Ingegneria del modello murino preclinico ad alta fedeltà per metastasi cerebrale utilizzando la tecnica di iniezione pulsatile interlock e la riparazione vascolare microchirurgica

Sommario

Questo studio stabilisce modelli murini ad alta fedeltà di metastasi cerebrale tramite iniezione intracarotide transitoria di cellule tumorali tramite iniezione pulsatile Interlock e riparazione microchirurgica. Preserva il flusso sanguigno cerebrale, previene l'occlusione dell'arteria carotide comune e fornisce modelli preclinici superiori con tassi di metastasi tumorale migliorata e mortalità ridotta.

Abstract

La metastasi cerebrale rimane un problema clinico devastante. Una delle principali sfide nella ricerca sulle metastasi cerebrali è la mancanza di modelli di alta qualità che ricapitulino accuratamente il processo metastatico, permettendo così intuizioni meccanicistiche su come le cellule tumorali colonizzano nel cervello. I modelli tradizionali di iniezione intracarotidea di metastasi cerebrale spesso richiedono una legatura permanente dell'arteria carotide comune (CCA), che altera l'emodinamica cerebrale e compromette l'integrità della barriera emato-encefalica (BBB). Il protocollo presenta un metodo raffinato per stabilire un modello murino ad alta fedeltà della metastasi cerebrale. L'innovazione principale riguarda la tecnica di Iniezione Pulsatile Interlock (IPI) per la somministrazione delle cellule tumorali, seguita da una ricostruzione arteriosa microchirurgica nel sito della puntura per ripristinare il flusso fisiologico sanguigno nella CCA. Rispetto al modello convenzionale di legatura CCA, l'approccio IPI–riparazione microchirurgica ha ridotto significativamente la mortalità perioperatoria (2,86% contro 25,71%) e aumentato il tasso di stabilimento di metastasi cerebrali (94,12% contro 65,38%). La tecnica IPI utilizza una configurazione a siringhe tandem per minimizzare il rigurgito cellulare durante l'iniezione intracarotide. Dopo l'infusione delle cellule tumorali, la CCA viene riparata meticolosamente utilizzando suture microchirurgiche sotto stereomicroscopio, evitando così un'occlusione permanente. Questo preserva l'emodinamica cerebrale nativa e l'integrità della BBB al momento dell'ingresso delle cellule tumorali, migliorando significativamente i tassi di successo chirurgico e riducendo la mortalità. Le lesioni intracraniche metastatiche sono validate tramite bioluminescenza seriale e istopatologia. Il metodo fornisce una piattaforma superiore per lo studio della fisiopatologia delle metastasi cerebrali e per la valutazione terapeutica preclinica, ricapitolando così il processo metastatico.

Introduzione

Le metastasi cerebrali rappresentano il tipo più comune di tumore cerebrale maligno negli adulti, verificandosi circa dieci volte più frequentemente dei tumori cerebrali^{primari 1}. Si stima che il 10%–20% dei pazienti con cancro sistemico svilupperà metastasi cerebrali durante le fasi avanzate della malattia, che rappresenta una delle principali cause di^{mortalità 1,2}. Nonostante i notevoli progressi nel trattamento dei tumori primari, la prognosi per i pazienti con metastasi cerebrali rimane negativa. Il tasso di sopravvivenza annuale dei pazienti con metastasi cerebrale è inferiore al 20%³. Il meccanismo del perché e del come alcuni tumori metastatizzano nel cervello rimane sconosciuto. La sfida terapeutica è aggravata dalla biologia unica delle metastasi cerebrali, inclusa la presenza della BBB, il microambiente immunitario cerebrale distinto e le complesse interazioni delle cellule tumorali con le cellule^{neurogliali 4,5}.

Sia la ricerca farmacodinamica che quella patogenesi sulla metastasi cerebrale si basano fortemente su modelli animali preclinici precisi che riproducono accuratamente il processo patologico umano. I modelli animali attuali di metastasi cerebrale, sebbene ampiamente utilizzati, si basano principalmente su impianto ortotopico intracranico, iniezione endovenosa o nella vena caudale, iniezione intracardiaca o iniezione intracarotide 6,7,8,9,10. Tuttavia, questi modelli rispecchiano in modo imperfetto la progressione della malattia umana, spesso fallendo nel cogliere passaggi chiave come l'estravasazione delle cellule tumorali su un BBB intatto in condizioni di flusso^{fisiologico 11}. Le iniezioni endovenose e intracardiache portano a una bassa efficienza nella formazione tumorale specifica del cervello e spesso portano a diffuse metastasi extracraniche, causando morte prematura degli animali prima dello sviluppo di metastasi cerebrali^{sostanziali 12}. Il metodo tradizionale di iniezione dell'arteria intracarotide aumenta i tassi di formazione di tumori intracranici ma richiede la legatura permanente della CCA. Alterando l'emodinamica cerebrale, questa legatura può indurre ischemia nelle regioni cerebrali ipsilaterali e compromettere i flussi sanguigni fisiologici necessari per la consegna delle cellule tumorali, influenzando così la loro distribuzione spaziale e la nicchia di colonizzazione all'interno del^{cervello 13,14}.

Modelli animali di alta qualità che possono imitare più fedelmente la fisiopatologia della metastasi cerebrale sono^{fondamentali 15}. Un modello ideale di metastasi cerebrale dovrebbe ricapitolare l'intera cascata metastatica, includendo l'orientamento delle cellule tumorali verso la vascolatura cerebrale, l'estravasazione attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) e le interazioni dinamiche con il microambiente^{cerebrale 16}. L'alta fedeltà al modello è fondamentale sia per gli studi meccanicistici che per la valutazione^{terapeutica 6}. Tuttavia, i modelli esistenti di iniezione intracarotide non riproducono completamente condizioni fisiologiche chiave, in particolare la conservazione del flusso sanguigno cerebrale normale e la distribuzione naturale delle cellule tumorali circolanti.

Per superare i limiti dei modelli preclinici esistenti di metastasi cerebrale, è stato sviluppato un modello animale ad alta fedeltà che riproduce più accuratamente la cascata metastatica basato sulla tecnica IPI e sulla riparazione microchirurgica delle arterie. Questo metodo prevede un'occlusione arteriosa transitoria dopo l'iniezione di cellule tumorali, seguita da una riparazione meticolosa del sito di puntura arteriosa per ripristinare il flusso fisiologico sanguigno alla CCA ipsilaterale. Questo approccio non solo migliora la coerenza e i tassi di successo del modello, ma anche, cosa fondamentale, preserva la BBB mantenendo l'emodinamica cerebrale nativa. Minimizzando la perturbazione del flusso sanguigno cerebrale, il modello modificato di iniezione intracarotide fornisce una piattaforma ad alta fedeltà che riproduce con maggiore precisione il processo naturale di colonizzazione metastatica cerebrale, offrendo così uno strumento migliorato per indagare i meccanismi della metastasi cerebrale e valutare potenziali terapie.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Istituto di Biofisica dell'Accademia Cinese delle Scienze (numero di approvazione: SYXK2021124). Gli animali che raggiungevano obiettivi predefiniti venivano eutanasiati in conformità con le Linee Guida per l'Eutanasia degli Animali del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Istituto di Biofisica dell'Accademia Cinese delle Scienze e le Linee Guida AVMA per l'Eutanasia degli Animali (2020⁾¹⁷.

1. Preparazione della sospensione a singola

1. Coltivare le cellule B16F10 e 4T1 in mezzo RPMI-1640 completo integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina.
2. Mantieni le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂.
3. Confermare l'espressione della luciferasi e verificare l'assenza di contaminazione da micoplasmi un giorno prima delle procedure chirurgiche.
4. Il giorno dell'intervento, prelevare le cellule quando raggiungono l'80% di confluenza lavando prima con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) prima della tripsinizzazione (0,25%) per meno di 3 minuti a 37 °C.
5. Aggiungere un substrato RPMI-1640 contenente FBS al 10% nelle celle per estinguere lo 0,25% di tripsina.
6. Centrifuga le celle a 300 × g per 3 minuti. Lavare due volte le cellule in PBS per rimuovere il siero residuo, poi contarle con un emocitometro.
7. Utilizzare il test di esclusione Trypan blue per confermare che la vitalità cellulare rimanga al 90%–95% durante l'iniezione.
8. Risospendere le cellule in PBS a 2 × 10⁶ cellule/mL. Tieni le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione.
   NOTA: Possono essere utilizzate cellule B16F10 e 4T1 marcate con luciferasi. B16F10 è presentato come esempio rappresentativo.

2. Preparazione dei topi e preparazione perioperatoria

1. Usa maschi C57BL/6 maschi di 7–8 settimane.
2. Posiziona un cuscinetto riscaldante sotto la placca chirurgica per prevenire l'ipotermia. Accendi la borsa termica 30 minuti prima dell'intervento.
3. Sterilizza tutti gli strumenti chirurgici, la piastra chirurgica e la gabbia con un autoclave. Disinfetta lo stereomicroscopio e il tavolo chirurgico con etanolo al 75%.
4. Altri articoli che non possono essere sterilizzati tramite autoclaving dovrebbero essere disinfettati con irradiazione UV e etanolo al 75% (Figura 1A).
5. Pesa il topo prima dell'anestetizzazione e registra il peso preoperatorio come base.
6. Aggiungi 10 g di tribromoetanolo in un tubo centrifuga, poi aggiungi 10 mL di alcol amilico terziario. Scuoti il tubo finché il tribromoetanolo non si dissolve completamente.
   NOTA: Il tribromoetanolo può causare effetti avversi, inclusa la mortalità; Monitorare attentamente la profondità dell'anestetico.
7. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm per preparare una soluzione 100% stock.
8. Diluire la soluzione al 100% stock con soluzione salina o diluente di NaCl allo 0,9% in una soluzione operativa al 2,5% (diluizione 1:40). L'efficacia di ogni soluzione di lavoro appena preparata deve essere testata per l'anestesia nei topi.
9. Anestetizzare i topi con iniezione intraperitoneale (i.p.) di tribromoetanolo al 2,5% a 0,2 mL/10 g di peso corporeo. Quando necessario, prolungare l'anestesia somministrando una dose di integrazione a un terzo del volume anestetico originale (Figura 1B).
   NOTA: Regolare il dosaggio dell'anestetico in base al peso corporeo e monitorare continuamente la respirazione.
10. Assicurati che il topo sia completamente anestetizzato applicando uno stimolo lieve (ad esempio, pizzicatura del dito del piede) e osservando nessuna risposta motoria.
11. Rasi il pelo nella zona del collo e crea un segno di taglio delle dita dopo l'anestesia.
12. Applica la pomata per gli occhi per proteggere la secchezza.
13. Posiziona il topo su una piastra chirurgica e fissa i 4 arti e gli incisivi superiori con del nastro adesivo (Figura 1C).
14. Monitorare la profondità dell'anestesia valutando la frequenza respiratoria e il riflesso di pizzicamento per assicurarsi che i topi rimangano indolori e immobili durante la procedura.
15. Gli animali vengono assegnati casualmente ai gruppi sperimentali e l'analisi di imaging è stata effettuata da ricercatori accecati all'assegnazione dei gruppi.

3. Procedure chirurgiche standard della tecnica IPI e riparazione microchirurgica

1. Disinfettare la regione del collo con una soluzione di povidone-iodio e lasciare asciugare completamente la pelle prima di procedere (Figura 1D).
2. Drapea il topo in modo asettico usando un drappo chirurgico sterile, esponendo solo la regione del collo (Figura 1E).
3. Eseguire un'incisione cervicale mediana di circa 0,8–1 cm di lunghezza utilizzando forbici chirurgiche sterili, con pinze fini per la ritrazione dei tessuti (Figura 2A).
4. Eseguire una dissezione smussata della fascia superficiale e dei muscoli sottostanti utilizzando pinze ad angoli fini per esporre la guaina carotide destra (Figura 2B1, Figura 2C1).
5. Isolare l'arteria carotide esterna destra (ECA) dalla guaina carotide e legare l'ECA destra per prevenire la perdita cellulare nei rami extracranici (Figura 2B2, Figura 2C2).
6. Isolare con cura la CCA destra all'interno della guaina carotidee, preservando il nervo vago situato lateralmente e sotto il vaso (Figura 2C1).
7. Metti un piccolo pezzo di guanto di gomma e un batuffolo di cotone inumidito con soluzione salina sotto il CCA destro isolato come cuscino per sollevare e stabilizzare il vaso.
   NOTA: Sollevare il CCA stabilizza il vaso e facilita una puntura e un'iniezione accurate. (Figura 2B4, Figura 2C4).
8. Posiziona due nodi non serrati con anelli aperti sul CCA distale e prossimale al batuffolo di cotone, poi lega il nodo prossimale (Figura 2B3, Figura 2C3).
9. Applicare una clip microvascolare sulla CCA vicino al nodo distale non stretto per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno della CCA (Figura 2B4, Figura 2C4).
10. Impianto di cellule tumorali
    1. Foratura interblocco
       1. Perfora il segmento rialzato del CCA destro usando un ago da 32G con la smussatura rivolta verso l'alto.
       2. Ritira la siringa iniziale mantenendo il sito della puntura.
       3. Miscela vortice la sospensione delle cellule tumorali e preleva 100 μL nella siringa di microlitri, assicurandosi che non vengano aspirate bolle d'aria.
       4. Inserire la punta dell'ago della siringa a microlitri nel sito di puntura creato nello Passo 3.10.1.1 e tenerla stabile senza iniziare l'iniezione per garantire una posizione stabile prima della consegna cellulare (Figura 2B, Figura 2C5, Figura Supplementare 1).
          NOTA: Utilizzare una siringa da 32G per la puntura e una siringa da microlitri per l'iniezione per garantire una posizione stabile e una consegna controllata. La Figura Supplementare 1 mostra i parametri delle due siringhe. Il diametro esterno della siringa da 32G è di 0,22 mm, mentre l'ago della siringa in microlitri è di 0,26 mm, facilitando l'inserimento sicuro e l'iniezione controllata.
    2. Iniezione pulsatile (Figura 2C5)
       1. Rimuovi la clip microvascolare applicata nello Passo 3.9.
       2. Iniziare l'iniezione della sospensione delle cellule tumorali nell'ICA tramite la siringa da microlitri.
       3. Somministrare la sospensione con un movimento di iniezione pulsatile, avanzando delicatamente lo stantuffo della siringa con piccoli impulsi invece che con pressione continua.
       4. Somministrare la sospensione utilizzando uno dei seguenti criteri: il criterio del ciclo cardiaco, iniettare ~1 μL di sospensione cellulare ogni 8 cicli cardiaci guidati dal flusso sanguigno pulsatile retrogrado all'arteria carotide interna distale; oppure il criterio della velocità di iniezione, iniettando ~1 μL/s assicurandosi che la velocità non superi i 60 μL/min.
       5. Monitora il vaso durante l'iniezione. La consegna riuscita è indicata quando il vaso rosso diventa temporaneamente trasparente mentre la sospensione attraversa il lume, senza alcuna estravasazione visibile attorno al sito della perforazione.
       6. Dopo aver completato l'iniezione, estrarre con attenzione la siringa del microlitro.
       7. Stringere immediatamente il nodo distale in modo controllato per sigillare il vaso e minimizzare la rigurgitazione (Figura 2B6, Figura 2C6).
          NOTA: L'iniezione pulsatile riduce la sovraperfusione e minimizza il rischio di aumento della pressione intracranica.
11. Riparazione microchirurgica (Figura 2B6, Figura 2C6)
    1. Utilizzare una sutura microchirurgica in nylon 10-0 per chiudere il sito della puntura in modo ermetico, posizionando i punti di ingresso e uscita dell'ago immediatamente adiacenti al margine del difetto per minimizzare le perdite vascolari e preservare la permeabilità luminale.
    2. Fai passare l'ago per la sutura microchirurgica attraverso il foro di puntura nella parete del vaso sotto un alto ingrandimento e lascia temporaneamente la sutura non legata.
    3. Risciacqua il campo chirurgico con soluzione salina eparinizzata.
    4. Fissa la sutura con due o tre nodi quadrati.
    5. Taglia le estremità libere della sutura a circa 1–2 mm per evitare allentamenti e ridurre al minimo il carico di corpo estraneo.
       NOTA: Le procedure chirurgiche standard della tecnica IPI e la riparazione microchirurgica sono descritte nel Video Supplementare 1.

4. Ripristino del flusso sanguigno della CCA

1. Allenta gradualmente il nodo prossimale.
2. Risciacquo il lumen per rimuovere eventuali coaguli microscopici. Metti un batuffolo di cotone asciutto nel campo operatorio per monitorare l'evasiva emorragia.
3. Una volta confermata l'assenza di versamento attivo dal sito della puntura, si allenta cautamente il nodo distale per ripristinare il flusso sanguigno carotide (Figura 2B7, Figura 2C7).

5. Confermare la riparazione riuscita

1. Ripristino della pulsazione
   1. Osserva la CCA per pulsazioni robuste, che indicano una reperfusione riuscita e ricordata.
2. Verifica la permeabilità e l'integrità della nave
   1. Ispezionare il sito di riparazione per assicurarsi che sia privo di stenosi e che il lumen rimanga permeabile e continuo con il segmento prossimale del vaso.

6. Irrigazione e chiusura delle ferite

1. Irrigare accuratamente il campo chirurgico con soluzione salina normale non eparinizzata per rimuovere detriti e coaguli di sangue.
2. Chiudi l'incisione cutanea usando una sutura continua.
   NOTA: Mantieni il campo chirurgico umido ed esegui tutte le manipolazioni con delicatezza per minimizzare le lesioni tissutali.

7. Cure post-operatorie

1. Supporto di liquidi: somministrare da 0,5 a 1 mL di soluzione salina sterile calda subito dopo l'intervento chirurgico per compensare la perdita di liquido perioperatoria.
2. Profilassi infezionistica: Se la durata operativa supera i 40 minuti, somministrare enrofloxacina (5 mg/kg, una volta al giorno) per 3 giorni consecutivi. Non sono necessari antibiotici se la procedura dura meno di 40 minuti.
3. Nutrizione e idratazione: Fornire idrogel o cibo ammorbidito per almeno una settimana dopo l'intervento per garantire un'adeguata idratazione e nutrizione.
4. Monitoraggio quotidiano: Effettuare valutazioni di salute giornaliere, osservare comportamenti circolari, deficit neurologici, infezioni della ferita e perdita di peso.
5. Percorso postoperatorio atteso: Durante le prime 48 ore, i topi possono mostrare una minore attività, lieve piloerezione e perdita di peso fino al 15% del periodo preoperatorio di base, seguito da un recupero graduale.
6. Analgesia: somministrare meloxicam (5 mg/kg, sottocutaneo) una volta al giorno per 2–3 giorni per alleviare il dolore e favorire il recupero.

8. Criteri di valutazione per l'istituzione di modelli animali di successo

1. Monitoraggio del peso corporeo
   1. Pesa i topi ogni giorno e registra il peso corporeo.
2. Valutazione clinica
   1. Valuta quotidianamente i segni clinici, inclusi la postura e il comportamento circolare del genere.
3. Imaging bioluminescenza
   1. Accendi gli interruttori di alimentazione dello strumento di imaging e del computer.
   2. Avvia il software di analisi per immagini bioluminescenze (Versione 4.7.2) e clicca su "Inizializza" per iniziare il sistema di imaging bioluminescenze.
   3. Durante l'inizializzazione, la spia di stato della temperatura sul pannello di controllo del sistema di imaging apparirà rossa. Esegui l'imaging solo dopo che la spia di stato della temperatura diventa verde.
   4. Trattenere cibo e acqua dai topi per 6 ore prima dell'imaging per evitare l'aspirazione durante l'anestesia.
   5. Preparare il substrato di imaging a una concentrazione di 10 mg/mL, protetto dalla luce per tutta la procedura. Calcola il volume di iniezione a 10 μL/g di peso corporeo.
   6. Trattieni il topo per le immagini. Pulire il sito di iniezione nella parte bassa sinistra dell'addome con il 75% di alcol medico.
   7. Usa un cotton fioc per stimolare delicatamente la parete addominale nel punto di iniezione e ridurre al minimo il rischio che l'ago entri nell'intestino.
   8. Dopo aver perforato la parete addominale, aspirare delicatamente per confermare l'assenza di sangue, poi iniettare lentamente il substrato per immagini in vivo .
   9. A 4 minuti e 30 secondi dall'iniezione del substrato, trasferire il topo in una camera di induzione anestesia.
   10. Indurre l'anestesia usando isoflurano al 3%. Una volta che i riflessi di raddrizzamento e di pizzicamento sono persi, ridurre la concentrazione di isoflurano al 2% per il mantenimento.
   11. Posiziona il topo anestetizzato nella camera di imaging, assicurandoti che il cono nasale copra completamente bocca e naso. Chiudi saldamente la porta della camera di immagini.
   12. Nel pannello di controllo del sistema di immagini, seleziona "Luminescente" come modalità di immagigine. Imposta manualmente il tempo di esposizione a 60 secondi. Seleziona "Fotografia", "Sovrapposizione" e "Griglia di allineamento".
   13. Imposta il campo visivo su D per l'imaging di tre topi. Regola l'altezza di imaging a 1,5 cm. Seleziona "Blocco" per il filtro di eccitazione e "Apri" per il filtro di emissione.
   14. A 10 minuti dall'iniezione del substrato, clicca su "Acquisi" per catturare l'immagine.
   15. Dopo l'acquisizione dell'immagine, naviga nella Palette degli Strumenti e seleziona "ROI Tools". Usa lo strumento "Cerchio" per delimitare la regione di interesse (ROI), poi clicca su "Misura ROI" per ottenere dati quantitativi.
4. Analisi istologica
   1. Prelevano i tessuti cerebrali al punto finale sperimentale e li sottopongo ad analisi istologica.
   2. Identificare e confermare le lesioni metastatiche tramite colorazione di ematossilina ed eosina (H&E).

9. Obiettivi umani

1. Per garantire il benessere animale e la conformità agli standard etici, sono stati stabiliti parametri umani predefiniti come criteri per l'eutanasia immediata.
2. I topi vengono eutanasiati tramite inalazione di anidride carbonica (CO₂), seguita da una lussazione cervicale come metodo fisico secondario per confermare la morte.
3. L'eutanasia immediata dovrebbe essere eseguita se si verificano una delle seguenti condizioni.
   1. Deficit neurologici
      1. Disfunzione motoria: attassia (camminatura instabile, oscillazioni), giri circolari, paralisi, emisparesi o tremori.
      2. Alterazioni comportamentali o di coscienza: letargia, torpore o coma.
      3. Segni di aumento della pressione intracranica: postura anomala (ad esempio, schiena curva che indica disagio) o inclinazione della testa.
      4. Crisi: convulsioni generalizzate o focali.
   2. Cambiamenti nel peso corporeo e nella funzione fisiologica
      1. Perdita di peso corporea superiore al 20% o incapacità di mangiare o bere in modo indipendente a causa di carico tumorale o grave debolezza.
      2. Disnea (ansimare o ansimare) o incontinenza urinaria/fecale.
   3. Stato tumorale
      1. Interrompere immediatamente l'esperimento se si rileva ulcerazione, infezione o necrosi associata al tumore.
   4. Carico tumorale massimo tollerato
      1. I topi sono sottoposti a immagini bioluminescenze due volte a settimana.
      2. Una volta che il segnale del tumore intracranico entra in una fase di crescita esponenziale (ad esempio, raddoppiando tra due sedute di imaging consecutive), il monitoraggio neurologico viene aumentato a due volte al giorno.
      3. L'eutanasia è avvenuta immediatamente all'insorgenza di atassia o crisi, indipendentemente dal valore del segnale di bioluminescenza.

Risultati

Imaging bioluminescente e analisi quantitativa
Seguendo il protocollo chirurgico standardizzato, il modello murino ottimizzato per la metastasi cerebrale ha dimostrato segnali bioluminescenti intracranici stabili su immagini seriali in vivo postoperatorie. L'imaging bioluminescente in vivo continuo (Figura 3A) e l'analisi quantitativa (Figura 3B) per 4 settimane dopo l'inoculazione intracaro...

Discussione

Modelli preclinici robusti che riproducono accuratamente le metastasi cerebrali sono essenziali per chiarire i meccanismi fisiopatologici e valutare l'efficacia terapeutica. Il modello tradizionale di iniezione intracarotide richiede la legatura dell'arteria carotidea comune (CCA), che altera il flusso sanguigno cerebrale in modo non fisiologico, potenzialmente inducendo lesioni ischemiche ipsilaterali e disturbando la barriera emato-encefalica (BBB⁾

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10-0 microsurgical suture with needle	Lingqiao	2650798	Microsurgical suture per la riparazione del sito di puntura dell'arteria carotide comune
100 µL microliter syringe	Bolige Tools	100UL	Seringa microlitro per l'erogazione di cellule tumorali durante l'iniezione pulsatile di interblocco
100 µL pipette	Eppendorf	3123-000250	Pipetta per l'irrigazione salina del campo chirurgico
32G 1 mL insulin syringe	Kindly	YY0497	Seringa insulinica utilizzata per creare il sito di puntura arteriosa iniziale
4-0 silk suture	Ethicon	W501	Materiale di sutura per la chiusura dell'incisione cutanea
4T1 breast cancer cell line	Ottenuto dal Laboratorio Shengdian Wang, Istituto di Biofisica, Accademia Cinese delle Scienze	CRL-2539	Linea cellulare tumorale utilizzata per la modellazione della metastasi cerebrale intracarotidea
75% Ethanol	Annjet	Q/371402AAJ008	Disinfettante per la pulizia del sito di iniezione
7–8-week-old male C57BL/6J mice	Charles River Laboratories	1.10011E+17	Animali sperimentali utilizzati per il modello di metastasi cerebrale B16F10
8-week-old female BALB/c mice	Charles River Laboratories	1.10011E+17	Animali sperimentali utilizzati per il modello di metastasi cerebrale 4T1
Angled-tip forceps	Kewo Tools	—	Pinzette microchirurgiche per dissezione dei tessuti e manipolazione dei vasi
B16F10 melanoma cell line	Ottenuto dal Laboratorio Shengdian Wang, Istituto di Biofisica, Accademia Cinese delle Scienze	CRL-6475	Linea cellulare melanoma utilizzata per la modellazione della metastasi cerebrale intracarotidea
Bioluminescence imaging analysis software	Living Image (version 4.7.2)	—	Software per l'analisi dei dati di imaging bioluminescente
DMEM	Xigong Bio Tech	M1805	Medium di coltura cellulare per il mantenimento delle cellule tumorali
Enrofloxacin (antibiotic)	MCE	HY-B0502	Antibiotico utilizzato per la profilassi delle infezioni postoperatorie
Eosin Y solution	Beyotime	E301879	Reagente di colorazione istologica per la colorazione con eosina
Eye ointment	Baiyunshan	H44023089	Unguento oftalmico per la protezione degli occhi durante l'anestesia
Fetal bovine serum (FBS)	Pan Sera Tech	ST30-3302	Supplemento sierico per il medium di coltura cellulare
GraphPad Prism	Versione 4.7.2	—	Software di analisi statistica per curve di sopravvivenza e analisi dei dati quantitativi
Hematoxylin solution	Beyotime	C0105S	Reagente di colorazione istologica per la colorazione con ematossilina
Isoflurane	H.F.Q. Biotechnology	101357015	Anestetico inalatorio utilizzato durante le procedure di imaging
IVIS Spectrum in vivo imaging system	Lumina Series III	—	Sistema di imaging per l'imaging bioluminescente in vivo
Meloxicam (analgesic)	Qilu Animal Health	150252467	Farmaco antinfiammatorio non steroideo utilizzato per l'analgesia postoperatoria
Microsurgical scissors	Kewo Tools	—	Forbici microchirurgiche per la dissezione dei tessuti
Mini vessel clip	Zheyong Tools	200521	Clip microvascolare per l'occlusione temporanea dell'arteria carotide comune
Needle holder	Jiangxin Tools	1420 20Cr13	Strumento chirurgico per la manipolazione delle suture microchirurgiche
Paraformaldehyde (4%)	Zhongsheng Wanda Tech	20240411	Fissativo per la conservazione del tessuto cerebrale prima dell'analisi istologica
Penicillin	Gibco	1758-9324	Antibiotico per la coltura cellulare
Povidone-iodine solution	Sihuanpai	Q/PGSHW0009	Soluzione antisettica per la disinfezione della pelle chirurgica
RPMI-1640 medium	Xigong Bio Tech	12-115F	Medium di coltura cellulare per la crescita delle cellule tumorali
Scilogex mixers	Scilogex	MX-S	Mixer vortex per l'omogeneizzazione delle sospensioni di cellule tumorali
Steam indicator tape	3M-Comply	1322-24MM	Nastro indicatore di sterilizzazione per strumenti chirurgici autoclavizzati
Stereomicroscope	Olympus	SZ61	Microscopio utilizzato per la visualizzazione durante le procedure microchirurgiche
Zeiss Stemi 508 stereomicroscope	Zeiss	Stemi 508	Stereomicroscopio utilizzato per la visualizzazione chirurgica ad alta magnificazione
Sterile saline (0.9%)	Kelun	25M14D07	Soluzione salina sterile utilizzata per mantenere l'umidità del campo chirurgico
Streptomycin	Gibco	1758-9319	Antibiotico per la coltura cellulare
Surgical drape	Dafang	001-2016	Drappo sterile utilizzato per isolare il campo chirurgico
Surgical gloves	Ansell Medi-grip	210-64005	Guanti sterili utilizzati durante le procedure chirurgiche
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	MKBH0634V	Anestetico iniettabile per procedure chirurgiche
Ultrasound Doppler	Mindray S7 SCI	—	Sistema ad ultrasuoni ad alta risoluzione per la valutazione del flusso sanguigno dell'arteria carotide