Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standard ad alta produttività per lo screening dei microrganismi industriali. Consiste nella costruzione di una libreria mutante tramite mutagenesi ARTP, nell'esecuzione di screening positivo delle gocce con microfluidica automatizzata, e successivamente nella verifica dei risultati. L'affidabilità del flusso di lavoro è stata convalidata tramite lo screening di ceppi ad alta resa di B. coagulans .
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Articolo metodologico
Screening ad alta produttività dei mutanti di Bacillo coagulante iperproduttore di acido lattico L-lattico utilizzando una piattaforma microfluidica automatica a gocce
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La bioproduzione industriale si basa su microrganismi per sintetizzare efficacemente i prodotti target in condizioni ingegnerizzate. Tuttavia, i ceppi di tipo selvatico spesso non hanno la capacità di farlo a causa delle loro reti metaboliche native. Pertanto, lo screening rapido e accurato di ceppi ad alte prestazioni provenienti da grandi librerie di mutanti è un passo fondamentale nell'allevamento microbico industriale. Negli ultimi anni, la tecnologia microfluidica a gocce ha attirato notevole attenzione per la sua alta produttività, basso consumo e capacità di compartimentazione a singola cella, portando allo sviluppo di numerosi sistemi di selezione a singola cella. In questo studio viene presentato un protocollo di screening ad alto rendimento per ceppi microbici industriali utilizzando una piattaforma microfluidica automatica a gocce. Il flusso di lavoro integrato comprende quattro fasi chiave: costruzione di una libreria mutante tramite mutagenesi atmosferica e a temperatura ambiente (ARTP); incapsulamento a singola eccella ad alta efficienza e micro-coltivazione controllata all'interno di gocce in scala di picolitri; pico-iniezione precisa di un biosensore fluorescente, seguita da selezione delle gocce attivata dalla fluorescenza (FADS) per isolare gocce contenenti varianti ad alta produzione; e la validazione dei ceppi candidati selezionati tramite fermentazione a micropiastre e fiaschette a scossa. Un flusso di lavoro di screening completo e integrato è inteso come modello standardizzato, e la sua validazione è dimostrata attraverso l'isolamento di mutanti produttori di acido L-lattico ad alto rendimento di B. coagulans come esempio specifico. Questa piattaforma automatizzata e ad alta produttività di screening offre una potente soluzione tecnica con un potenziale significativo per accelerare la selezione industriale di ceppi ad alte prestazioni.
Introduzione
La biotecnologia industriale utilizza microrganismi ed enzimi come biocatalizzatori per produrre prodotti di valore su larga scala. Questo approccio è considerato più ecologico ed efficiente rispetto alla produzione chimica tradizionale. Tuttavia, le reti metaboliche naturali dei microrganismi si sono evolute per dare priorità alla propria sopravvivenza e riproduzione piuttosto che alla sintesi efficiente dei prodotti desiderata dagli esseri umani. Di conseguenza, è spesso necessario il miglioramento microbico ad alta produttività per soddisfare le esigenze degli ambienti produttivi industriali con condizioni <....
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Protocollo
Non era richiesta un'approvazione etica per questo studio. Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando colture microbiche pure e nessun soggetto umano o animale da laboratorio è stato coinvolto in questa ricerca. Consulta la Tabella dei Materiali per i dettagli su tutti i materiali utilizzati nel seguente protocollo.
1. Preparativi
ATTENZIONE: Segui le pratiche di biosicurezza. B. coagulans è un organismo di Biosicurezza Livello 1. Indossa guanti e camice da laboratorio. Esegui tutte le manipolazioni aperte all'interno di una ca....
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Risultati
Basandosi sulla piattaforma microfluidica automatica a gocce, è stato stabilito un modello di screening ad alta produttività. Una biblioteca mutante di B. coagulans è stata costruita tramite mutagenesi ARTP con un tempo ottimale di irradiazione di 20 s, che ha fornito un tasso di letalità di circa il 90% (Figura 4A). Le cellule mutanti sono state poi incapsulate in gocce di 14 pL, di circa 30 μm di diametro, a una velocità di generazione di 1500 Hz .......
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Discussione
Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standardizzato per lo screening microbico industriale basato su una piattaforma microfluidica automatica a gocce. Il flusso di lavoro integrato comprende la costruzione di librerie mutanti, la generazione di gocce e l'incapsulamento di singola cellula, la coltivazione di microreattori, l'iniezione di biosensori, la selezione delle gocce attivate dalla fluorescenza e la validazione finale dei ceppi bersaglio. Utilizzando lo screening ad alta .......
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Dichiarazioni
Xiaojie Guo e Liyan Wang sono dipendenti della Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., che produce la piattaforma microfluidica automatica a gocce e i chip microfluidici utilizzati in questo studio. La società dichiara di non avere interessi concorrenti in relazione a questo lavoro e di non aver avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, raccolta dati, analisi, interpretazione o preparazione dei manoscritti. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal progetto principale Advanced Materials-National Science and Technology (Grant n. 2024ZD0603600). Ulteriore supporto è stato fornito dal Guangdong S&T Program (Grant n. 2024B111130002).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214030 | Per la preparazione di piastre solide |
| Etanolo anidro | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | Pulizia e disinfezione di banchi e apparecchi di laboratorio |
| Plasma atmosferico e a temperatura ambiente (ARTP) | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | CP-002 | ARTP è stato impiegato per costruire la libreria mutante per la mutagenesi dei ceppi. |
| B. coagulans | Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC | 1511C0004000002355 | B. coagulans ATCC 7050 è stato utilizzato come ceppo di partenza per la mutagenesi e come obiettivo per lo screening a gocciolina ad alta produttività. |
| Micropiatto nero (96 pozzetti) | Corning | 3925 | Il micropiatto nero a 96 pozzetti è stato utilizzato per i saggi del sensore di lattato e per la determinazione della concentrazione di acido lattico. |
| Carbonato di calcio | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20011062 | Per isolare iperproduttori di acido L-lattico |
| Cloruro di calcio | Sinopharm | 10005819 | Il cloruro di calcio viene utilizzato per la preparazione del terreno di coltura microbica, fornendo nutrienti essenziali per la crescita microbica. |
| L-lattato di calcio | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 69027528 | Utilizzato come campioni per la preparazione della curva standard nel processo di rilevamento. |
| Tubo per centrifuga (15 mL) | Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd | HB53397 | Utilizzato per la diluizione del liquido batterico |
| Tubo di raccolta | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | DREMcell-CL | Per la raccolta delle goccioline e la successiva coltivazione |
| Computer | Lenovo | E450 | Installazione del software e controllo di DREM Cell. |
| DAPI | Solarbio | c0065 | Per la colorazione cellulare. |
| Piatto profondo (24 pozzetti) | BKMAMLAB | 110424008 | Per la verifica iniziale della resa dei mutanti di B. coagulans utilizzando piastre a pozzetti profondi |
| Demulsificante (1H,1H,2H,2H-Perfluoroottanolo) | MACKLIN | H817022 | Il demulsificante per goccioline viene utilizzato per rompere le microgoccioline di acqua in olio e rilasciare le cellule interne, i ceppi o il surnatante per la successiva rilevazione e analisi. |
| D-Glucosio | Solarbio | G8150-1000 | Il D-Glucosio viene utilizzato per la preparazione del terreno di coltura microbica, fornendo nutrienti essenziali per la crescita microbica. |
| Citrato di diammonio e idrogeno | Solarbio | D9950 | Il citrato di diammonio e idrogeno viene utilizzato per la preparazione del terreno di coltura microbica, fornendo nutrienti essenziali per la crescita microbica. |
| Fosfato dipotassico anidro | Sigma-Aldrich | P8281 | Il fosfato dipotassico anidro viene utilizzato per la preparazione del terreno di coltura microbica, fornendo nutrienti essenziali per la crescita microbica. |
| Versione del software DREM | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | DREMcell v02.01.18 | Per il controllo dello strumento DREM Cell. Il software DREM è un programma commerciale proprietario esclusivamente per lo strumento DREM Cell della Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. Non ha accesso ufficiale pubblico o URL di download e viene distribuito solo con lo strumento sotto autorizzazione. |
| Cello-sorter microfluidico di microgoccioline che intrappola le goccioline (DREM Cell) | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | CP-027 | È stato utilizzato per l'incapsulazione e la selezione ad alta produttività di singole cellule per lo screening rapido di ceppi ad alta resa dalla libreria mutante. |
| Chip per la generazione di goccioline | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | HC-03-009 | Il chip per la generazione di goccioline viene utilizzato per produrre goccioline monodisperse in scala picolitro (pL) per l'incapsulazione di singole cellule. |
| Chip per l'iniezione di goccioline | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | HC-03-003 | Il chip per l'iniezione di goccioline viene utilizzato per ottenere l'iniezione precisa e traccia di reagenti in goccioline preformate per le successive reazioni biochimiche. |
| Chip di ordinamento delle goccioline | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | HC-03-002 | Il chip di ordinamento delle goccioline viene utilizzato per ordinare le goccioline bersaglio contenenti cellule ad alta resa in base ai segnali di fluorescenza. |
| Bicchiere di Erlenmeyer per agitazione (250 mL) | Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd. | B-001006 | Utilizzato per la verifica della cultura su scala dei ceppi mutanti di B. coagulans dopo la selezione primaria con piastre a pozzetti profondi, al fine di confermare la stabilità e la riproducibilità dei ceppi ad alta resa. |
| Membrane filtranti (0,22 µm) | Merck | SLGPR33RB | Utilizzato per la filtrazione del brodo di fermentazione. |
| Microscopio a inversione fluorescente | Olympus | IX73 | Il microscopio a inversione fluorescente Olympus IX73 è stato utilizzato per osservare la morfologia batterica all'interno delle goccioline |
| Olio fluorurato | Bio-Rad | 1864006 | L'olio fluorurato serve come fase continua nella microfluidica a goccioline per generare microgoccioline di acqua in olio stabili, monodisperse e non interferenti, supportando la coltura e lo screening di singole cellule. |
| Colonna per cromatografia liquida ad alta prestazione | Bio-Rad | Bio-Rad Aminex HPX-87 | Viene utilizzato per separare l'acido lattico da altri componenti nel brodo di fermentazione in base alle loro diverse proprietà di ritenzione, al fine di realizzare il rilevamento quantitativo accurato dell'acido lattico. |
| Cromatografia liquida ad alta prestazione | Shimadzu | 228-34001-02 | L'HPLC viene utilizzata per il rilevamento quantitativo e l'analisi dell'acido L-lattico nei campioni di fermentazione. |
| Tubo di iniezione | Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | DREMcell-1N | Per l'iniezione della fase oleosa, della sospensione batterica campione e della soluzione di reagente |
| Solfato di ferro(III) eptaidrato | Solfato di ferro(III) eptaidrato | Solfato di ferro(III) eptaidrato | Solfato di ferro(III) eptaidrato |
| Cappuccio a flusso laminare | Shanghai SHP Instrument Equipment Co., Ltd | SP20230501 | Utilizzato per operazioni asettiche nella coltura e fermentazione di B. |
Riferimenti
- Zeng W, et al. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends Biotechnol. 2020;38(8):888-906.
- Sarnaik A, et al. High-throughput screening for efficient microbial biotechnology. Curr Opin Biotechnol. 2020;64:141-150.
- Li Z-H, et al. The advances of strategies and technologies in high-throughput microbial culturomics. Biotechnol Adv. 2026;87:108783.
- Zhou S, Alper HS. Strategies for directed and adapted evolution as part of microbial strain engineering. J Chem Technol Biotechnol. 2019;94(2):366-376.
- Xu L, Guo M, Jiang D, Jiang J, Lu L. Advances in high-throughput mutation breeding systems integrating atmospheric and room....
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Ristampe e permessi
