In vitro Analisi funzionale delle cellule T regolatorie: attenzione alla proliferazione e differenziazione

Sommario

Questo protocollo fornisce una strategia di co-coltura in vitro per indagare gli effetti delle cellule T regolatorie sulla proliferazione e differenziazione delle cellule T degli effettori.

Abstract

Le cellule T regolatorie (Treg) svolgono ruoli chiave nel mantenimento dell'omeostasi immunitaria. Le anomalie nella funzione delle cellule Treg sono associate a varie malattie, tra cui malattie autoimmuni, rigetto da trapianto d'organo, infezioni e cancro. La manipolazione delle cellule Treg è considerata una potenziale strategia terapeutica per il trattamento delle malattie infiammatorie, inclusi disturbi autoimmuni, rigetto da trapianto di organi solidi, malattie innesto contro ospite e malattie allergiche. I classici saggi di soppressione delle cellule Treg in vitro valutano principalmente l'effetto inibitorio delle cellule Treg sulla proliferazione delle cellule T (Teff). Tuttavia, oltre alla proliferazione, la differenziazione delle cellule T è importante affinché le cellule T svolgano le loro funzioni immunitarie. Pertanto, questo protocollo fornisce un saggio modificato in vitro per la soppressione delle cellule Treg per indagare gli effetti delle cellule Treg sulla proliferazione e differenziazione delle cellule Teff. In questo protocollo viene introdotta per la prima volta la preparazione delle cellule Treg del topo e delle cellule T naïve, seguita dalla strategia di co-coltura per studiare gli effetti regolatori delle cellule Treg sulla proliferazione e differenziazione delle cellule Teff, incluse le cellule Th1 e Th17, e infine la strategia di colorazione per la citometria di flusso dopo la co-coltura. Questa analisi funzionale in vitro delle cellule Treg può essere utilizzata per indagare gli effetti delle cellule Treg sulla proliferazione e polarizzazione delle cellule T.

Introduzione

Le cellule T (Treg) regolatorie CD4⁺CD25^{+Foxp3 sono} importanti mediatori dell'omeostasi^{immunitaria 1}. Le cellule Treg sopprimono attivamente risposte immunitarie eccessive e mantengono tolleranza all'autoimmunità, impedendo così che le reazioni immunitarie danneggino tessuti e organi^{normali 2}. La manipolazione delle cellule di Treg è considerata una potenziale strategia terapeutica per il trattamento di malattie infiammatorie come disturbi autoimmuni, rigetto da trapianto di organi solidi, malattie innesto contro ospite e malattie^{allergiche 3,4,5}. Nel frattempo, inibire la funzione delle cellule Treg è considerato una strategia efficace per attivare l'immunità^{antitumorale 6,7}. Studi clinici hanno indagato la terapia adottiva con cellule T regolatorie o il trattamento a basso dosaggio con IL-2 per disturbi autoimmuni, trapianto di organi solidi e malattia innesto contro^{ospite 8,9,10}. Inoltre, studi sulle cellule Treg ingegnerizzate, incluse le cellule Treg del recettore antigenico chimerico (CAR)-Treg e le cellule T-cell recettore (TCR)-Treg, stanno ricevendo sempre più attenzione^11,12.

Ad oggi, la terapia con cellule Treg non è stata ampiamente consolidata nel trattamento clinico di routine. Per supportare l'applicazione clinica della terapia con cellule Treg, sono importanti la ricerca sistematica e la valutazione delle sue funzioni. Una strategia comune per valutare le funzioni delle cellule T regolatorie in vitro è il test di soppressione Treg in ^{vitro 13}, che può rilevare la funzione soppressiva delle cellule Treg sulla proliferazione delle cellule T (Teff) effettori. Tuttavia, il test standard in vitro di soppressione Treg non valuta la differenziazione delle cellule Teff. Se la proliferazione e la differenziazione delle cellule T effettrici possono essere valutate simultaneamente, si possono ottenere maggiori informazioni sulla funzione delle cellule T regolatorie.

Qui presentiamo un saggio modificato in vitro per la soppressione delle cellule Treg, denominato "analisi funzionale in vitro delle cellule Treg" (Figura 1). Questo protocollo fornisce una strategia di co-coltura in vitro per indagare gli effetti delle cellule Treg sulla proliferazione e differenziazione delle cellule Teff.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati autorizzati dal Comitato di Etica Animale presso l'Ospedale della Cina Occidentale, Università del Sichuan (Approvazione n. 20250814006, 20211212A). Tutti i topi utilizzati in questo esperimento erano su un background genetico C57BL/6.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare il tampone di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS): 1× PBS contenente albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5%.
2. Prepara il tampone di selezione cellulare attivata magneticamente (MACS): 1× PBS contenente lo 0,5% di BSA e 2 mM di acido etilendiaminamine tetraacetico (EDTA).
3. Prepara il mezzo di coltura cellulare: mezzo RPMI 1640 contenente 10% di siero bovino fetale (FBS), 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM di L-glutamina, 10 mM di HEPES, 55 μM β-mercaptoetanolo, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di estreptomicina.

2. Preparazione dei linfociti di topo C57BL/6

1. Prendi la milza e i linfonodi periferici (LN) di un topo C57BL/6 di 6–8 settimane (maschio o femmina) in condizioni sterili e inserili in un tubo centrifugo da 50 mL con 5 mL di tampone FACS.
   NOTA: La dissezione della milza e delle LN deve essere eseguita secondo le procedure standard.
2. Posiziona un colino a celle da 70 μm su un tubo centrifugo da 50 mL, poi posiziona la milza e le LN sul colino, e usa un pistone a siringa da 5 mL per macinare delicatamente il tessuto per 1 minuto. Durante la macinatura, risciacqua il colino 3 volte con il buffer FACS. Assicurati di macinare completamente tutto il tessuto e sciacquare le cellule nel tubo della centrifuga. Dopo aver macinato, togli il colino.
3. Centrifuga a 4 °C, 350 × g per 7 minuti.
4. Rimuovere il surnadante, risospendere il pellet cellulare in 3 mL di tampone di lisi dei globuli rossi e lasciare la sospensione a temperatura ambiente per 3–5 minuti.
5. Aggiungere immediatamente il buffer FACS al tubo della centrifuga a un volume di 15–20 mL per terminare la lisi, e centrifugare a 4 °C, 350 × g per 7 minuti.
6. Rimuovi il surnante, aggiungi 10 mL di buffer FACS e sospezioni delicatamente il pellet cellulare.
7. Prendere 10 μL di sospensione cellulare e utilizzare la colorazione con tripano blu per contare il totale dei linfociti vivi.
   NOTA: Queste cellule sono linfociti CD45.2⁺ .

3. Preparazione dei linfociti di topo CD45.1

1. Prendi la milza e le LN di un topo CD45.1 di 6–8 settimane (maschio o femmina) in condizioni sterili e mettili in un tubo centrifugo da 50 mL con 5 mL di tampone FACS.
2. Prepara i linfociti del topo CD45.1 seguendo gli stessi passaggi sopra descritti.
   NOTA: Queste cellule sono linfociti CD45.1⁺ .

4. Preparazione delle cellule T naïve CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺

NOTA: L'intero processo utilizza il kit di isolamento a celle T CD4⁺CD62L⁺ per MACS. Il buffer MACS è pre-raffreddato a 4 °C e tutte le condizioni di centrifugazione sono 4 °C, 350 × g per 7 minuti.

1. Raccogliere la sospensione cellulare dai topi C57BL/6, centrifugare e scartare il soprandante, aggiungere 400 μL di buffer MACS e 100 μL di cocktail biotina-anticorpi ^CD4+ T cell nel tubo centrifuga per 1 ×^{10 8} cellule iniziali. Mescola delicatamente e incuba a 4 °C per 5 minuti al buio.
2. Aggiungere 300 μL di buffer MACS e 200 μL di Microsfere Anti-Biotina al tubo della centrifuga dal passaggio 4.1 per 1 ×^{10 8} cellule totali iniziali. Mescola delicatamente e incuba a 4 °C per 10 minuti al buio.
3. Aggiungi 10 mL di buffer MACS, centrifuga e scarta il soprantantante. Sospendere il pellet cellulare in 2 mL di buffer MACS.
4. Posiziona la colonna LS sul separatore magnetico MACS appropriato. Usa 3 mL di buffer MACS per risciacquare la colonna. Aspetta che il buffer nella colonna si svuoti completamente prima di procedere al passo successivo.
   NOTA: La capacità massima di carico delle celle della colonna LS è 2 × 10⁹ celle, includendo sia celle positive che negative, e il numero massimo di celle positive che può catturare è 1 × 10⁸. Di solito, un singolo mouse richiede una sola colonna LS qui.
5. Carica la sospensione a celle del passaggio 4.3 sulla colonna LS. Quando la sospensione della cella scorre completamente nella colonna, si utilizzano 3 mL di buffer MACS per lavare la colonna. Raccogli tutto il liquido di flusso in un nuovo tubo centrifuga da 15 mL.
   NOTA: Questi sono il totale delle cellule CD4⁺CD25^– T.
6. Centrifugare il totale delle cellule CD4⁺CD25^– T ottenute nel passo 4.5, eliminare il soprantantante e ottenere la pellet cellulare.
7. Aggiungere 800 μL di buffer MACS e 200 μL di microperle CD62L al pellet cellulare ogni 1 ×^{10 8} cellule iniziali totali. Mescola delicatamente e incuba a 4 °C per 10 minuti al buio.
8. Aggiungi 10 mL di buffer MACS al tubo della centrifuga, centrifuga e scarta il surnadante, e risospensi il pellet della cella in 500 μL di buffer MACS.
9. Posiziona la colonna MS sul separatore magnetico MACS appropriato e usa un buffer MACS da 1 mL per risciacquare la colonna.
10. Carica la sospensione a celle sulla colonna MS. Quando la sospensione scorre completamente nella colonna, usa 1 mL di buffer MACS per lavare la colonna 2 volte.
11. Rimuovi la colonna MS dal separatore magnetico e posizionala su un nuovo tubo centrifuga da 15 mL. Aggiungi 1 mL di buffer MACS alla colonna e spingi immediatamente lo sturalavandini con decisione per eluire le celle etichettate con sfere magnetiche.
12. Contare le cellule, centrifugare e scartare il surnadante, risospendere le celle in un volume appropriato di mezzo di coltura e tenere il tubo sul ghiaccio.
    NOTA: Queste cellule sono cellule T naïve CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ . Di solito, circa 8 × 10⁶ a 1 × 10⁷ cellule T naïve CD4⁺CD25^–CD62L⁺ possono essere purificate da un solo topo; l'inclusione di linfonodi periferici può aumentare la ressa.
13. Determinare la purezza delle cellule isolate: prendere 5 × 10^{cellule T CD4+}CD62L+ isolate e risospenderle in 50 μL di soluzione di anticorpi in un tubo centrifuga da 1,5 mL.
    NOTA: Prepara la soluzione di anticorpi aggiungendo l'anticorpo anti-topo CD4 PerCP-Cy5.5, l'anticorpo anti-topo CD62L FITC e l'anticorpo anti-topo CD25 PE nel buffer FACS con un rapporto 1:100.
14. Dopo l'incubazione di 20 minuti a 4 °C al buio, aggiungi 1 mL di tampone FACS per lavare le cellule. Centrifugare le celle, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 μL di buffer FACS.
15. Rilevare la purezza dei campioni tramite citometria di flusso.
    NOTA: Per dettagli sull'analisi del citometro di flusso, consultare il manuale utente dello strumento o il protocollo¹⁴ precedentemente segnalato. La purezza delle cellule T naïve CD4⁺CD25^–CD62L⁺ dovrebbe essere superiore al 95% nel campione isolato di cellule T (Figura 2).

5. Preparazione di cellule arricchite da Treg CD45.1^+CD4+CD25^{+ e cellule} non CD4+ arricchite con antigeni

NOTA: L'intero processo utilizza il Kit di Isolamento Regolatorio delle Cellule T CD4^+CD25+ per il MACS, e le istruzioni del kit sono state ottimizzate per ottenere simultaneamente cellule presentanti di antigeni (APC) non CD4⁺ arricchite e cellule CD4⁺CD25⁺ arricchite con Treg. Il buffer MACS è preraffreddato a 4 °C, e tutte le condizioni di centrifugazione sono 4 °C, 350 × g per 7 minuti.

1. Raccogliere la sospensione cellulare dai topi CD45.1, centrifugare e scartare il soprandante, aggiungere 400 μL di buffer MACS preraffreddato e 100 μL di cocktail regolatorio di biotina-anticorpi CD4^+CD25+ nel tubo della centrifuga ogni 1 × 10⁸ cellule iniziali. Mescola delicatamente e incuba a 4 °C per 10 minuti al buio.
2. Senza lavaggio, aggiungere direttamente 380 μL di buffer MACS preraffreddato, 200 μL di microsfere anti-biotina e 20 μL di anticorpo CD25-PE ogni 1 ×^{10 8} cellule iniziali totali al tubo centrifuga dal passaggio 5.1. Mescola delicatamente e incuba a 4 °C per 15 minuti al buio.
3. Aggiungere 10 mL di buffer MACS al tubo della centrifuga, centrifugare e eliminare il surnatante, quindi risospendere il pellet della cella in 500 μL di buffer MACS ogni 1 ×^{10 8} celle iniziali totali.
4. Posizionare la colonna LD sul separatore magnetico MACS appropriato e risciacquare la colonna con 2 mL di buffer MACS. Aspetta che il buffer nella colonna si svuoti completamente prima di procedere al passo successivo.
5. Caricare lentamente la sospensione a celle dal passo 5.3 sulla colonna LD. Quando la sospensione della cella scorre completamente nella colonna, lava la colonna due volte con un buffer MACS da 2 mL. Raccogli tutto il liquido di flusso in un nuovo tubo centrifuga da 15 mL.
6. Rimuovi la colonna LD dal separatore magnetico e posizionala su un nuovo tubo centrifuga da 15 mL. Aggiungi 3 mL di buffer MACS alla colonna LD, spingi immediatamente lo sturalavandini con decisione per espellere ^{le celle non} CD4+ marcate con Microsfere. Contare le cellule, centrifugare, risospendere le cellule in un volume appropriato di mezzo di coltura cellulare per raggiungere una concentrazione cellulare di 1 × 10⁷ cellule/mL, e mantenere il tubo sul ghiaccio.
   NOTA: Queste cellule non CD4⁺ sono costituite principalmente da APC come macrofagi, cellule dendritiche e cellule B. In questo protocollo, queste cellule sono utilizzate ^{come frazione} non CD4+ arricchita da APC.
7. Centrifugare il totale delle cellule T CD4⁺ raccolte dal passo 5.5, eliminare il surnatant e ottenere la pellet cellulare.
8. Aggiungere 900 μL di buffer MACS e 100 μL di Microperle Anti-PE al pellet cellulare ogni 1 ×^{10 8} cellule iniziali totali. Mescola delicatamente e incuba a 4 °C per 15 minuti al buio.
9. Posizionare la colonna MS sul separatore magnetico MACS appropriato e risciacquare la colonna con 500 μL di buffer MACS preraffreddato. Aspetta che il buffer nella colonna si svuoti completamente prima di procedere al passo successivo.
10. Carica lentamente la sospensione della cella dal passo 5.8 sulla colonna MS. Quando la sospensione della cella scorre completamente nella colonna, lava la colonna due volte con un buffer MACS da 1 mL. Raccogli il liquido di flusso in un nuovo tubo centrifuga da 15 mL.
    NOTA: Le cellule nel liquido di flusso in questo momento sono CD4⁺CD25^– cellule T.
11. Distoglia la colonna MS dal separatore magnetico e posizionala su un tubo centrifugo nuovo da 15 mL. Aggiungere 1 mL di buffer MACS alla colonna, poi premere prontamente lo sturalavandini per recuperare le celle arricchite con Greg CD4⁺CD25⁺ marcate con perle magnetiche.
12. Dopo aver contato le celle, centrifugare la sospensione e rimuovere il sovrantante. Risospendere il pellet in un mezzo di coltura sufficiente per ottenere una concentrazione finale di 2 × 10⁶ cellule/mL, e mantenere il tubo sul ghiaccio.
    NOTA: Queste cellule sono cellule arricchite da Treg CD45⁺CD4^+CD25+. Di solito, da un solo mouse si possono purificare circa 8 × 10⁵ a 1 × 10⁶ celle CD4⁺CD25⁺; l'inclusione di linfonodi periferici può aumentare la ressa.
13. Determinare la purezza delle cellule isolate arricchite con Treg ^CD4+CD25+: prendere rispettivamente 5 × 10⁴ cellule isolate arricchite con Treg ^CD4+CD25+ e 5 ×^{10 4 cellule} isolate non CD4+ arricchite con APC, e risospenderle in 50 μL di soluzione anticorpale.
    NOTA: Preparare la soluzione di anticorpi aggiungendo l'anticorpo anti-topo CD4 PerCP-Cy5.5 e l'anticorpo anti-topo CD25 PE nel buffer FACS con un rapporto 1:100. Utilizzare qui lo stesso anticorpo anti-topo PE CD25 per confermare che le cellule CD4⁺CD25⁺ siano adeguatamente marcate e che non ci siano cellule T CD4⁺CD25⁺ nella frazione non CD4⁺ . Per un'identificazione più rigorosa delle cellule Treg, è possibile effettuare anche una colorazione intracellulare con un anticorpo anti-topo Foxp3 PB.
14. Dopo l'incubazione di 20 minuti a 4 °C al buio, aggiungi 2 mL di tampone FACS per lavare le cellule. Centrifugare le celle, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 μL di buffer FACS.
15. Rilevare la purezza dei campioni tramite citometria di flusso.
    NOTA: La frequenza delle cellule CD4⁺CD25⁺ dovrebbe essere ≥ 95% per garantire che la purezza della popolazione cellulare arricchita con Treg soddisfi i requisiti sperimentali (Figura 2). Le cellule non CD4⁺ utilizzate come frazione arricchita da APC dovrebbero contenere non più del 5% di cellule T CD4⁺ (Figura 2).

6. Marcatura delle cellule T CD4⁺ naïve con colorante di proliferazione cellulare

NOTA: Tutte le condizioni di centrifugazione sono 4 °C, 350 × g per 7 minuti. Il buffer PBS viene pre-bilanciato alla temperatura ambiente prima dell'utilizzo. Il processo di etichettatura avviene sotto protezione leggera per evitare la tempra del colorante.

1. Prendi la sospensione ingenua delle cellule T CD4⁺ , centrifuga, scarta il surnatante e ottieni la pellet cellulare.
2. Diluire il colorante di proliferazione cellulare eFluor 450 in PBS per ottenere una concentrazione di 20 μM a temperatura ambiente.
3. Aggiungi 0,5 mL di PBS ogni 1 × 10⁷ cellule. Mantieni il tubo inclinato a circa 45° e sospezioni delicatamente le cellule pipettando su e giù 50 volte.
4. Aggiungere rapidamente un volume uguale di soluzione di colorante di proliferazione cellulare nella sospensione cellulare, in modo che la concentrazione finale del colorante di proliferazione sia di 10 μM. Mantenere il tubo inclinato a circa 45° e mescolare le cellule pipettando su e giù 50 volte per garantire il pieno contatto tra le cellule e il colorante di proliferazione cellulare.
5. Avvolgi immediatamente il tubo della centrifuga con della carta di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Vortice delicatamente le cellule ogni 5 minuti per prevenire l'aggregazione cellulare.
6. Aggiungi 10 mL di mezzo di coltura cellulare preraffreddato al tubo centrifuga, si forma delicatamente un vortice per terminare la colorazione, poi centrifuga e si elimina il soprandante.
7. Aggiungi 5 mL di mezzo di coltura cellulare preraffreddato al pellet cellulare, centrifuga e scarta il soprantantante per lavare le cellule.
8. Aggiungi 5 mL di mezzo di coltura cellulare preraffreddato al pellet cellulare e risospedi le celle.
9. Contare le cellule, centrifugare e scartare il soprandante, risospendere le cellule in un volume appropriato di mezzo di coltura per raggiungere una concentrazione cellulare di 2 × 10⁶ cellule/mL, e mantenere il tubo sul ghiaccio.

7. Impostazione dell'analisi funzionale in vitro delle cellule Treg

1. Calcolare il numero di campioni necessari per la coltura cellulare, preparare una quantità appropriata di mezzo di coltura cellulare contenente 2,5 μg/mL anticorpo anti-topo CD3 o le citochine di induzione indicate, e vorticare delicatamente le cellule T naïve CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺, le cellule CD45.1^+CD4+CD25+ arricchite con Treg e le cellule non CD4⁺ arricchite con APC.
   NOTA: Utilizzare le cellule T naïve CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ come cellule T rispondenti (Tresp). Questo esperimento di esempio studia l'effetto delle cellule Treg sulla differenziazione e proliferazione delle cellule Th1 e Th17. Pertanto, ci sono in totale quattro campioni per la coltura cellulare: cellule Tresp coltivate in condizioni di induzione Th1 o Th17, in assenza o presenza di cellule arricchite con Treg.
2. Aggiungere 100 μL di cellule T naïve CD45.2⁺CD4⁺ (2 × 10^{5 celle} per pozzo) alla piastra a 48 pozzi.
3. Aggiungere 100 μL ^{di celle non} CD4+ arricchite ^con APC CD45.1+ (1 × 10⁶ celle per pozzo) alla piastra a 48 pozzi.
4. Aggiungere 100 μL di cellule arricchite con Treg CD45⁺CD4^+CD25+ (2 × 10⁵ celle per pozzo) ai pozzi sperimentali e aggiungere 100 μL di mezzo di coltura cellulare ai pozzi di controllo. Il rapporto cellula:Tresp arricchito da Treg nei campioni sperimentali è 1:1.
   NOTA: Il rapporto tra celle Treg e celle Tresp può essere impostato secondo necessità, oppure può essere progettato un pannello con rapporti multipli. Il numero di cellule Tresp è fissato nella co-coltura, mentre il numero di cellule Treg può essere modificato secondo necessità. Tipicamente, i rapporti tra Treg e Tresp nei campioni sperimentali includono 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 e 0:1. Inoltre, ogni condizione sperimentale può essere preparata in triplicata per minimizzare l'errore sperimentale casuale. Qui, per chiarezza, basandosi sull'esperienza di ricerca^{precedente 15,16}, si usa un rapporto 1:1 come esempio.
5. Aggiungere 100 μL di mezzo di coltura cellulare contenente 2,5 μg/mL di anticorpo anti-topo CD3 in ciascun pozzo.
   NOTA: La concentrazione finale di anticorpo anti-topo CD3 è 0,5 μg/mL. Oltre ai campioni sperimentali, si imposta un campione di controllo vuoto senza anticorpo anti-topo CD3. In questo campione, si aggiungono 100 μL di mezzo di coltura per cellule T senza anticorpo anti-topo CD3 per determinare l'intensità di fluorescenza delle cellule T non proliferate, ovvero l'intensità del picco 0. Questo consente una calibrazione accurata della distribuzione di proliferazione.
6. Aggiungere 100 μL di mezzo di coltura cellulare contenente le citochine indicate a ciascun pozzo per portare il volume finale di ciascun pozzo a 500 μL.
   NOTA: In questo esperimento, la IL-12 p70 ricombinante del topo a una concentrazione finale di 10 ng/mL viene utilizzata per indurre le cellule Th1, mentre il TGF-β1 umano ricombinante a una concentrazione finale di 2 ng/mL e il IL-6 ricombinante del topo a 50 ng/mL vengono utilizzati per indurre le cellule Th17.
7. Aggiungere PBS ai pozzi vuoti rimanenti (500 μL/pozzo) per mantenere l'umidità della lastra e ridurre gli effetti di bordo.
8. Incubare la piastra da 48 pozzi in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C per 3 giorni.
   NOTA: In questo sistema di co-coltura, l'anticorpo anti-topo solubile del CD3 fornisce il segnale primario del recettore delle cellule T (TCR) per l'attivazione delle cellule T, mentre le cellule non CD4⁺ arricchite da APC forniscono segnali costimolanti per attivare completamente le cellule T. I segnali TCR e costimolatori possono essere attivati anche dall'anticorpo anti-topo rivestito da piastra e dall'anticorpo anti-topo CD28 solubile. I ricercatori possono scegliere il metodo di stimolazione secondo necessità.

8. Analisi funzionale in vitro delle cellule Treg

NOTA: Tutte le condizioni di centrifugazione sono 4 °C, 350 × g per 7 minuti.

1. Pipettare delicatamente le cellule coltivate per risospenderle e trasferire la sospensione in un tubo centrifuga da 1,5 mL. Centrifuga le celle e rimuovi il soprantantante.
2. Aggiungere 500 μL di mezzo di coltura cellulare contenente 5 ng/mL di PMA, 1 μg/mL di ionomicina e 1:1.000 diluito GolgiPlug Protein Transport Inhibitor a ogni provetta, creare delicatamente un vortice per risospendere le cellule e incubarle in un incubatore al 5% di_CO-2 a 37 °C per 3 ore.
3. Centrifuga, scartare il soprantantante, aggiungere 50 μL di PBS contenente un test di colorante Zombie Yellow e anticorpo anti-topo diluito 1:100 a ciascun campione, vortice e incubare a temperatura ambiente al buio per 15 minuti per marcare le cellule morte e bloccare i recettori Fc.
4. Centrifuga, scartare il soprantantante, aggiungere 50 μL di cocktail di anticorpi superficiali, vortice e incubare a 4 °C al buio per 20 minuti.
   NOTA: Aggiungere anticorpi anti-CD4 PerCP-Cy5.5, anticorpo anti-CD45.1 FITC e anti-CD45.2 APC-eFluor 780 al buffer FACS in un rapporto 1:200 per preparare il cocktail di anticorpi superficiali.
5. Aggiungi 1 mL di buffer FACS a ogni tubo centrifuga, centrifuga e scarta il sovrantantante.
6. Aggiungere 300 μL di Soluzione di Fissazione e Permeabilizzazione a ogni tubo della centrifuga, vortice e incubare a 4 °C al buio per 20 minuti.
7. Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione/lavaggio a 1× a ogni tubo centrifuga, centrifuga e scartare il surrenatante; Poi ripeti questa fase di lavaggio una volta per assicurare la completa rimozione del fissatore residuo.
8. Aggiungi 50 μL di cocktail di anticorpi di citochine, vortice e incuba a 4 °C al buio per 40 minuti.
   NOTA: Aggiungere anticorpo anti-IFN-γ PE e anticorpo anti-IL-17A PE-Cy7 al Perm/Wash Buffer in un rapporto 1:100 per preparare il cocktail di anticorpi delle citochine.
9. Lavare ogni campione con 1 mL di tampone Perm/Wash, centrifugare le celle e rimuovere il surnante. Risospendere il pellet in 300 μL di buffer FACS.
10. Misurare la proliferazione e la differenziazione delle cellule Tresp tramite citometria a flusso. Utilizzare la seguente strategia di gating (Figura 3): innanzitutto, limitare la popolazione di linfociti tra le cellule totali ed escludere detriti cellulari e impurità; secondo, bloccare la popolazione unicellulare tra i linfociti basandosi sui segnali di scatter; terzo, confinare la popolazione di cellule vive tra le singole cellule; quarto, confinare la popolazione di cellule T CD4⁺ tra le cellule vive; quinto, gate la popolazione cellulare arricchita da Treg CD45.1⁺ e la popolazione di cellule Teff CD45.2⁺ tra le cellule T CD4⁺ ; sesto, le cellule CD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺ Th1, celle CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺ Th17 e le cellule T CD45.2⁺CD4⁺ non proliferate tra le cellule T CD45.2⁺ .
11. Effettuare l'acquisizione dei dati della citometria a flusso e analizzare i dati della citometria a flusso.
    1. Usa cellule T coltivate marcate con il colorante di proliferazione cellulare eFluor 450 come colore di controllo con colorante singolo. Prepara il colorante Zombie Yellow con un controllo con singola colorazione con cellule T coltivate che non sono state marcate con colorante di proliferazione cellulare. Prepara gli altri controlli a singola colorazione con perle di compensazione per ogni fluorofero utilizzato.
    2. Utilizzare cellule T marcate con il colorante di proliferazione cellulare eFluor 450 e coltivate senza anticorpo anti-topo CD3 per definire il gate delle cellule non proliferate.
    3. Utilizzare cellule T coltivate marcate con colorante di proliferazione cellulare e colorate con colorante Zombie Yellow, anticorpi di superficie cellulare e controlli isotipici dell'anticorpo anti-topo IFN-γ PE e dell'anticorpo anti-topo IL-17A PE-Cy7 per definire le porte delle cellule T IFN-γ⁺CD4⁺ e IL-17A⁺CD4⁺ .

Risultati

Nell'esperimento rappresentativo, le cellule T naïve sono state utilizzate come cellule Tresp per indagare gli effetti delle cellule arricchite con Treg sulla proliferazione e differenziazione delle cellule Th1 e Th17. In questo esperimento, le cellule Tresp sono state attivate ^{da cellule} anti-topo CD3 e non CD4+ arricchite con APC, per poi differenziarsi in cellule Th1 sotto induzione IL-12 p70 o in celle Th17 sotto induzione TGF-β1 e IL-6. In queste due condizioni di induzione, sono stati studiati cambiament...

Discussione

In questo studio, i risultati della co-coltura in condizioni di induzione Th1 sono coerenti con i precedenti rapporti secondo cui le cellule Treg possono sopprimere la proliferazione e la differenziazione delle cellule^{Th1 17,18}. Le cellule arricchite da Treg hanno anche inibito la proliferazione delle cellule Tresp in condizioni di induzione Th17. Tuttavia, nelle condizioni di polarizzazione Th17 utilizzate qui, la frequenza dell...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1.5 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3457IW	o equivalente
12.5 µL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420043	o equivalente
1250 µL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420813	o equivalente
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	o equivalente
200 µL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420318	o equivalente
48-well plates	Corning Incorporated	3548	o equivalente
5 mL syringe piston	Shifeng Medical	SB2-061(A)	o equivalente
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652	o equivalente
50 µL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420258	o equivalente
70 µm cell strainer	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	o equivalente
Anti-mouse CD28 antibody	BioXcell	BE0015-1	o equivalente
Anti-mouse CD3 antibody	BioXcell	BE0001-1	o equivalente
Anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	o equivalente
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	o equivalente
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	o equivalente
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	o equivalente
Beckman CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter	N/A	per l'acquisizione di dati citometrici di campioni di cellule immunitarie
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	o equivalente
C57BL/6 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	per l'isolamento di linfociti primari e sottoinsiemi di cellule T
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	o equivalente
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-041	per l'ordinamento delle cellule
CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-106-643	per l'ordinamento delle cellule
CD45.1 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	per l'isolamento di linfociti primari e sottoinsiemi di cellule T
CD45.1 Monoclonal Antibody (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	o equivalente
CD45.2 Monoclonal Antibody (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	o equivalente
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	o equivalente
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	o equivalente
eBioscience Cell Proliferation Dye eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	o equivalente
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	o equivalente
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	A5669701	o equivalente
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	software per l'analisi dei dati citometrici
Golgi-Plug Protein Transport Inhibitor	BD Biosciences	555029	o equivalente
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	o equivalente
Human TGF-beta1	PEPROTECH	100-21C	o equivalente
Ionomycin calcium salt	Millipore Sigma	I3909	o equivalente
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	per l'ordinamento delle cellule
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	o equivalente
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	per l'ordinamento delle cellule
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	per l'ordinamento delle cellule
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	per l'ordinamento delle cellule
OctoMACS Separators	Miltenyi Biotec	130-042-109	per l'ordinamento delle cellule
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	o equivalente
PE Rat IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400408	o equivalente
PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control Antibody	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	o equivalente
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	o equivalente
PMA	Millipore Sigma	P8139	o equivalente
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101302	o equivalente
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	per l'ordinamento delle cellule
Recombinant mouse IL-12 p70	PEPROTECH	210-12	o equivalente
Recombinant Mouse IL-6	R&D Systems	406-ML	o equivalente
Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK Lysing Buffer)	Thermo Fisher Scientific	A1049201	o equivalente
RPMI 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093	o equivalente
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070	o equivalente
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	o equivalente
UltraComp eBeads Compensation Beads	Thermo Fisher Scientific	01-2222-42	o equivalente
Zombie Yellow Fixable Viability Kit	BioLegend	423104	o equivalente
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	o equivalente