particolare campione FUS NTD.

Tuttavia, il CONDENSE-MT fornisce una caratterizzazione dinamica dei condensati di RNA a espansione ripetuta (Figura 3C,D)²⁰. Si noti che CONDENSE-MT potrebbe fornire più parametri che caratterizzano in modo univoco l'RNA nella fase condensata (Figura 3D), nonostante il suo segnale sia non osservabile nella NMR convenzionale (Figura 3C). I parametri ottenuti sono la cinetica dello scambio protonico tra condensato e acqua in massa (_{condensato k, H2O} e_{k H2O, condensato}), il tasso di rilassamento T₂ per il condensato (T_{2, condensato}), che riflette l'entità dell'arresto dinamico delle biomolecole durante la condensazione, e il tasso apparente di R₂ dell'acqua in massa (R_{2, acqua}). Quest'ultimo parametro è una combinazione lineare della velocità di rotazione dell'acqua diluita e di massa e dell'acqua condensata a lenta rotola. Valori_idrici più alti di R 2 indicano una popolazione maggiore di acqua nel condensato, il che eleva il tasso apparente complessivo di R₂ dell'acqua^{a 20} (Figura 2E e Figura 3D).

DISPONIBILITÀ DI DATI E CODICE

I dati grezzi LLPS REDIFINE e i codici di elaborazione sono disponibili nel repository Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . I dati grezzi e i codici di elaborazione di CONDENSE-MT sono stati depositati nel repository Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697. MATLAB è necessario per l'elaborazione. Sono inoltre forniti all'interno di questo articolo (File di Codifica Supplementare).

Figura 1: flusso di lavoro REDIFINE. (A) Le misurazioni di diffusione producono curve complesse di decadimento della diffusione bifasiche nei campioni condensati. Il decadimento risultante contiene parametri deconvoluti che descrivono i coefficienti di diffusione delle specie nella fase condensata e diluita, le loro popolazioni, la dimensione delle goccioline e il tasso di scambio interfase. (B) Per decodificare questi parametri isolati, è necessario registrare un dataset pseudo-3D variando non solo l'intensità del gradiente ma anche i ritardi di diffusione. È assolutamente essenziale per la quantificazione che ogni fetta di queste misurazioni sia correttamente fasaltata e corretta in base baseline. (C) Dopo aver verificato la qualità dei dati misurati e processati, queste fette 1D vengono inserite nel codice MATLAB per l'analisi e il grafico finale. (D) I dati vengono poi adattati da un risolutore di programmazione non lineare. Il fitting e i parametri risultanti sono illustrati per il campione bifasico FUS NTD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Flusso di lavoro CONDENSE-MT (A) Un profilo CONDENSE-MT unico osservato sulla risonanza idrica che illustra l'allargamento dovuto alla presenza di biomolecole condensate e acqua. (B) L'acqua viene osservata per ogni offset di irradiazione. (C) Per la quantificazione, è essenziale che tutti gli spettri siano posizionati correttamente. (D) Dopo aver acquisito la risonanza dell'acqua a diversi offset di irradiazione, l'esperimento viene ripetuto a diversi poteri di irradiazione. Questo fornirà un dataset del segnale relativo dell'acqua in funzione sia dello spostamento di irraggiamento sia della potenza di irraggiamento (E). I dati vengono poi adattati da un risolutore di programmazione non lineare. Il fitting e i parametri risultanti sono illustrati per il campione bifasico di RNA 31xCAG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Presentazione dei risultati MT di REDIFINE e CONDENSE. (A) Rappresentazione del diagramma ragno dei parametri REDIFINE per analisi comparativa tra campioni o condizioni. (B) Modello schematico che illustra parametri derivati da REDIFINE, inclusi coefficienti di diffusione, raggio delle gocce, partizionamento e tasso di scambio interfase. (C) Confronto tra profili CONDENSE-MT acquisiti per riferimento di agarosio e FUS NTD bifasico nell'agarosio a 500 Hz di irradiazione.
(D) Analisi CONDENSE-MT di condensati RNA a espansione ripetuta di 31xCAG che mostra l'estrazione dei parametri e la visualizzazione degli effetti di trasferimento di magnetizzazione associati al condensato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: configurazione REDIFINE. (A) Il dominio FUS N-terminale rimane osservabile durante la preparazione del campione condensato biphasico. Si osserva un forte segnale di amide/amminosangue e protoni aromatici. (B) Il decadimento del segnale osservato nell'esperimento di diffusione DOSY illustra un decadimento più rapido della popolazione proteica in fase diluita e un decadimento più lento della proteina nella fase condensata. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Elaborazione REDIFINE. (A) Codice Matlab usato per l'adattamento REDIFINE, con parametri evidenziati dove è necessario l'input specifico. L'inserimento illustra come si sceglie l'area di integrazione. (B) Minimizzazione della funzione di adattamento e dei risultati conseguenti. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: configurazione CONDENSE-MT. (A) Panoramica degli esperimenti NMR necessari per l'analisi CONDENSE-MT, inclusi l'esperimento di recupero per inversione dell'acqua (expno. 5) e gli esperimenti CONDENSE-MT a diversi poteri di irradiazione (expno 11-18). (B), (C) Panoramica dello script Matlab per la lettura e integrazione degli spettri 1D dell'acqua per i dataset CONDENSE-MT. Gli esperimenti CONDENSE-MT sono indicati come main – main8. I confini di integrazione vengono inseriti come water_left e water_right. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Elaborazione CONDENSE-MT. (A) Prima sezione dello script di raccordo CONDENSE-MT, che include il raccordo di recupero per inversione dell'acqua (sezione 1) e l'input dei parametri di fondo di agarosio precedentemente determinati. (B) Adattamento e determinazione dell'incertezza dei parametri dei dataset CONDENSE-MT. I parametri iniziali per l'adattamento possono essere impostati all'interno del fit0. (C) Tracciare la sezione del risultato dell'adattamento CONDENSE-MT. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare: script MATLAB per analisi REDIFINE e CONDENSE-MT. Bruker Topspin code per impostare l'esperimento CONDENSE-MT e gli script MATLAB utilizzati per elaborare e adattare dataset di diffusione REDIFINE e dataset di magnetizzazione-trasferimento CONDENSE-MT, inclusa integrazione dati, analisi di rilassamento e routine globali di adattamento dei modelli. MATLAB è obbligato per eseguire gli script. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Qui abbiamo presentato protocolli dettagliati per la caratterizzazione NMR senza etichettatura dei condensati biomolecolari bifasici. Queste includono le due metodologie emergenti, LLPS REDIFINE e un esperimento complementare, ma ortogonale, chiamato CONDENSE-MT. Sebbene generalmente applicabile, LLPS REDIFINE si basa sulla rilevazione biomolecolare e richiede un segnale osservabile al momento della separazione delle fasi per un'analisi corretta. Sebbene ciò possa limitare l'applicabilità della REDIFINE, la maggior parte dei condensati contiene proteine con regioni intrinsecamente disordinate che sono solitamente osservabili tramite NMR. In particolare, per proteine:RNA e condensati solo di RNA, il segnale delle biomolecole nella fase condensata si amplia oltre i limiti di rilevamento alla separazione di fase. Se il coefficiente di partizione nella fase condensata è alto, quasi nessun segnale viene osservato tramite NMR convenzionale. CONDENSE-MT aggira questa limitazione di rilevamento essendo una tecnica osservata in acqua che si basa su una significativa differenza di rilassamento tra specie molecolari nelle fasi diluite e condensate.

Una corretta preparazione del campione è fondamentale per l'applicazione efficace sia di REDIFINE che di CONDENSE-MT. È quindi importante assicurarsi che l'agarosio sia completamente fuso prima di trasferirlo alla miscela, per evitare la formazione estesa di bolle d'aria durante il trasferimento e fornire materiale sufficiente per riempire in modo affidabile un tubo NMR con miscele bifasiche che tendono inizialmente ad aderire alla parete di vetro. Per CONDENSE-MT, è fondamentale trasferire riproducibilmente un dato volume di agarosio, poiché il fondo di agarosio sarà quantificato separatamente. Se la partizione delle biomolecole tra fasi condensate e diluite è fortemente sbilanciata, o se lo scambio tra fasi è molto lento o veloce, gli effetti REDIFINE o CONDENSE-MT potrebbero essere assenti o troppo deboli per una quantificazione affidabile. Questo può rappresentare una limitazione chiave di queste tecniche. In tal caso, tuttavia, aumentare o diminuire la temperatura può essere utile, poiché la temperatura è un potente modulatore della partizione molecolare e dei tassi di scambio chimico. Una volta acquisiti i dataset, i risultati ottimali dell'adattamento vengono spesso ottenuti iterativamente ripetendo l'ottimizzazione computazionale usando i parametri di miglior adattamento dell'adattamento iniziale o precedente come valori di input.

Per sistemi che producono forti effetti REDIFINE e CONDENSE-MT, questi esperimenti possono fornire informazioni senza etichettatura sulla partizione molecolare, sui tassi di scambio e sulla dinamica molecolare, difficili da ottenere con altri metodi senza marcatore. Inoltre, i metodi basati su NMR sono generalmente non invasivi, permettendo di analizzare i campioni più volte o di conservarli per lunghi periodi, consentendo il monitoraggio delle proprietà del condensato nel tempo. Questo è particolarmente interessante nel contesto della maturazione patologica del condensato della fibrilizzazione, che è difficile da studiare con metodi complementari su lunghi periodi di tempo.

Dato che gli organelli cellulari senza membrana sono generalmente assemblaggi multicomponente con architettura complessa, le future applicazioni di questa tecnica includeranno la rilevazione e la caratterizzazione di sistemi modello di condensati multicomponente sempre più sofisticati, oltre ad analisi del condensato in un contesto cellulare tramite NMR in cellula. Questo, tuttavia, richiede l'adattamento di REDIFINE o CONDENSE-MT a sistemi così complessi, e sono in corso sforzi per raggiungere questo obiettivo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Spettrometro NMR Avance NEO a 700 MHz	Bruker Biospin	https://www.bruker.com/en.html	I dati vengono acquisiti con uno spettrometro NMR a 700 MHz.
Topspin	Bruekr Biospin	https://www.bruker.com/en.html	I dati vengono elaborati tramite questo software.
Proteina FUS NTD		N/A	Questa proteina viene espressa e purificata nel nostro laboratorio
RNA 31xCAG		N/A	L'RNA viene prodotto e purificato nel nostro laboratorio
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	I dati vengono elaborati e visualizzati utilizzando questo software.