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Articolo metodologico

Citologia broncoscopica e sequenziamento metagenomico per differenziare lesioni polmonari correlate al trattamento del cancro e quelle infettive

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DOI:

10.3791/70725

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26 maggio 2026

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1Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases, The First Hospital of Jilin University, 2Pulmonary and Critical Care Medicine Department, First Hospital of Jilin University, 3Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jilin University

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per valutare il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) attraverso la raccolta integrata guidata da broncoscopia, l'analisi citologica e il sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS). Questo flusso di lavoro completo distingue con precisione le lesioni polmonari correlate al trattamento del cancro dalle infezioni polmonari, facilitando decisioni cliniche precise e tempestive.

Abstract

I pazienti con lesione polmonare correlata al trattamento del cancro (CTLI) si presentano frequentemente sintomi respiratori aspecifici e cambiamenti radiologici che imitano da vicino la polmonite infettiva o la progressione tumorale, rappresentando una sfida significativa per una diagnosi definitiva. I processi diagnostici tradizionali, valutati principalmente tramite biomarcatori del sangue e colture microbiche standard, di solito non possono fornire una diagnosi chiara e richiedono troppo tempo. Qui presentiamo un protocollo completo per diagnosticare la CTLI combinando l'analisi citologica del liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) con il sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS). Il flusso di lavoro procedurale è composto da tre fasi principali. Innanzitutto, viene eseguita una broncoscopia standardizzata per ottenere campioni di BALF di alta qualità. In secondo luogo, l'analisi citologica dei campioni BALF ottenuti fornisce un'istantanea del microambiente polmonare. Questo permette l'identificazione delle caratteristiche infiammatorie e lo screening delle cellule maligne per escludere la progressione tumorale. Infine, la mNGS viene utilizzata per identificare o escludere eziologie infettive attive. Questa tecnica genomica avanzata consente una rilevazione rapida, altamente sensibile e imparziale dei patogeni, superando con successo i limiti delle colture tradizionali. I risultati rappresentativi con questo metodo dimostrano che questo approccio può distinguere efficacemente la polmonite immunologica dalle infezioni polmonari attive o dalla progressione tumorale. Rispetto ai metodi diagnostici tradizionali, questo protocollo ha il vantaggio di distinguere rapidamente e con precisione la CTLI dalle eziologie infettive e dalle neoplasie occulte. In definitiva, questo flusso di lavoro standardizzato chiarisce le diagnosi cliniche, guida decisioni terapeutiche critiche e migliora i risultati per i pazienti.

Introduzione

I progressi nei trattamenti antitumorali, come gli inibitori dei checkpoint immunitari e le terapie mirate, hanno migliorato significativamente la sopravvivenza del paziente ma hanno anche aumentato l'incidenza di tossicità polmonari non infettive, note collettivamente come lesioni polmonari correlate al trattamento del cancro (CTLI)1,2,3,4,5,6,7 . In particolare, la polmonite da inibitore dei checkpoint (CIP) è emersa come un evento avverso fatale correlato al sistema immunitario, con tassi di incidenza complessivi dal 2 al 19% e tassi di mortalità fino al 35%, 8, 9, 10. La diagnosi della CTLI rappresenta una sfida clinica importante perché i suoi sintomi respiratori aspecifici e le manifestazioni radiologiche—come opacità del vetro lucido, la consolidazione o le opacità retticolari—imitano da vicino quelli della polmonite infettiva o della progressionetumorale 11,12,13,14.

Attualmente, una diagnosi di CTLI deve essere determinata escludendo attentamente altreeziologie 15. I flussi di lavoro diagnostici tradizionali si basano fortemente su biomarcatori del sangue e colture microbiche standard, che richiedono molto tempo e spesso non riescono a fornire una diagnosi definitiva 16,17,18,19,20,21,22,23. Sebbene la biopsia chirurgica polmonare fornisca prove istopatologiche chiare, la sua invasività la rende inadatta per pazienti con cancro critico. Di conseguenza, vi è una necessità critica di un approccio diagnostico efficace e minimamente invasivo. Nella pratica clinica, il protocollo descritto in questo documento dovrebbe essere applicato ai pazienti oncologici che hanno già ricevuto o stanno attualmente ricevendo trattamenti antitumorali (ad esempio, immunoterapia o terapia mirata) e presentano nuovi sintomi respiratori e cambiamenti nell'imaging polmonare. È particolarmente raccomandata quando il CTLI è clinicamente sospettato, i test non invasivi standard non forniscono una diagnosi chiara e il paziente non tollera esami chirurgici invasivi.

La broncoscopia combinata con lavaggio broncoalveolare (BAL) funge da "biopsia liquida" minimamente invasiva delle vie respiratorieinferiori 24. Integrando l'analisi citologica del fluido BAL (BALF) con il sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS), questo approccio migliora significativamente i flussi di lavoro diagnostici esistenti. Innanzitutto, la citologia BALF fornisce un'istantanea diretta del microambiente polmonare; può identificare caratteristiche infiammatoriecaratteristiche 25, come la linfocitosi e un rapporto invertito CD4/CD8 nella CIP, mentre contemporaneamente si verifica la presenza di cellule maligne per escludere la progressionetumorale 26,27,28,29,30. In secondo luogo, la mNGS raggiunge una rilevazione rapida, altamente sensibile e imparziale dei patogeni, superando i bassi tassi di rilevamento e i ritardi delle colture tradizionali, in particolare per batteri esigenti o patogeniatipici 31,32,33,34,35. L'uso combinato di queste modalità ha dimostrato di migliorare significativamente la rilevazione delle infezioni miste e di guidare trattamenti precisi, riducendo drasticamente la mortalitàdei pazienti 4,5.

Nonostante questo potenziale clinico, attualmente non esiste un protocollo standardizzato per la raccolta e l'analisi completa dei BALF nel contesto del CTLI. Qui introduciamo un protocollo standardizzato per l'ottenimento e l'elaborazione del BALF tramite broncoscopia, combinando esplicitamente la valutazione citologica con la mNGS. La novità metodologica di questo flusso di lavoro risiede nella sua capacità diagnostica a doppio livello: sfrutta la citologia per mappare il microambiente immunitario ed escludere le malignità, insieme alla mNGS per determinare o escludere infezioni attive. Rispetto ai metodi diagnostici tradizionali, questo protocollo integrato offre il vantaggio distintivo di differenziare rapidamente e con precisione la CTLI dalle eziologie infettive e dalla progressione del tumore occulto. In definitiva, questo flusso di lavoro standardizzato accelera la tempistica diagnostica e guida interventi clinici tempestivi e mirati (Figura 1).

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Protocollo

Questo protocollo aderisce ai principi della Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale del nostro ospedale. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima della procedura.

1. Preparazione pre-procedura

  1. Valutazione del paziente (entro una settimana dalla broncoscopia)
    1. Ottenere esami di laboratorio recenti, inclusi un emocromo completo e un profilo coagulante, per garantire la sicurezza di una procedura invasiva (Supplemental File 1).
    2. Esegui un elettrocardiogramma a 12 derivazioni.
    3. Valuta i segni vitali e assicurati la stabilità emodinamica.
    4. Misurare la saturazione di ossigeno a riposo del paziente nell'aria ambiente per valutare la funzione polmonare.
      NOTA: Se la SpO₂ è bassa o il paziente presenta compromesso respiratorio, si consideri un'analisi gasometrica arteriosa per la base di PaO₂/PaCO₂.
    5. Controlla tutte le controindicazioni.
    6. Istruisci il paziente a digiunare per almeno 6 ore ed evitare di bere acqua per 2 ore prima della procedura per ridurre il rischio di aspirazione.
    7. Esegui aspirazione e pulizia orale e nasale immediatamente prima della procedura per minimizzare la contaminazione delle vie aeree superiori.
  2. Preparazione dell'equipaggiamento e del personale
    1. Preparare tutti gli apparati necessari per la broncoscopia e le apparecchiature di monitoraggio. Seleziona una dimensione di broncoscopio appropriata in base all'anatomia delle vie aeree del paziente. Verifica la funzionalità di aspirazione del broncoscopio.
      NOTA: Assicurarsi che le apparecchiature di rianimazione d'emergenza, inclusi dispositivi supplementari per la somministrazione di ossigeno e dispositivi di aspirazione, siano immediatamente disponibili nella sala procedure per gestire eventuali complicazioni nelle vie aeree. Qualsiasi broncoscopia certificato con formazione standard può eseguire questa procedura in modo indipendente senza certificazioni specializzate.
    2. Riscaldare la soluzione fisiologica sterile (0,9% NaCl) destinata al lavaggio a 37 °C.
    3. Preleva 100–150 mL di soluzione salina sterile riscaldata in più siringhe da 20 mL per facilitare una rapida instillazione.
  3. Configurazione del posizionamento e monitoraggio del paziente
    1. Posiziona il paziente supino sul tavolo per la broncoscopia.
    2. Installare apparecchiature di monitoraggio continuo per il paziente prima di iniziare la procedura.
      1. Applicare elettrocardiogramma (ECG) direttamente sul torace del paziente per un monitoraggio continuo dell'attività cardiaca.
      2. Collegare una sonda di pulsossimetro al dito del paziente per monitorare continuamente la saturazione di ossigeno nel sangue e il polso.
      3. Fissare un bracciale per la pressione sanguigna non invasivo sul braccio superiore del paziente per rilevare continuamente la pressione venosa.
  4. Installazione del dispositivo di supporto all'ossigeno e svezzamento post-procedura
    1. Preparare e configurare il dispositivo di supporto all'ossigeno appropriato in base allo stato respiratorio di base del paziente. Completa questa configurazione prima di iniziare la broncoscopia.
    2. Configurazione a cannula nasale ad alto flusso (HFNC)
      1. Seleziona un sistema HFNC per pazienti conSpO 2 ≥ 90% di aria ambiente e senza ipercapnia. Collega la cannula al paziente e imposta la portata iniziale di gas a ≥60 L/min con unFiO 2 pari a 1,0. Titra continuamente ilFiO 2 durante la procedura per mantenereSpO 2 ≥ 90%.
    3. Strategia di transizione per i pazienti con ventilazione non invasiva (NIV)
      1. Rimuovere la maschera NIV e trasferire il paziente a un sistema HFNC immediatamente prima dell'inserimento del broncoscopio. Imposta la portata del gas HFNC a ≥60 L/min con unFiO 2 di 1,0. Eseguire una suzione attiva delle vie aeree durante il periodo di non mascherata per eliminare le secrezioni e ottimizzare la percorrenza delle vie aeree.
      2. Monitorare attentamente il paziente per eventuali desaturazioni durante la transizione temporanea dalla NIV all'HFNC. Se lo SpO₂ scende sotto il 90% e rimane resistente all'aspirazione e alle impostazioni massime HFNC, interrompere immediatamente la procedura di broncoscopia. Riapplicare prontamente la maschera NIV per ripristinare la pressione positiva o aumentare l'intubazione endotracheale invasiva se lo stato respiratorio del paziente peggiora.
    4. Impianto di ventilazione meccanica invasiva (IMV)
      1. Imposta il volume tidale a 6–8 mL/kg di peso corporeo previsto, FiO₂ a 1,0, pressione positiva a fine espirazione (PEEP) a 5–8 cmH₂O e frequenza respiratoria a 12–16 respiri/min. Inserire il broncoscopio direttamente attraverso il tubo endotracheale stabilito.
    5. Mantieni un monitoraggio continuo dei segni vitali al completamento del lavaggio broncoalveolare (BAL). Titolare l'ossigeno supplementare per mantenereSpO2 tra il 92% e il 96% (ovvero dall'88% al 92% per i pazienti con ipercapnia cronica).
    6. Verifica che il paziente soddisfi tutti i seguenti criteri prima di ridurre il supporto all'ossigeno: completa emergenza dalla sedazione, ripristino dei riflessi protettivi delle vie aeree, stabilità emodinamica e assenza di sanguinamento attivo o broncospasmo grave.
    7. Per il dissezamento HFNC, prima ridurre la concentrazione, seguita dalla portata di portata. Diminuisci il FiO₂ in incrementi del 5% al 10% fino a raggiungere il ≤40%. Successivamente, diminuire la portata in incrementi del 5% al 10%. Interrompere completamente l'HFNC quando il paziente mantiene la SpO₂ target con un FiO₂ ≤ 35% e una portata ≤ 20 L/min.
    8. Per lo svezzamento della NIV, assicurati che l'ipossiemia migliori e che i parametri vitali siano stabili, poi procedi con uno di due metodi:
      1. Diminuisci l'IPAP di 2–3 cmH₂O per aggiustamento, riduci la PEEP a 4–5 cmH₂O e diminuisci la FiO₂ a ≤40%.
      2. Per lo svezzamento intermittente, si fa la transizione del paziente all'HFNC per facilitare e estendere gradualmente la durata della respirazione spontanea. Riavvia immediatamente il supporto completo della NIV se il paziente presenta tachipnea (>30 respiri/min), tachicardia (>140 battiti/min), affaticamento muscolare respiratorio, alterazione dello stato mentale o SpO₂ < 90%.
    9. Per lo svezzamento IMV, esegui una prova respiratoria spontanea o un test di perdita al manciale. Procedere all'estubazione solo dopo che il paziente ha superato con successo la sperimentazione, dimostra una forza di tosse spontanea adeguata e presenta secrezioni minime delle vie aeree.
  5. Sedazione e anestesia
    1. Iniettare 15 mL di lidocaina al 2% nella mucosa nasale e nell'orofaringe, suddiviso in dosi da 2 a 5 dosi.
    2. Inietta 10 mL di lidocaina al 2% in dosi divise attraverso il canale operativo del broncoscopio. Applica queste dosi passo dopo passo mentre si avanza il broncoscopio nelle vie aeree per coprire la mucosa tracheale, la carina e l'albero bronchiale.
      NOTA: La dose massima assoluta sicura di lidocaina topica è incerta. La tossicità si verifica solitamente quando la concentrazione sierica supera i 5 μg/mL, ma effetti collaterali soggettivi possono comparire a concentrazioni più basse. Monitora attentamente il volume totale di anestetico somministrato.
    3. Somministrare sedazione sistemica in base alle preferenze del paziente, al livello di ansia e alla tolleranza prevista alle procedure per garantire un'adeguata anestesia, massimizzare il comfort del paziente e ridurre la tosse. Somministrare midazolam 2–2,5 mg tramite iniezione endovenosa lenta, oppure ridurre la dose a 0,5–1 mg per pazienti fragili oanziani 36.
    4. Monitor SpO₂, ECG e pressione sanguigna non invasiva (NIBP) sono adottati continuamente37.
      NOTA: La sedazione sistemica aumenta significativamente i rischi di ipossia refrattaria, collasso delle vie aeree e intubazione tracheale d'emergenza. Monitora attentamente il paziente durante tutta la procedura.

2. Procedura BAL

NOTA: Eseguire la procedura di raccolta BALF rigorosamente in conformità con i protocolli standard e le linee guida di pratica clinica.

  1. Selezione del segmento polmonare bersaglio (Figura 2)
    1. Rivedere l'ultima ecografia computerizzata toracica ad alta risoluzione (HRCT) del paziente prima della procedura per determinare la precisa distribuzione anatomica della malattia polmonare.
    2. Selezionare il segmento polmonare bersaglio per il BAL in base alla distribuzione specifica della malattia identificata nella scansione HRCT.
    3. Indicare al broncoscopio di eseguire il lavaggio nel segmento più radiograficamente colpito o nel segmento che dimostra la progressione più rapida per malattia localizzata o marcatamente asimmetrica.
    4. Indirizzare il broncoscopio a lavare sia il lobo medio destro che la lingula del lobo superiore sinistro per malattie diffuse o simmetriche, poiché questi siti anatomici tipicamente forniscono un adeguato ritorno di liquidi.
  2. Prelavaggio e scarico del campione
    1. Inietta 20–30 mL di soluzione salina riscaldata attraverso il broncoscopio nel segmento incastrato. Aspetta 20–30 secondi.
    2. Applica una dolce aspirazione (pressione negativa 50–100 mmHg) per aspirare il liquido di nuovo. Raccogli questa prima aliquota in una trappola e scartala senza inviarla per l'analisi, poiché potrebbe contenere muco e detriti bronchiali.
  3. Procedura principale di lavaggio
    1. Collega saldamente una siringa sterile contenente lo 0,9% di soluzione salina normale alla porta del canale di lavoro del broncoscopio.
    2. Inietta 20 mL di soluzione salina attraverso il canale di lavoro per 3–5 secondi. Fermarsi immediatamente per 5–10 secondi dopo l'iniezione, permettendo al liquido di disperdersi completamente e depositarsi negli spazi alveolari distali per gravità.
    3. Applica una suzione delicata per recuperare il liquido instillato in una trappola sterile di raccolta. Mantieni una pressione di aspirazione sotto i 100 mmHg per evitare un collasso significativo delle vie aeree o danni alla mucosa delle vie aeree.
    4. Ripeti rigorosamente l'instillazione, la pausa e la sequenza di aspirazione finché il volume totale infuso non si trova tra 100 e 150 mL per garantire che il campione delle vie respiratorie inferiori sia adeguato e rappresentativo.
      NOTA: Monitorare continuamente i segni vitali, la saturazione di ossigeno e il comfort del paziente durante tutta la procedura. Interrompi immediatamente la procedura se si verifica una tosse forte o una desaturazione e riprendi solo dopo che il paziente si è stabilizzato.
  4. Tecnica di recupero fluido
    1. Usa una bassa pressione di aspirazione (≤100 mmHg) per evitare il collasso delle vie aeree.
    2. Impiega una tecnica di "aspirazione pulsata" invece della suzione continua: occluse e rilascia intermittentemente il tubo di aspirazione per permettere all'aria di mescolarsi, mobilitando il liquido e impedendo al bronco di collassare contro il telescopio.
    3. Punta a un prelievo di almeno 40–60 mL di BALF.
      NOTA: Interrompere il lavaggio se il paziente sviluppa complicazioni (ad esempio, broncospasmo, ipossiam intollerabile), anche se il volume completo non è stato recuperato. Ritieni il tempo totale della procedura per l'instillazione e l'aspirazione di BAL sotto i 2–3 minuti per minimizzare il rischio di ipossia.
  5. Cura post-lavaggio
    1. Ritira il broncoscopio con attenzione al completamento del BAL.
    2. Aspirare eventuali secrezioni residue dalle vie aeree centrali.
      NOTA: Continuare il supporto con HFNC o NIV se utilizzato fino a quando il paziente non sarà stabile durante il recupero. Monitorare il paziente per eventuali complicazioni post-procedurali, come sanguinamento o pneumotorace.

3. Gestione dei campioni e controllo qualità

  1. Misurazione, trasporto e valutazione iniziale del BALF
    1. Annota il volume di liquido restituito rispetto al volume instillato immediatamente durante la procedura.
    2. Calcola la percentuale di recupero utilizzando la seguente formula:
      Percentuale di recupero = (volume recuperato / volume instillato) × 100%
      NOTA: Un recupero del ≥30% è generalmente considerato un buon campione BALF.
    3. Metti subito il BALF raccolto sul ghiaccio. Trasportare il BALF prontamente al laboratorio.
      ATTENZIONE: I campioni umani di BALF sono potenzialmente infettivi. Maneggiare tutti i campioni con le dovute precauzioni standard.
    4. Osserva e registra il colore macroscopico e la torbidità del campione di BALF prima della lavorazione.
      NOTA: Liquido chiaro o giallo pallido senza torbidità visibile è tipico degli stati non infettivi. Un aspetto opaco o lattiginoso è associato alla proteinosi alveolare polmonare (PAP)38. Il liquido purulento indica una potenziale infezione batterica. Liquido con macchie di sangue indica un potenziale sanguinamento o emorragia alveolarediffusa 39.
  2. Valutazione della vitalità cellulare
    1. Diluire il BALF a una concentrazione di circa 1 × 106 cellule/mL utilizzando soluzione fisiologica salina sterile.
    2. Mescola il BALF diluito con blu di Tripan a un rapporto volumetrico 1:1 per ottenere una miscela reazionale di 20 μL.
      ATTENZIONE: Il blu di tripano è una sostanza chimica tossica e un sospetto cancerogeno.
    3. Incubare la miscela di reazione per 3 minuti a temperatura ambiente (circa 25 °C).
    4. Metti la miscela su un emocitometro. Esamina le cellule sotto un microscopio a bassa potenza.
    5. Contare almeno 200 celle per determinarne sistematicamente la vitalità.
      NOTA: Le cellule vitali rimangono non colorate, trasparenti e morfologicamente intatte, mentre quelle non vitali assumono il colorante blu. È necessaria una vitalità iniziale delle cellule del >90%–95% per garantire conteggi affidabili della citologia a valle.
  3. Distribuzione aliquota
    1. Dividere il BALF in tubi designati per diverse analisi durante l'operazione di lavaggio.
    2. Designa il Tubo 1 come "scartato" per la prima aliquota restituita.
    3. Designare il Tubo 2 per la microbiologia e allocare 10–20 mL di BALF per l'analisi del patogeno (ad esempio, mNGS).
      NOTA: Eseguire contemporaneamente nella pratica clinica colorazione/coltura batterica di Gram, colorazione/coltura fungina, test di bacillo acido-fasto (AFB) e PCR contemporaneamente.
    4. Designare il Tubo 3 per la citologia e riservare almeno 10 mL per il conteggio totale e differenziale delle cellule.
    5. Designare il Tubo 4 come riserva opzionale e conservare eventuali liquidi residui (a 4 °C per il breve termine o -80 °C per il lungo termine) per ulteriori test.
      NOTA: Congelare immediatamente il campione di mNGS a -80 °C se il test non può iniziare subito. Processare i campioni di citologia freschi; se si prevede un ritardo, si conserva il campione in frigorifero a 4 °C per un massimo di 24 ore per preservare la morfologia cellulare.

4. Lavorazione in laboratorio del BALF

  1. Conteggio totale delle cellule
    1. Inverti il tubo per mescolare delicatamente il BALF e risospendere le cellule.
    2. Diluire il BALF con un volume appropriato di soluzione fisiologica sterile se il campione contiene tappi di muco macroscopici e detriti.
    3. Pre-bagna un pezzo di garza medica sterile con soluzione salina sterile prima della filtrazione. Filtrare il campione diluito attraverso due strati della garza medica sterile pre-umidita.
    4. Raccogli il filtrato in un tubo sterile di raccolta dei minerali. Contare il totale delle cellule nucleate utilizzando un analizzatore ematologico.
      NOTA: Una bassa contaminazione da cellule epiteliali (<5% delle cellule) e una proporzione minima di globuli rossi (<10%) indicano un campione alveolare di alta qualità.
  2. Conteggio differenziale delle cellule
    1. Trasferire 1 mL del campione ben miscelato di BALF in un microtubo da 1,5 mL. Centrifuga il microtubo a 211 × g per 5 minuti per concentrare le cellule.
    2. Rimuovere il soprantantante, lasciando esattamente 50–100 μL di liquido nel microtubo. Risospendi accuratamente la pellet cellulare nel soprantantante rimasto.
    3. Pipetta 10–20 μL della sospensione a celle sosspese sulla superficie di un vetrino di vetro pulito, vicino al bordo smerigliato.
    4. Tieni una seconda vetrina pulita con un angolo di 30–45° rispetto alla prima vetrina. Spingi la seconda lamina in avanti usando una tecnica delicata di spalmatura a cuneo per creare una sfumatura cellulare sottile e uniforme.
    5. Ripeti i passaggi 4.2.3 a 4.2.4 per preparare 2–3 diapositive identiche.
    6. Lascia asciugare completamente all'aria le lamelle spalmate a temperatura ambiente.
    7. Tingi le vetrine usando il metodo Wright-Giemsa.
    8. Osserva le vetrine colorate al microscopio lucinico utilizzando un obiettivo ad immersione in olio ad alta potenza (ingrandimento 1.000×).
    9. Identifica e categorizza almeno 400 cellule per determinare il conteggio differenziale delle cellule.
      NOTA: Conservare qualsiasi campione di BALF con un alto sospetto clinico di malignità a 4 °C e presentarli al laboratorio centrale di patologia per la citocentrifugazione standardizzata entro 2 ore dalla raccolta del campione.
  3. Pipeline mNGS
    1. Inattivare il campione di liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) incubandolo a 65 °C per 30 minuti.
    2. Trasferire 0,5 mL del campione inattivato di BALF in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 g di sfere di vetro da 0,5 mm.
    3. Fissa il tubo della microcentrifuga a una piattaforma orizzontale su un miscelatore a vortice. Agitare la miscela a 2.800–3.200 giri/min per 30 minuti per facilitare la rottura meccanica della parete cellulare microbica e il successivo rilascio di DNA.
    4. Centrifugare brevemente il tubo per stabilizzare le sfere e trasferire con cura 0,3 mL del surnante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
    5. Estrai gli acidi nucleici totali dal surnatant utilizzando un kit di estrazione di DNA a microvolume, seguendo rigorosamente le istruzioni del produttore.
    6. Misura la concentrazione del DNA estratto utilizzando un fluorometro.
    7. [PUNTO DI PAUSA] Conservare il DNA estratto a -20 °C per un uso a breve termine o a -80 °C per la conservazione a lungo termine se la preparazione della biblioteca non viene eseguita immediatamente.
    8. Costruire le librerie di metagenomica dal DNA estratto utilizzando un kit di preparazione della libreria a input ultra-basso.
    9. Ispezionare le librerie costruite per assicurarsi dimensioni adeguate dei frammenti e una concentrazione sufficiente.
    10. Sequenzia le librerie qualificate su una piattaforma di sequenziamento ad alto throughput.
  4. Analisi dei dati di sequenziamento
    1. Eliminare letture di bassa qualità e sequenze adattabili dai dati grezzi di sequenziamento utilizzando software di elaborazione sequenzia.
    2. Le letture di scartato con una lunghezza inferiore a 35 coppie di basi (bp), quelle che mostrano bassa complessità e quelle con un punteggio di qualità Phred (punteggio Q) inferiore a 20.
    3. Allinea le letture di alta qualità al genoma di riferimento umano (versione hg38) utilizzando un algoritmo di allineamento Burrows-Wheeler per identificare le sequenze di DNA umano.
    4. Scartare le sequenze allineate dell'ospite umano per isolare i dati di sequenziamento non ospite.
    5. Analizza le restanti letture di sequenziamento non ospite su un database di riferimento di classificazione per ottenere informazioni microbiche a livello di specie. Costruire il database basandosi su database genomici pubblicati, come il database di sequenze di riferimento presso il National Center for Biotechnology Information (NCBI). Assicurati che contenga dati completi sui patogeni (ad esempio, 25.863 patogeni comprendenti 12.142 batteri, 2.680 funghi, 10.061 virus, 654 parassiti, 206 micobatteri e 120 micoplasma/clamidia).
    6. Stabilire controlli negativi ('No template', NTC) e positivi elaborandoli attraverso le stesse procedure di estrazione, preparazione della libreria e analisi bioinformatica.
    7. Esaminare il numero di lettura strettamente mappato (SMRN) e la copertura genomica per la valutazione diagnostica.
      NOTA: SMRN indica la quantità di sequenze che sono esattamente allineate con il microrganismo a livello di specie.
    8. Classifica un risultato mNGS batterico, fungino, micoplasma o clamidia come positivo se il microrganismo non viene rilevato nel NTC E la sua copertura genomica è tra i primi 10 tra i microbi dello stesso genere, OPPURE se il rapporto tra SMRN_sample e SMRN_NTC è > 10 (quando SMRN_NTC ≠ 0).
    9. Confermare che il SMRN_sample soddisfi le seguenti soglie minime per un risultato positivo: ≥3 per batteri, funghi, micoplasmi e clamidie; ≥100 per parassiti; e ≥1 per Mycobacterium tuberculosis.
    10. Classifica un risultato virale mNGS come positivo se il virus non viene rilevato nel NTC, O se il rapporto tra SMRN_sample e SMRN_NTC è >5 (quando SMRN_NTC ≠ 0).
    11. Conferma che la SMRN_sample per i virus sia ≥1.
    12. Compila un elenco dei patogeni candidati insieme ai loro conteggi di lettura o abbondanze relative.
    13. Registra eventuali geni di resistenza agli antibiotici o fattori di virulenza identificati dalla pipeline di bioinformatica.
    14. Definisci un colpo significativo combinando il numero di letture, il confronto statistico con i gruppi di controllo e la rilevanza clinica.
    15. Valuta se ciascun patogeno identificato può spiegare la situazione clinica.

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Risultati

Seguendo il protocollo standardizzato sopra indicato, i clinici possono ottenere in modo riproducibile campioni di BALF di alta qualità e utilizzare sia analisi cellulari che genomiche per distinguere CTLI dai suoi mimetici. Di seguito, presentiamo un risultato rappresentativo del nostro caso per illustrare i risultati tipici. Viene presentata una donna di 68 anni con un cancro ai polmoni di stadio IV poco differenziato (tumore primario della regione pleurica destra) in immunoterapia con...

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Discussione

Nell'attuale era della terapia oncologica, le lesioni agli organi correlate al trattamento, come quelle indotte dagli inibitori dei checkpoint immunitari (ICI), rimangono una preoccupazione clinica importante che può limitare la progressione del trattamento o addirittura essere potenzialmenteletale 3,4. Tra gli eventi avversi immunocorrelati (IRAE) indotti dall'ICI, la polmonite ha attirato notevole attenzione come causa primaria...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.

Dichiarazione di assistenza all'IA:
Gli autori dichiarano l'uso di tecnologie assistite dall'IA durante la preparazione di questo manoscritto. In particolare, Gemini by Google è stato utilizzato esclusivamente per perfezionare la lingua inglese, correggere errori grammaticali e garantire che la formattazione strutturale rispettasse le linee guida della rivista. Lo strumento di IA non è stato utilizzato per la generazione, l'analisi o l'interpretazione dei risultati scientifici. Tutti gli autori hanno esaminato attentamente il testo generato, effettuato le modifiche necessarie e si sono assunto la piena responsabilità per l'accuratezza scientifica e l'integrità del manoscritto finale.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Progetto di Miglioramento della Capacità Tecnologica Sanitaria della Commissione Sanitaria Provinciale del Jilin (Grant n. 2023JC007).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2% di lidocainaHunan KelunN/AAnestetico locale per la mucosa delle vie aeree.
Perle di vetro da 0,5 mmSigmaN/AUtilizzato per la rottura meccanica della parete cellulare dei microbi.
Broncoscopio elettronico BF-260OlympusN/AIl broncoscopio viene utilizzato per ottenere il liquido di lavaggio alveolare.
Allineamento Burrows-WheelerOpen Source0.7.17(RRID:SCR_010910)Algoritmo per la mappatura delle sequenze nel genoma umano.
Strumento di ossigenoterapia umidificata ad alto flussoBMC MedicalN/AFornire un certo flusso, riscaldamento e umidificazione di gas respiratorio per i pazienti con respirazione spontanea.
Miscelatore a vorticeScientific  IndustrieN/AIndustrie scientifiche
MidazolamJiangsu EnhuaN/ASedativo sistemico per il comfort del paziente.
Piattaforma Nextseq 550IlluminaN/ALa sequenza genica per sequenziare il genoma in BALF
Kit per la libreria QIAseq Ultralow InputTiangenN/AKit per la costruzione di librerie metagenomiche
Qubit 4.0Thermo Fisher ScientificN/AStrumento per rilevare il contenuto di acidi nucleici BALF
TIANamp Micro DNA Kit DP316TiangenN/AIl kit di estrazione del DNA per estrarre gli acidi nucleici totali da BALF
Blu di tripanoBiosharpN/AColorante usato per la valutazione della vitalità cellulare.
  Bagno d'acquaJoanN/AUtilizzato per l'inattivazione del campione BALF a 65 °C.
Colorazione di Wright-GiemsaYuanmuN/AUsato per la colorazione differenziale delle cellule.
Analizzatore ematologico XN-9000SysmexSN-13699Analizzatore ematologico per contare il totale delle cellule nucleate dal campione di BALF

Riferimenti

  1. Li, Z., et al. Effects and potential mechanisms of the ultra-high dose rate radiotherapy on lung injury: a review. Radiat Oncol. 20 (1), 161(2025).
  2. Kormish, J., et al. Temporal and spatial patterns of inflammation and tissue injury in patients with postoperative respiratory failure after lung resection surgery: a nested case-control study. Int J Mol Sci. 24 (12), 10051(2023).
  3. Xie, X., et al. Fatal toxic effects related to EGFR tyrosine kinase inhibitors based on 53 cohorts with 9,569 participants. J Thorac Dis. 12 (8), 4057-4069 (2020).
  4. Hazama, K., et al. Disproportionality analysis of adverse events in advanced lung cancer treated with atezolizumab plus platinum-based combination chemotherapy. J Pharm Health Care Sci. , (2025).
  5. Iwasa, E., et al. Interstitial lung disease as an adverse drug reaction in Japan: exploration of regulatory actions as a basis for high reporting. Drug Saf. 43 (11), 1121-1131 (2020).
  6. Imran, S., et al. Immune checkpoint inhibitor-related pneumonitis: acute lung injury with rapid progression and organising pneumonia with less severe clinical disease. Histopathology. 81 (6), 724-731 (2022).
  7. Zou, T., et al. A real-world disproportionality analysis of the US Food and Drug Administration adverse event reporting system events for durvalumab. BMC Pharmacol Toxicol. 25 (1), 97(2024).
  8. Naidoo, J., et al. Pneumonitis in patients treated with anti-programmed death-1/programmed death ligand 1 therapy. J Clin Oncol. 35 (7), 709-717 (2017).
  9. Suresh, K., et al. Pneumonitis in non-small cell lung cancer patients receiving immune checkpoint immunotherapy: incidence and risk factors. J Thorac Oncol. 13 (12), 1930-1939 (2018).
  10. Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncol. 4 (12), 1721-1728 (2018).
  11. Hou, Z., et al. Pirfenidone for grade 2 and grade 3 radiation-induced lung injury: a multicentre, open-label, randomised, phase 2 trial. Lancet Oncol. 26 (12), 1552-1562 (2025).
  12. Huang, A., et al. Radiographic features and prognosis of early- and late-onset non-small cell lung cancer immune checkpoint inhibitor-related pneumonitis. BMC Cancer. 21 (1), 634(2021).
  13. Shroff, G. S., et al. Drug-induced lung disease in the oncology patient: from cytotoxic agents to immunotherapy. Clin Chest Med. 45 (2), 325-337 (2024).
  14. Kuhlman, J. E. The role of chest computed tomography in the diagnosis of drug-related reactions. J Thorac Imaging. 6 (1), 52-61 (1991).
  15. Nissen, A., et al. Advances in noninvasive imaging for detecting radiation-induced lung injury (RILI). Int J Radiat Biol. , 1-13 (2025).
  16. Gosangi, B., et al. Imaging features of toxicities associated with immune checkpoint inhibitors. Eur J Radiol Open. 9, 100434(2022).
  17. Teng, P., et al. Severe community-acquired pneumonia with disseminated infection caused by highly virulent Pseudomonas aeruginosa: successful treatment of a case. J Inflamm Res. 18, 12817-12824 (2025).
  18. Wang, C. C., et al. Acute fibrinous and organizing pneumonia presents as right lung upper lobe cavitary lesion: case report and literature review. Medicine (Baltimore). 104 (39), e44915(2025).
  19. Li, Q., et al. Psittacosis chlamydia pneumonia complicated with organizing pneumonia: a case report and literature review. Front Med (Lausanne). 12, 1670456(2025).
  20. Lin, X., et al. Expert consensus on cancer treatment-related lung injury. J Thorac Dis. 17 (4), 1844-1875 (2025).
  21. Zhang, Y., Shen, W. X., Li, P., Chen, M. B., Zhou, L. N. Serum interleukin levels predict occurrence of acute radiation pneumonitis and overall survival in thoracic tumours. Clin Invest Med. 48 (1), 29-38 (2025).
  22. Loy-Caraos, G., et al. PNA-FISH-based chromosome aberration frequency and serum IL-6 as predictive biomarkers for radiation therapy-induced pneumonitis in lung cancer patients. Radiat Res. 204 (2), 127-142 (2025).
  23. Zhang, X., et al. Integrated omics characterization reveals reduced cancer indicators and elevated inflammatory factors after thermal ablation in non-small cell lung cancer patients. Respir Res. 25 (1), 309(2024).
  24. Luo, T., et al. Preclinical models of immune checkpoint inhibitors-related interstitial pneumonia for anti-PD1 tumor immunotherapy. Immunobiology. 230 (2), 152884(2025).
  25. Xiao, L., et al. Early prediction of radiation pneumonitis in patients with lung cancer treated with immunotherapy through monitoring of plasma chemokines. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 122 (5), 1238-1247 (2025).
  26. Lin, X., et al. Comprehensive analysis of the immune microenvironment in checkpoint inhibitor pneumonitis. Front Immunol. 12, 818492(2021).
  27. Suresh, K., et al. The alveolar immune cell landscape is dysregulated in checkpoint inhibitor pneumonitis. J Clin Invest. 129 (10), 4305-4315 (2019).
  28. Strippoli, S., et al. Cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid to narrow differential diagnosis of checkpoint inhibitor-related pneumonitis in metastatic melanoma. J Transl Med. 18 (1), 473(2020).
  29. Johkoh, T., et al. Chest CT diagnosis and clinical management of drug-related pneumonitis in patients receiving molecular targeting agents and immune checkpoint inhibitors: a position paper from the Fleischner Society. Chest. 159 (3), 1107-1125 (2021).
  30. Davidson, K. R., Ha, D. M., Schwarz, M. I., Chan, E. D. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 12 (9), 4991-5019 (2020).
  31. Ungvári, T., et al. The possible role of some laboratory parameters in predicting radiation-induced lung injury after breast cancer treatment. Orv Hetil. 166 (29), 1153-1159 (2025).
  32. Park, S. H., et al. Predictive factors for severe radiation-induced lung injury in patients with lung cancer and coexisting interstitial lung disease. Radiother Oncol. 192, 110053(2024).
  33. Lin, X., et al. Peripheral blood biomarkers for early diagnosis, severity, and prognosis of checkpoint inhibitor-related pneumonitis in patients with lung cancer. Front Oncol. 11, 698832(2021).
  34. Arora, S., Walker, S. M., Cummings, K. W., Hammer, M. M. Pneumonia in immunocompromised patients. Radiographics. 45 (12), e250021(2025).
  35. Domagala-Kulawik, J. The relevance of bronchoalveolar lavage fluid analysis for lung cancer patients. Expert Rev Respir Med. 14 (3), 329-337 (2020).
  36. Du Rand, I. A., et al. British Thoracic Society guideline for diagnostic flexible bronchoscopy in adults: accredited by NICE. Thorax. 68, Suppl 1. i1-i44 (2013).
  37. Wahidi, M. M., et al. American College of Chest Physicians consensus statement on the use of topical anesthesia, analgesia, and sedation during flexible bronchoscopy in adult patients. Chest. 140 (5), 1342-1350 (2011).
  38. Jouneau, S., Ménard, C., Lederlin, M. Pulmonary alveolar proteinosis. Respirology. 25 (8), 816-826 (2020).
  39. Maldonado, F., Parambil, J. G., Yi, E. S., Decker, P. A., Ryu, J. H. Haemosiderin-laden macrophages in the bronchoalveolar lavage fluid of patients with diffuse alveolar damage. Eur Respir J. 33 (6), 1361-1366 (2009).
  40. Olsen, H. H., Grunewald, J., Tornling, G., Sköld, C. M., Eklund, A. Bronchoalveolar lavage results are independent of season, age, gender and collection site. PLoS One. 7 (8), e43644(2012).
  41. Meyer, K. C., et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 185 (9), 1004-1014 (2012).
  42. Whitley, R. J., Roizman, B. Herpes simplex virus infections. Lancet. 357 (9267), 1513-1518 (2001).
  43. Li, H., et al. Prediction of primary biliary cholangitis among health check-up population with anti-mitochondrial M2 antibody positive. Clin Mol Hepatol. 31 (2), 474-488 (2025).
  44. Wakabayashi, S. I., et al. Emergence of anti-mitochondrial M2 antibody in patient with angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Clin J Gastroenterol. 11 (4), 302-308 (2018).
  45. Madrid, F. F., et al. Autoantibodies in breast cancer sera are not epiphenomena and may participate in carcinogenesis. BMC Cancer. 15, 407(2015).
  46. Nisihara, R., et al. Anti-nuclear antibodies in patients with breast cancer. Clin Exp Immunol. 193 (2), 178-182 (2018).
  47. Mohammed, M. E., Abdelhafiz, K. Autoantibodies in the sera of breast cancer patients: antinuclear and anti-double stranded DNA antibodies as example. J Cancer Res Ther. 11 (2), 341-344 (2015).
  48. Khan, M. B., Kaur, A., Ali, A., Boris, A., Spitalewitz, S. Complete resolution of paraneoplastic membranous nephropathy following curative therapy of triple-negative breast cancer. Cureus. 13 (9), e18125(2021).
  49. Sun, X., et al. Immune-related adverse events associated with programmed cell death protein-1 and programmed cell death ligand 1 inhibitors for non-small cell lung cancer: a PRISMA systematic review and meta-analysis. BMC Cancer. 19 (1), 558(2019).
  50. Miao, Q., et al. Microbiological diagnostic performance of metagenomic next-generation sequencing when applied to clinical practice. Clin Infect Dis. 67, Suppl 2. S231-S240 (2018).
  51. Chen, J., et al. Metagenomic next-generation sequencing for concurrent diagnosis of infections and malignancies in patients with lung lesions: a single-center prospective study. Sci Rep. 15 (1), 33721(2025).
  52. Liang, W., et al. Diagnostic strategy of metagenomic next-generation sequencing for gram negative bacteria in respiratory infections. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 23 (1), 10(2024).
  53. Hauser, S., et al. A metagenomics method for the quantitative detection of bacterial pathogens causing hospital-associated and ventilator-associated pneumonia. Microbiol Spectr. 11 (6), e0129423(2023).
  54. Li, H., et al. Detection of pulmonary infectious pathogens from lung biopsy tissues by metagenomic next-generation sequencing. Front Cell Infect Microbiol. 8, 205(2018).
  55. Liu, H., Zhang, Y., Yang, J., Liu, Y., Chen, J. Application of mNGS in the etiological analysis of lower respiratory tract infections and the prediction of drug resistance. Microbiol Spectr. 10 (1), e0250221(2022).
  56. Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Martinez, F. J., Huffnagle, G. B. The microbiome and the respiratory tract. Annu Rev Physiol. 78, 481-504 (2016).
  57. Huang, M. Q., Zheng, T. T., Wang, X. R., Xiang, F. The clinical value of metagenomic next-generation sequencing in Pneumocystis jirovecii pneumonia. Infect Drug Resist. 17, 69-80 (2024).
  58. Li, Y., et al. Optimization of decision thresholds for Mycobacterium tuberculosis can effectively improve the performance of mNGS in tuberculosis diagnosis. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1646194(2025).
  59. Mei, J., et al. Diagnostic role of mNGS in polymicrobial periprosthetic joint infection. J Clin Med. 12 (5), (2023).
  60. Wang, J., Han, Y., Feng, J. Metagenomic next-generation sequencing for mixed pulmonary infection diagnosis. BMC Pulm Med. 19 (1), 252(2019).
  61. Qiang, P., et al. A new era in lower respiratory tract infections management: synergy between mNGS and CMTs in patients with hematological disorders. Diagn Microbiol Infect Dis. 114 (2), 117158(2026).
  62. Duan, J., et al. Metagenomic analysis identifying a polymicrobial pulmonary infection in a non-HIV immunocompromised patient: a case report. BMC Pulm Med. 25 (1), 12(2025).
  63. Qin, Z., et al. Metagenomic next-generation sequencing contributes to the diagnosis of mixed pulmonary infection: a case report. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 21 (1), 52(2022).
  64. Deng, Z., et al. BALF metagenomic next-generation sequencing analysis in hematological malignancy patients with suspected pulmonary infection: clinical significance of negative results. Front Med (Lausanne). 10, 1195629(2023).
  65. Zhang, P., et al. Metagenomic next-generation sequencing for the clinical diagnosis and prognosis of acute respiratory distress syndrome caused by severe pneumonia: a retrospective study. PeerJ. 8, e9623(2020).
  66. Chiu, C. Y., Miller, S. A. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 20 (6), 341-355 (2019).
  67. Hasan, M. R., et al. Depletion of human DNA in spiked clinical specimens for improvement of sensitivity of pathogen detection by next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54 (4), 919-927 (2016).
  68. Miller, S., et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid. Genome Res. 29 (5), 831-842 (2019).
  69. Zinter, M. S., et al. Pulmonary metagenomic sequencing suggests missed infections in immunocompromised children. Clin Infect Dis. 68 (11), 1847-1855 (2019).
  70. Rodino, K. G., Simner, P. J. Status check: next-generation sequencing for infectious-disease diagnostics. J Clin Invest. 134 (4), (2024).
  71. Simner, P. J., Miller, S., Carroll, K. C. Understanding the promises and hurdles of metagenomic next-generation sequencing as a diagnostic tool for infectious diseases. Clin Infect Dis. 66 (5), 778-788 (2018).
  72. Li, S., et al. One-step diagnosis of infection and lung cancer using metagenomic sequencing. Respir Res. 26 (1), 48(2025).
  73. Liu, B., et al. Onco-mNGS facilitates rapid and precise identification of the etiology of fever of unknown origin: a single-centre prospective study in North China. BMC Infect Dis. 24 (1), 1475(2024).
  74. Gu, W., et al. Detection of cryptogenic malignancies from metagenomic whole genome sequencing of body fluids. Genome Med. 13 (1), 98(2021).

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