Screening ad alta produttività dei mutanti di Bacillo coagulante iperproduttore di acido lattico L-lattico utilizzando una piattaforma microfluidica automatica a gocce

Sommario

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standard ad alta produttività per lo screening dei microrganismi industriali. Consiste nella costruzione di una libreria mutante tramite mutagenesi ARTP, nell'esecuzione di screening positivo delle gocce con microfluidica automatizzata, e successivamente nella verifica dei risultati. L'affidabilità del flusso di lavoro è stata convalidata tramite lo screening di ceppi ad alta resa di B. coagulans .

Abstract

La bioproduzione industriale si basa su microrganismi per sintetizzare efficacemente i prodotti target in condizioni ingegnerizzate. Tuttavia, i ceppi di tipo selvatico spesso non hanno la capacità di farlo a causa delle loro reti metaboliche native. Pertanto, lo screening rapido e accurato di ceppi ad alte prestazioni provenienti da grandi librerie di mutanti è un passo fondamentale nell'allevamento microbico industriale. Negli ultimi anni, la tecnologia microfluidica a gocce ha attirato notevole attenzione per la sua alta produttività, basso consumo e capacità di compartimentazione a singola cella, portando allo sviluppo di numerosi sistemi di selezione a singola cella. In questo studio viene presentato un protocollo di screening ad alto rendimento per ceppi microbici industriali utilizzando una piattaforma microfluidica automatica a gocce. Il flusso di lavoro integrato comprende quattro fasi chiave: costruzione di una libreria mutante tramite mutagenesi atmosferica e a temperatura ambiente (ARTP); incapsulamento a singola eccella ad alta efficienza e micro-coltivazione controllata all'interno di gocce in scala di picolitri; pico-iniezione precisa di un biosensore fluorescente, seguita da selezione delle gocce attivata dalla fluorescenza (FADS) per isolare gocce contenenti varianti ad alta produzione; e la validazione dei ceppi candidati selezionati tramite fermentazione a micropiastre e fiaschette a scossa. Un flusso di lavoro di screening completo e integrato è inteso come modello standardizzato, e la sua validazione è dimostrata attraverso l'isolamento di mutanti produttori di acido L-lattico ad alto rendimento di B. coagulans come esempio specifico. Questa piattaforma automatizzata e ad alta produttività di screening offre una potente soluzione tecnica con un potenziale significativo per accelerare la selezione industriale di ceppi ad alte prestazioni.

Introduzione

La biotecnologia industriale utilizza microrganismi ed enzimi come biocatalizzatori per produrre prodotti di valore su larga scala. Questo approccio è considerato più ecologico ed efficiente rispetto alla produzione chimica tradizionale. Tuttavia, le reti metaboliche naturali dei microrganismi si sono evolute per dare priorità alla propria sopravvivenza e riproduzione piuttosto che alla sintesi efficiente dei prodotti desiderata dagli esseri umani. Di conseguenza, è spesso necessario il miglioramento microbico ad alta produttività per soddisfare le esigenze degli ambienti produttivi industriali con condizioni ^{rigorose 1,2,3}. Questo processo prevede la costruzione rapida di librerie di mutanti microbiche su larga scala tramite mutagenesi fisica o chimica, seguita dalla coltivazione e dalla rilevazione fenotipica di mutanti con genotipi distinti. Viene quindi selezionata solo una piccola frazione di ceppi superiori. Tuttavia, le tecnologie tradizionali di screening basate su placche e microplacche sono ostacolate da procedure ingombranti, basso rendimento e costi elevati. Questo collo di bottiglia, insieme al consumo significativo di consumabili e reagenti, porta a una bassa efficienza complessiva della selezione^{microbica 4,5}.

La microfluidica delle goccioline è recentemente emersa come una soluzione trasformativa a questa sfida. A differenza della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), che è poco adatta allo screening dei prodotti secreti a causa della rapida diffusione delle molecole lontano dalla cellula, la selezione delle gocce attivata dalla fluorescenza (FADS) racchiude singole cellule in microreattori compartimentati in scala^{picolitrica 6,7,8}. Questa isolazione fisica previene la competizione tra ceppi, consente l'accumulo localizzato di metaboliti secreti e ne consente il rilevamento quantitativo tramite biosensori fluorescenti. Di conseguenza, il FADS si è dimostrato una piattaforma ideale per lo screening ad alto rendimento di vari prodotti extracellulari, inclusi amminoacidi, acidi organici ed enzimi. Un team ha sviluppato il biosensore fluorescente geneticamente codificato GECFINDER e, combinato con FADS, ha selezionato con successo ceppi ad alto contenuto di produzione di fenilalanina e migliorato l'efficienza dello screening di oltre 1000 volte⁹. Un altro gruppo ha istituito una piattaforma di selezione delle gocce attivata dalla fluorescenza abbinata a un biosensore codificato geneticamente per lo screening ad alto rendimento di ceppi produttori di acido 3-deidroshikimico in E. coli, e il sistema FADS ottimizzato ha notevolmente migliorato l'efficienza dello screening e ha permesso l'isolamento dei ceppi mutanti con una produzione significativamente^{migliorata 10}. Alcuni ricercatori applicarono la tecnologia FADS all'ingegneria della polimerasi di DNA Bst, e i mutanti acquisiti con notevole termostabilità e attività di spostamento del filamento furono ulteriormente applicati alla rilevazione LAMP, riducendo il tempo di reazione da 40 minuti a 10 minuti¹¹.

Tuttavia, la traduzione di questi progressi tecnologici nei flussi di lavoro di routine per lo sviluppo della deformazione industriale rimane una sfida. Molti sistemi microfluidici a goccioline commerciali, nonostante il loro hardware sofisticato, non dispongono di una procedura operativa standard completa, intuitiva e riproducibile e adattata allo screening fenotipico microbico. Per colmare questa lacuna, è stata adottata una piattaforma microfluidica a gocce automatizzata che integra il controllo fluidico modulare, software intuitivo e progettazione standardizzata dei chip, ponendo una base tecnica ideale per l'istituzione di un flusso di lavoro di screening completamente integrato. Questo studio utilizza lo screening ad alta produttività di B. coagulans ad alto rendimento e produttori di acido L-lattico come caso di validazione. Basato su una piattaforma microfluidica a gocce, è stato stabilito il seguente flusso di lavoro, composto da quattro passaggi sequenziali chiave: (1) costruzione di una libreria mutante diversificata tramite mutagenesi atmosferica e a temperatura ambiente (ARTP); (2) incapsulamento monocellulare ad alta efficienza e micro-coltivazione controllata all'interno delle gocce in condizioni ottimizzate per la crescita di B. coagulans e la produzione di acido L-lattico; (3) pico-iniezione precisa di un biosensore fluorescente specifico per L-lattato, seguita da una selezione ad alta velocità delle gocce che incapsulano i produttori superiori; e (4) validazione rigorosa dei candidati selezionati tramite fermentazione a fiaschetta per confermare una maggiore produzione e stabilità genetica. Questo protocollo è destinato a ricercatori e ingegneri impegnati nell'allevamento microbico industriale che richiedono uno screening ad alto rendimento di prodotti extracellulari. È particolarmente adatto per batteri coltivabili che secernono metaboliti o enzimi di piccole molecole. La piattaforma di screening deve essere dotata di sensori compatibili con il microambiente delle gocce per consentire la rilevazione specifica dei metaboliti target. Per ceppi con requisiti di coltivazione speciali (ad esempio, anaerobi stretti), i parametri di coltivazione possono essere adattati per ottimizzare e stabilire una strategia di coltivazione dedicata. Stabilendo questo flusso di lavoro di screening standardizzato e a ciclo chiuso, questo studio mira a fornire una soluzione potente e trasferibile per accelerare l'allevamento industriale dei ceppi.

Protocollo

Non era richiesta un'approvazione etica per questo studio. Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando colture microbiche pure e nessun soggetto umano o animale da laboratorio è stato coinvolto in questa ricerca. Consulta la Tabella dei Materiali per i dettagli su tutti i materiali utilizzati nel seguente protocollo.

1. Preparativi

ATTENZIONE: Segui le pratiche di biosicurezza. B. coagulans è un organismo di Biosicurezza Livello 1. Indossa guanti e camice da laboratorio. Esegui tutte le manipolazioni aperte all'interno di una cappa a flusso laminare. Autoclave di tutti i materiali che entrano in contatto con cellule vive a 121 °C per 20 minuti prima dello smaltimento.

1. Fonte di deformazione e manutenzione
   1. Acquista B. coagulans ATCC 7050 da un centro di raccolta coltura commerciale come coltura inclinata di seconda generazione.
   2. Stendere una volta della coltura inclinata sull'agar del mezzo per semi e incubare a 50 °C per 24 ore. Scegli una singola colonia, inoculala in mezzo liquido per semi e coltiva a 50 °C, 200 giri/min per 12 ore.
   3. Mescola la coltura risultante con glicerolo sterile al 40% fino a una concentrazione finale del 25% (v/v) e conserva come scorte surgelate a –80 °C. Per ogni esperimento, scongelare una nuova aliquota, strisciarla sull'agar del mezzo per semi e incubare a 50 °C per 24 ore.
   4. Poi si raccoglie una singola colonia, si inocula in un mezzo liquido per semi e si coltura a 50 °C, 200 giri/min per 12 ore prima di usarla per mutagenesi e screening (Figura supplementare 1).
2. Sensore di acido lattico
   1. Esprimi e purifica il sensore eLACCO1.1 come descritto nei Materiali^{Supplementari 12} (Figura Supplementare 2).
   2. Integrare il sensore purificato con glicerolo al 5% (v/v) e conservarlo a –80 °C. Per ogni esperimento, scongelare una aliquota su ghiaccio e diluirla immediatamente con 10 mM PBS sterile (pH 7,4) fino a una concentrazione finale di lavoro di 0,1 mg/mL.
3. Preparazione dei mezzi culturali
   1. Mezzo seme (g/L: glucosio 20, estratto di lievito 5, triptone 10, acetato di sodio 2, citrato di sodio 2, K₂HPO₄ 2, MgSO_{4,7H 2}O 0,2, MnSO₄· H₂O 0,05, FeSO 4,7H₂O 0,01). Sterilizza il glucosio separatamente come un brodo da 200 g/L a 115 °C per 20 minuti.
      1. Autoclave i componenti rimanenti a 121 °C per 15 minuti. Dopo il raffreddamento, aggiungere il contenuto di glucosio sterile a una concentrazione finale di 20 g/L, poi filtrare e sterilizzare gli oligoelementi.
      2. Conserva il mezzo intero a 4 °C per un massimo di una settimana. Da usare per l'attivazione notturna, preparazione dell'inoculo.
   2. Mezzo di screening (g/L: glucosio 20, estratto di lievito 6,66, NaCl 0,333, NH₄Cl 0,665, KH₂PO₄ 2, Na₂HPO₄ 4,46, MgSO₄ 0,12, CaCl₂ 0,074).
      1. Sterilizza il glucosio separatamente a 115 °C per 20 minuti. Autoclave la miscela di sale/estratto di lievito a 121 °C per 15 minuti.
      2. Dopo il raffreddamento, aggiungi il deposito di glucosio sterile a 20 g/L. Conserva a 4 °C per un massimo di una settimana. Utilizzato come fase acquosa per la generazione delle goccioline e come mezzo di coltura all'interno delle goccioline durante l'incubazione di 10 ore.
   3. Mezzo di fermentazione (g/L: glucosio 90, triptone 13,33, estratto di lievito 13,33, acetato di sodio 0,67, NaCl 0,0133, MgSO_4,7H₂O 0,0133, MnSO₄· H₂O 0,0133, FeSO 4,7H ₂O 0,0133).
      1. Sterilizza il glucosio come brodo da 500 g/L a 115 °C per 20 minuti. Autoclave gli altri componenti a 121 °C per 15 minuti.
      2. Dopo il raffreddamento, aggiungi il deposito di glucosio sterile a 90 g/L. Aggiungi polvere sterile di_{CaCO 3} (4% w/v) poco prima dell'inoculazione al pH tamponante. Prepara fresco ogni giorno. Da utilizzare per lo screening primario a micropiastre e la validazione con fiaschette.
         NOTA: Prepara tutti i mezzi con acqua distillata fino a un volume finale di 1 L. Regola il pH a 6,5 con 1 M HCl.

2. Costruzione di una biblioteca mutante usando ARTP

ATTENZIONE: Il funzionamento ARTP prevede un plasma ad alta frequenza e una lampada UV. Le radiazioni UV possono causare lesioni agli occhi e alla pelle. La scarica del plasma genera ozono e alte temperature. Tieni sempre la porta della camera chiusa mentre il plasma è acceso. Indossa un camice da laboratorio e occhiali protettivi UV. Usa solo elio puro al 99,999%; Assicurati una ventilazione adeguata. Dopo ogni operazione di mutagenesi, si pulisce il banco da lavoro e le pareti interne della camera di mutagenesi con un panno privo di pelucchi immerso in etanolo al 75% (v/v). L'etanolo al 75% è altamente infiammabile. Stai lontano da fiamme aperte, scintille e superfici calde.

1. Stabilire una curva standard che corrisponda OD₆₀₀ alla concentrazione cellulare vitale.
   1. Inoculare una singola colonia di B. coagulans nel mezzo seme e incubare a 50 °C, 200 giri/min per 12 ore fino a quando la coltura non raggiunge la fase mediologitmica.
   2. Preparare diluizioni seriali della sospensione batterica a gradienti di 10⁴, 10⁵ e 10⁶.
   3. Pipetta 100 μL di ogni diluizione e distribuisci uniformemente sulle piastre agar del mezzo seme in triplice.
   4. Incubare tutte le placche di agar placcate a 50 °C per 24 ore.
   5. Contare le unità formanti di colonie (CFU) per ogni diluizione.
      NOTA: La calibrazione mostra che OD₆₀₀ = 0,5 corrisponde a circa 1 × 10⁸ CFU/mL. Utilizzare questa relazione per determinare la densità cellulare iniziale per l'incapsulamento delle gocce (Figura supplementare 3).
2. Coltura B. coagulans fino alla fase logaritmica media-tarda, poi diluisce la coltura dei semi freschi a OD₆₀₀ = 0,05 nel substrato fresco per semi.
3. All'interno di una cappa a flusso laminare, preparare otto piccoli dischi metallici sterili e un grande disco metallico. Fiamma gli otto piccoli dischi su un bruciatore ad alcol per 1 minuto, mettili sul disco grande sterile e lasciali raffreddare per 10 minuti.
4. Utilizzando una micropipetta, distribuire uniformemente 10 μL della sospensione batterica diluita su ciascuno degli otto piccoli dischi raffreddati.
5. Trasferire il grande disco che trasporta i piccoli dischi inoculati in una piastra di Petri sterile.
6. Accendi lo strumento ARTP e attiva la schermata di controllo principale. Accendi la lampada UV all'interno della camera di mutagenesi. Avvia il raffreddatore e pre-raffredda per 20 minuti finché la temperatura non si stabilizza a 20 °C.
7. Apri rapidamente la porta della camera mutagenesi e metti i piccoli dischi all'interno.
8. Utilizzando pinze sterili, trasferisci sequenzialmente ogni piccolo disco sulla fase di campionamento ARTP.
   NOTA: La potenza RF, la portata di gas elio, la distanza ugelo-campionamento e la purezza dell'elio erano fissi rispettivamente a 120 W, 10 SLM, 2 mm e 99,999%. Il tempo di irraggiamento dell'elio era impostato rispettivamente a 5, 10, 15, 20, 25 e 30 secondi.
9. Sottoporre ogni piccolo disco alla mutagenesi ARTP secondo i parametri impostati. Dopo l'irradiazione, trasferire tutti i dischi in un tubo centrifuga da 50 mL contenente 10 mL di mezzo di recupero. Incubare a 50 °C con scuotere a 200 giri/min per 4 ore per permettere il recupero e la crescita cellulare.
10. Determinazione del tasso di letalità.
    1. Diluire serialmente la coltura recuperata a un gradiente da ^10-2 a ^10-6.
    2. Spargere 100 μL di ogni diluizione su piastre di agar del mezzo seme e preparare tre repliche per ogni diluizione.
    3. Incubare tutte le piastre a 50 °C per 24 ore.
    4. Contare le colonie e calcolare il corrispondente CFU/mL.
    5. Calcola il tasso di letalità usando la formula:
       (1)
       NOTA: Esegui l'esperimento in triplicata per ogni momento temporale. Il tempo ottimale di mutagenesi per l'ARTP in questo caso è di 20 s (Figura Supplementare 4).

3. Composizione della piattaforma microfluidica automatica delle goccioline e dei consumabili

1. Sistema di attuazione (Figura 1)
   NOTA: È composto da 3 canali di controllori di pressione ad alta precisione con un intervallo di pressione da 0 a 1000 mbar e un tempo di risposta a pressione di < 50 ms (Figura 1A).
2. Sistema di imaging
   NOTA: L'imaging microscopico CMOS ad alta velocità presenta acquisizione dati ad alta velocità di ≥ 2 GB/s, un frame rate da 0 a 20.000 fps e una risoluzione massima di 1280 x 860. Il sistema dispone di autofocus per l'osservazione in tempo reale del movimento delle goccioline e supporta la registrazione di immagini e video, che possono essere esportati in più formati, tra cui BMP, AVI, MP4 e TIF.
3. Sistema di rilevamento
   NOTA: Consente il rilevamento del segnale fluorescente con 2 laser: 488 nm e 633 nm, e 2 canali di rilevamento.
4. Sistema di controllo host
   NOTA: Controllato dal software automatico della piattaforma microfluidica delle gocce, il sistema integra più moduli, tra cui attuazione dei fluidi, imaging microscopico, eccitazione e rilevamento, generazione di gocce, pico-iniezione e smistamento. Supporta inoltre l'acquisizione, la registrazione, l'archiviazione, la visualizzazione e l'esportazione dei dati sperimentali. Sono mostrate le unità operative parziali della piattaforma microfluidica automatica a gocce (Figura 1B).
5. Consumabili
   NOTA: I consumabili utilizzati in questo protocollo includono: tubo di iniezione per la fase oleosa, campione e reagente (Figura 2A); tubo di raccolta per l'incubazione delle gocce (Figura 2B); chip di generazione di gocce (Figura 2C); chip di iniezione pico-gocciolata (Figura 2D); e chip di selezione delle gocce (Figura 2E).

4. Generazione di gocce

ATTENZIONE: Pulire la piattaforma microfluidica automatica a gocce. Dopo ogni esperimento, pulire lo stadio, il portatrucioli e eventuali aree di fuoriuscita con etanolo al 75% usando salviette senza lanugine. Rimuovere residui di olio fluorato, sospensione cellulare o soluzione sensore.

1. Incapsulamento a singola cellula. Per ottenere λ = 0,1 in gocce da 14 pL, si diluisce la sospensione batterica a OD₆₀₀ ≈ 0,04 (OD₆₀₀=0,5 corrisponde a 1 × 10⁸ CFU/mL). Secondo la distribuzione di Poisson:
   (2)
   Quando λ = 0,1, il 90,5% delle gocce è vuoto, il 9,1% contiene una singola cella e lo 0,4% contiene più celle.
   NOTA: In questo caso, l'efficienza misurata dell'incapsulamento a singola cella è stata dell'11,2% (Figura Supplementare 5). Il numero di celle per goccia può essere determinato tramite colorazione DAPI. Quando λ = 0,1 e il tasso di incapsulamento multicellulare supera l'1%, la OD₆₀₀ dovrebbe essere ridotta per diminuire la proporzione di goccioline contenenti più cellule.
2. Pipetta 300 μL di olio fluorurato nella fiala di ingresso della fase oleosa. Pipetta 500 μL della sospensione batterica nella fiala di ingresso della fase acquosa.
3. Togli il nastro che copre la superficie del chip di generazione delle gocce. Collega la fiala di petrolio, la fiala campione e la fiala di raccolta ai pozzi corrispondenti del chip in sequenza.
4. Metti il chip sul palco e fissalo. Collega i tubi dell'aria alle fiale di ingresso uno per uno secondo le etichette del percorso del gas.
5. Apri il software automatico della piattaforma microfluidica a gocce. Regola la manopola di movimento dello stadio secondo le direzioni delle frecce sul chip per spostare il campo visivo verso il sito di generazione delle gocce.
6. Clicca su "Start" nell'interfaccia "Generazione di gocce" del software automatico della piattaforma microfluidica delle gocce (Figura 3A). Nell'interfaccia di imaging, trascina i cursori dell'"asse Z" e della luminosità della sorgente luminosa per regolare la nitidezza e la luminosità dell'immagine.
7. Clicca sui pulsanti "+" e "-" di "Velocità delle gocce" e "Dimensione delle gocce" per regolare la velocità di generazione e la dimensione delle gocce.
   NOTA: In questo caso, la pressione della fase oliosa e la pressione della fase del campione per la generazione delle goccioline sono impostate automaticamente a 300 mbar e 400 mbar, rispettivamente, per raggiungere una velocità di generazione di 1500 Hz. Con queste impostazioni, le gocce hanno un volume di 14 pL, con il diametro delle goccioline mantenuto sotto il 5%, garantendo una dimensione costante delle gocce e operazioni affidabili a valle.
8. Aspetta 1 minuto finché l'attrezzatura si stabilizza e lo stato di generazione delle gocce rimane costante. Sostituisci rapidamente la fiala di raccolta per iniziare la raccolta delle gocce.
   NOTA: Pre-aggiungere una piccola quantità di olio fluorurato al nuovo tubo di raccolta per coprire la porta inferiore del tubo di Teflon, assicurandosi che le gocce non entrino in contatto diretto con la parete del tubo e causino fusione.
9. Interrompi la raccolta delle gocce dopo 30 minuti di operazione. Clicca su "Stop" nella finestra pop-up per confermare l'arresto della generazione di goccioline.
10. Rimuovi delicatamente il tubo di raccolta dal chip. Posiziona il tubo e la fiala di raccolta verticalmente e attendi che le gocce nel tubo entrino nella fiala di raccolta.
11. Rimuovi il chip, la fiala di ingresso in fase oleosa e la fiala di ingresso in fase acquosa dalla fase. Strofina la superficie del palco con alcol al 75%. La fase di generazione delle gocce viene quindi completata.

5. Coltivazione delle gocce

1. Aggiungi 1 mL di olio minerale al tubo di raccolta.
   NOTA: Lo strato di olio minerale copre la sospensione delle gocce per minimizzare l'evaporazione e ridurre l'esposizione all'ossigeno, consentendo comunque uno scambio gassoso sufficiente per l'anaerobio facoltativo B. coagulans.
2. Posiziona il tubo di raccolta in posizione verticale in un tubo centrifugo da 15 mL contenente acqua sterile. Tieni il tubo di raccolta ben coperto e incuba a 45 °C per 10 ore.
   NOTA: Dopo l'incubazione, assicurarsi che il diametro CV delle gocce sia del <10% e che non si osservi coalescenza delle gocce. Scartare i lotti se questi criteri non sono soddisfatti.

6. Pico-iniezione di gocce

ATTENZIONE: L'alta tensione viene applicata agli elettrodi del chip tramite la connessione dello strumento durante l'iniezione pico-iniezione. Il campo elettrico può causare una forte scossa elettrica. Non toccare gli elettrodi o la superficie del chip con utensili metallici o a mani nude mentre l'alta tensione è attiva. Disattiva sempre l'uscita ad alta tensione prima di maneggiare il chip. Indossa guanti isolati e usa strumenti non conduttivi.

1. Prepara la fiala di ingresso della fase oliosa. Nella cappa a flusso laminare, si pipettano 300 μL di olio fluorurato nella fiala di ingresso della fase oliosa.
2. Prepara la fiala di aspirazione del campione. Rimuovi il tappo della fiala di presa dal tubo di raccolta che contiene le gocceline. Sostituiscila con un nuovo cappuccio.
3. Taglia la punta della nuova fiala di ingresso. Taglia una piccola porzione dall'estremità anteriore della nuova fiala di ingresso in modo che la punta raggiunga sotto il livello liquido delle gocce nella fiala campione.
4. Stringi il tappo. Fissa bene il tappo per evitare perdite.
5. Prepara la fiala di ingresso del reagente. Pipetta 500 μL del sensore di acido lattico nella fiala di ingresso del reagente.
6. Aggiungi PBS alla fiala di ingresso del reagente. Contemporaneamente, aggiungere 500 μL di buffer PBS sterile allo stesso fiale di ingresso del reagente.
   NOTA: In questo esperimento viene aggiunto un buffer PBS per bilanciare il pH delle gocceline. La concentrazione finale di lavoro del sensore di lattato era di 0,1 mg/mL, e il volume di carico del sensore di lattato era di 500 μL.
7. Usa una lama per tagliare il nastro che ricopre i pozzi degli elettrodi per esporre gli elettrodi. Imposta il multimetro in modalità continuità e testa la connessione del circuito e lo stato del cortocircuito del chip.
   NOTA: Se il multimetro mostra una connessione normale del circuito degli elettrodi del chip, si proceda al passaggio successivo. Se il circuito è aperto, sostituisci il chip di iniezione e prova di nuovo.
8. Dopo aver confermato la connessione normale del circuito con il multimetro, stacca il nastro sulla superficie del chip. Collega la fiala di petrolio, la fiala campione, la fiala del reagente e la fiala di raccolta ai corrispondenti pozzi del chip in sequenza.
9. Metti il chip sul palco e fissalo. Collega i tubi dell'aria alle fiale di ingresso uno per uno secondo le etichette del percorso del gas.
10. Apri il software automatico della piattaforma microfluidica a gocce. Regola la manopola di movimento dello stadio secondo le direzioni delle frecce sul chip per spostare il campo visivo verso l'area dell'elettrodo del chip a goccia.
11. Clicca su "Start" nell'interfaccia "Droplet Pico-injection" del software automatico della piattaforma microfluidica delle gocce (Figura 3B). Nell'interfaccia di imaging, trascina i cursori dell'"asse Z" e della luminosità della sorgente luminosa per regolare la nitidezza e la luminosità dell'immagine.
    NOTA: A questo punto, lo strumento regola automaticamente la pressione della pompa in fase olio-olio a 400 mbar, quella della fase campione a 420 mbar e quella della pompa in fase di iniezione reagenti a 450 mbar.
12. Nella fase iniziale di funzionamento, un segmento d'aria nel catetere viene scaricato nel chip, un fenomeno normale che dura diversi minuti.
13. Aspetta che le gocce entrino nel campo visivo. Clicca su "Inizia la Pico-iniezione". A questo punto, il campo elettrico dell'apparecchiatura sarà attivato. Regola la velocità di generazione delle gocce, la distanza tra le gocce e il volume di iniezione cliccando sui pulsanti "+" e "-" di "Velocità delle gocce", "Spaziatura delle gocce" e "Volume di iniezione".
    NOTA: Il campo elettrico è impostato sulla marcia massima predefinita. Se le goccioline si rompono nella regione del campo elettrico durante il processo di fusione, si passa a marcia media o bassa. In questo caso, la velocità di iniezione delle goccioline era di 200 Hz.
14. Osserva nel software di visualizzazione delle immagini ad alta velocità. Se le gocce possono iniettare stabilmente nel sensore di acido lattico con un rapporto 1:1, attendi 5 minuti che l'apparecchiatura si stabilizzi. Sostituisci rapidamente la fiala di raccolta per iniziare la raccolta delle gocce.
15. Dopo un'iniezione stabile per 2 ore, clicca su "Stop" per terminare la picoiniezione delle gocce.
16. Rimuovi delicatamente il tubo di raccolta dal chip. Posiziona il tubo e la fiala di raccolta verticalmente e attendi che le gocce nel tubo entrino nella fiala di raccolta.

7. Selezione delle gocce

ATTENZIONE: Il demulsificante è un irritante e può causare irritazione alla pelle e agli occhi. È anche dannoso se inalato o ingerito. Indossa sempre l'attrezzatura di protezione personale adeguata (guanti, camice da laboratorio, occhiali di sicurezza). Maneggia il demulsificante in un'area ben ventilata o in una cappa a respiro. Raccogli il demulsificante di scarto in un contenitore separato, chiaramente etichettato. Non versare nel lavandino.

1. Nella cappa a flusso laminare, si pipettano 300 μL di olio fluorurato e si aggiunge alla fiala di ingresso della fase oleosa. Sostituire il tappo della fiala di presa del tubo di raccolta contenente gocce microiniettate con un nuovo tappo.
   NOTA: Prima di eseguire esperimenti di selezione delle gocce, prendi 5 μL di gocce e osservale al microscopio a fluorescenza. Misurare il diametro di almeno 200 gocce; procedere solo se il CV < 10%.
2. Usa una lama per tagliare il nastro che ricopre i pozzi degli elettrodi per esporre gli elettrodi. Imposta il multimetro in modalità continuità e testa la connessione del circuito e lo stato del cortocircuito del chip.
3. Dopo aver confermato la connessione normale del circuito con il multimetro, stacca il nastro sulla superficie del chip. Collegare la fiala di petrolio, la fiala campione e la fiala di raccolta di smistamento ai corrispondenti pozzi del chip in sequenza.
4. Metti il chip sul palco e fissalo. Collega i tubi dell'aria alle fiale di ingresso uno per uno secondo le etichette del percorso del gas.
5. Apri il software di imaging ad alta velocità. Regola la manopola di movimento dello stadio secondo le direzioni delle frecce sul chip per spostare il campo visivo verso l'area dell'elettrodo del chip a goccia.
6. Clicca su "Start" nell'interfaccia "Scattering delle gocce" del software automatico della piattaforma microfluidica delle gocce. Nell'interfaccia di imaging, trascina i cursori dell'"asse Z" e della luminosità della sorgente luminosa per regolare la nitidezza e la luminosità dell'immagine.
   NOTA: Dopo aver cliccato su "Start", lo strumento regola automaticamente la pressione della pompa dell'olio a 300 mbar e quella della pompa del campione a 190 mbar, ottenendo una velocità di 100 Hz.
7. Nella fase iniziale di funzionamento, un segmento d'aria nel catetere viene scaricato nel chip, che dura diversi minuti ed è un fenomeno normale.
8. Clicca per selezionare "Laser" e scegli il canale di rilevamento a 488 nm.
   NOTA: Il personale sperimentale può selezionare un laser da 488 nm, un laser da 633 nm o una combinazione di entrambi, a seconda del disegno di rilevamento sperimentale. Potenza laser: 20 mW.
9. Clicca su "Registrazione dati". Lo strumento inizierà ad acquisire segnali di fluorescenza a gocce (Figura 3C).
   NOTA: Raccogliere segnali di fluorescenza da 50.000 a 100.000 gocce; Lo strumento ordinerà automaticamente i valori del segnale e genererà un istogramma del segnale di fluorescenza.
10. In base all'istogramma del segnale di fluorescenza generato, si imposta la soglia di ordinamento allo 0,1% superiore dei segnali di fluorescenza totali e si raccolgono gocce con valori di segnale di fluorescenza superiori a questa soglia.
    NOTA: In questo caso, il cancello di selezione era impostato per raccogliere goccioline con intensità di fluorescenza > 2750 (u.a.), che corrispondeva allo 0,1% superiore delle goccioline.
11. Clicca di nuovo su "Registrazione dati". Lo strumento registrerà nuovamente i segnali di fluorescenza delle gocce rimanenti e ordinerà le gocce bersaglio in base alla soglia fissata nella Sezione 7.10.
    NOTA: I segnali a gocce rimanenti saranno anch'essi automaticamente ordinati e tracciati come un istogramma di fluorescenza.
12. Dopo aver selezionato la regione delle gocce bersaglio, attiva l'"Interruttore di Smistamento" e imposta il valore "Forza di flessione". L'attrezzatura inizierà a selezionare le gocce.
    NOTA: Lo strumento fornisce tre livelli selezionabili di intensità di campo elettrico (Alto, Medio, Basso). Per gocce maggiori di 30 μm, selezionare Alta; per gocce inferiori a 25 μm, selezionare Medio o Basso. Questo garantisce una deflessione stabile e un'efficienza ottimale di ordinamento.
13. Dopo che l'attrezzatura si è stabilizzata per 5 minuti, rimetti la fiala di raccolta per raccogliere gocce positive.
    NOTA: Durante l'ordinamento, lo strumento misura continuamente l'intensità di fluorescenza di ogni goccia in tempo reale e la confronta con la soglia preimpostata. Solo le goccioline con intensità di fluorescenza superiore alla soglia vengono deviate e raccolte nel tubo di raccolta positivo. Una goccia è considerata positiva se lo strumento mostra un segnale di fluorescenza che supera la soglia di selezione e, contemporaneamente, si osserva una deviazione delle gocce nell'interfaccia di imaging, confermando che la goccia è stata diretta con successo nel canale di raccolta positiva.
14. Smettere di selezionare le gocce dopo 4 ore di funzionamento stabile. Clicca su "Stop" nell'interfaccia "Ordinamento delle gocce".
15. Rimuovi delicatamente il tubo di raccolta dal chip. Posizionare il tubo e la fiala di raccolta verticalmente per assicurarsi che le gocce nel tubo entrino nella fiala di raccolta.
16. Dopo aver completato la raccolta delle gocce, clicca sul diagramma a scatter per salvare il diagramma a scatter dell'esperimento, i valori del segnale di fluorescenza delle gocce positive ordinate e i valori del segnale di fluorescenza di tutte le gocce.
17. Rimuovi il chip, la fiala di ingresso della fase oliosa, la fiala campione e la fiala del reagente dalla fase. Chiudi il software.
18. Deemulsificazione delle gocce. Aggiungi 500 μL di 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottanolo nel tubo di raccolta delle gocceline. Aspettare 5 minuti, poi aggiungere 500 μL di mezzo di schermo fresco per il recupero.
    NOTA: Non scuotere vigorosamente il tubo di raccolta dopo aver aggiunto il demulsificante; Mescola delicatamente. Dopo la demulsificazione delle gocce, si formerà un'interfaccia chiara tra la fase acquosa e quella oleosa.
19. Prendi 20 μL della sospensione batterica demulsificata, diluisci di 10 volte e spargili su due piastre di agar. Incubare a 50 °C per 2 giorni.
    NOTA: Il fattore di diluizione può essere regolato in base al numero di gocce raccolte. In questo caso, sono state ottenute circa 400 singole colonie dalle due lastre.

8. Esportazione dati

1. Clicca sul grafico del segnale di fluorescenza nell'area vuota dell'interfaccia di ordinamento software. Seleziona per salvare il grafico a scatter del segnale di fluorescenza delle gocce, l'istogramma del segnale di fluorescenza e il foglio Excel del segnale di fluorescenza, che contengono i valori registrati dell'intensità di fluorescenza del numero totale di gocce, così come i valori di intensità di fluorescenza delle gocce positive schermate.

9. Screening primario delle microplacche

1. Scegli colonie singole a caso.
2. Inoculare la piastra profonda a 24 pozzi per la coltura di espansione. Raccogli ogni colonia selezionata e inoculala in un pozzo di una piastra di 24 pozzi profondi contenente 2 mL di mezzo di fermentazione. Usa un annello di inoculazione.
3. Sigilla la piastra profonda a 24 pozzi con una membrana non traspirante.
   NOTA: Non usare una membrana traspirante. Provoca l'evaporazione del mezzo di coltura.
4. Incuba la cultura dell'espansione. Posizionare la piastra sigillata a 24 pozzi profondi in un incubatore a scuotimento a 50 °C, 200 giri/min per 24 ore.
5. Sottocoltura per la validazione della fermentazione. Dopo 24 ore, trasferire 200 μL di coltura da ciascun pozzo in una piastra fresca di 24 pozzi profondi contenente 1,8 mL di mezzo di fermentazione (inoculo v/v al 10%). Aggiungere CaCO₃ sterile a una concentrazione finale del 4% (p/v) in ciascun pozzo prima dell'inoculazione per tamponare il pH.
6. Includi i controlli. In ogni piastra fresca da 24 pozzi profondi, riempire tre pozzi selezionati casualmente con il ceppo parentale ATCC 7050 come controlli negativi. Processale in modo identico alle varianti candidate.
7. Sigilla la piastra profonda a 24 pozzi con una membrana non traspirante.
8. Incubare la piastra profonda a 24 pozzi. Posiziona la piastra sigillata in un incubatore a 50 °C, 200 giri/min per 24 ore.
9. Prepara i campioni per la rilevazione del lattato. Centrifuga la piastra a 5.842 × g per 10 minuti. Trasferire 10 μL del sovrantante su una micropiastra nera a 96 pozzi e diluire con 990 μL di acqua ultrapura. Mescola bene.
10. Aggiungi il sensore di lattato. Aggiungi 100 μL del campione diluito in ciascun pozzetto di una nuova piastra nera da 96 pozzi. Poi aggiungi 100 μL del sensore di acido lattico. Mescola delicatamente.
11. Misura la fluorescenza. Incubare il piatto a temperatura ambiente per 5 minuti (protetto dalla luce). Misurare la fluorescenza usando un lettore di microplacche con eccitazione a 485 nm ed emissione a 515 nm.
12. Imposta la soglia di selezione dei colpi. Calcola la fluorescenza media dei tre pozzi di controllo parentale (genitore) e la deviazione standard (SD_parent). Definisci la soglia come F_parent + 3 × SD_parent.
13. Identifica i colpi primari. Una variante candidata è considerata un colpo primario se il suo segnale di fluorescenza supera la soglia. Registra il numero di risultati primari per la validazione a valle.

10. Validazione secondaria di ceppi ad alto rendimento

ATTENZIONE: La fase mobile contiene acido solforico diluito (5 mM), che è corrosivo. Evita il contatto con la pelle e l'inalazione. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata (guanti, camice da laboratorio, occhiali di sicurezza). Prepara e maneggia la fase mobile in un'area ben ventilata o in una cappa a fumi. Raccogli tutti i rifiuti contenenti acidi in un contenitore dedicato per lo smaltimento corretto. Non versare nel lavandino.

1. Prepara la coltura dei semi. Striscia le strade di colpo primario sulle piastre di agar del mezzo seme. Incubare a 50 °C per 24 ore. Scegli una singola colonia da ogni piastra e inoculala in 30 mL di mezzo liquido per semi in una fiaschetta da 250 mL. Incubare a 50 °C, 200 giri/min per 12 ore.
2. Prepara la fermentazione. Prepara il mezzo di fermentazione e aggiungi polvere sterile di CaCO3 a una concentrazione finale del 4% (p/v) come neutralizzatore del pH. Trasferire 5 mL della coltura dei semi in 45 mL di questo mezzo in una fiaschetta Erlenmeyer da 250 mL (inoculo al 10% v/v; volume finale di lavoro 50 mL).
   NOTA: Utilizzare tre fiaschette indipendenti per ogni ceppo candidato e per il ceppo parentale ATCC 7050 come controllo.
3. Incuba le fiasche. Posiziona le fiaschette in un incubatore a 50 °C, 200 giri/min. Fermenta per 24 ore.
4. Raccogli campioni. Dopo 24 ore, preleva 1 mL di coltura da ogni fiaschetta. Centrifuga a 13.800 × g per 2 minuti. Diluire il sovrandanante 100 volte con acqua ultrapura e filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm.
5. Prepara condizioni HPLC. Usa una colonna Aminex HPX-87H. Preparare la fase mobile: 5 mM H₂SO₄ in acqua ultrapura, filtrare attraverso una membrana da 0,22 μm e degas tramite sonicazione. Imposta la temperatura della colonna a 40 °C, la portata a 0,6 mL/min, il volume di iniezione a 20 μL e la durata di funzionamento a 20 min per campione (l'acido lattico elude a ~12,600 min). Usa un rilevatore di indice di rifrazione (RID).
6. Prepara la curva standard. Sciogliere il L-lattato di calcio in acqua ultrapura per preparare soluzioni standard di 0, 0,4, 0,8, 1,2 e 1,6 g/L (espresse come L-lattato di calcio). Iniettare ogni standard in triplice.
   NOTA: Traccia l'area di picco rispetto alla concentrazione e ottieni l'equazione di regressione lineare (R² > 0,999). Esegui standard all'inizio e alla fine di ogni lotto di campione per correggere la deriva.
7. Inietta i campioni. Iniettare i soprantativi di fermentazione filtrati (20 μL) nel sistema HPLC. Registra l'area del picco per il picco del L-lattato di calcio.
   NOTA: Iniettare un campione di controllo qualità (1 g/L di L-lattato di calcio) ogni 10 campioni per monitorare la stabilità del sistema. Lo spostamento di tempo di ritenzione accettabile è <0,2 min e la variazione dell'area di picco <5% rispetto allo standard di calibrazione iniziale.
8. Calcola la resa dell'acido L-lattico. Interpola l'area di picco di ciascun campione nella curva standard per ottenere la concentrazione di L-lattato di calcio (g/L).
   NOTA: Converti in concentrazione di acido L-lattico usando il rapporto di peso molecolare:
   (3)
   Calcola la percentuale di miglioramento:
   (4)
9. Identifica le ultime varietà ad alto rendimento. Seleziona i ceppi che mostrano costantemente una resa di acido L-lattico superiore rispetto al ceppo parentale come mutanti validati. Scegli il miglior interprete per una caratterizzazione più approfondita.

11. Valutazione della stabilità genetica di ceppi ad alta resa

1. Striscia il ceppo mutante selezionato sulle piastre di agar del mezzo per semi. Incubare a 50 °C per 24 ore. Questa è la prima generazione.
2. Prendi una singola colonia dal piatto di generazione 1 e inoculala in 5 mL di mezzo liquido per semi in un tubo da 50 mL. Incubare a 50 °C, 200 giri/min per 12 ore per ottenere la coltura dei semi F1.
3. Trasferire il 10% (v/v) della coltura di semi di prima generazione in 50 mL di mezzo di fermentazione (contenente 4% di CaCO₃ sterile in w/v) in una fiaschetta da 250 mL. Incubare a 50 °C, 200 giri/min per 24 ore.
4. Raccogli 1 mL di coltura dopo la fermentazione. Centrifugare a 13.800 × g per 2 minuti, diluire il sovrantato 100 volte con acqua ultrapura e misurare la concentrazione di acido L-lattico tramite HPLC. Usa tre fiaschette indipendenti per ogni generazione.
5. Per ottenere la generazione successiva, sfila un anello della coltura di prima generazione su una piastra di agar fresco per semi. Incubare a 50 °C per 24 ore. Ripeti i passaggi 11.2 e 11.3 per la seconda generazione.
6. Ripeti il processo di subcultura per ottenere la generazione 3 e la generazione 4. Per ogni generazione, preparare tre fiaschette agitate e misurare la produzione di acido lattico tramite HPLC.
7. Confrontare i rendimenti delle quattro generazioni (1–4) utilizzando un ANOVA unidirezionale o il test t di Student. Il ceppo è considerato geneticamente stabile se non si osservano differenze significative (p > 0,05) nella produzione di acido lattico tra le generazioni.

Risultati

Basandosi sulla piattaforma microfluidica automatica a gocce, è stato stabilito un modello di screening ad alta produttività. Una biblioteca mutante di B. coagulans è stata costruita tramite mutagenesi ARTP con un tempo ottimale di irradiazione di 20 s, che ha fornito un tasso di letalità di circa il 90% (Figura 4A). Le cellule mutanti sono state poi incapsulate in gocce di 14 pL, di circa 30 μm di diametro, a una velocità di generazione di 1500 Hz (Figura 4B). Dopo l'incubazione a 45 °C per 10 ore, il sensore veniva iniettato con pico-iniezione in ogni goccia a una velocità di 200 Hz (Figura 4C). La selezione delle gocce attivata dalla fluorescenza è stata eseguita a 100 Hz utilizzando un laser da 488 nm (Figura 4D). Le gocce positive selezionate sono state demulsificate e sono state selezionate singole colonie per la validazione. Le colonie raccolte furono inizialmente coltivate in piastre profonde da 24 pozzi contenenti un mezzo di fermentazione a 50 °C e 200 giri/min per 24 ore. La fluorescenza di ciascun pozzo è stata misurata con un lettore di micropiastre alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 485 nm e 515 nm. Sono stati selezionati cloni con fluorescenza superiore alla media della ceppa genitoriale più tre deviazioni standard. Questi candidati sono stati ulteriormente trasferiti a fiaschette shake-flasch da 250 mL con un inoculo al 10% e fermentati alle stesse condizioni per altre 24 ore. La concentrazione di acido L-lattico è stata infine determinata tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni (Figura 4E).

Per verificare la fattibilità dell'uso di un sensore ad acido lattico per lo screening di ceppi ad alto contenuto di L-lattico, il sensore fu caratterizzato per la prima volta. Per validare la fattibilità del sensore di acido lattico per la rilevazione in micropiastre, sono stati aggiunti standard di acido L-lattico (1, 10, 1000, 10000, 10000, 100000 μM) alle piastre microtitolate, con 100 μL di miscela del sensore di acido lattico aggiunti a ciascun pozzo. I risultati hanno mostrato che l'intensità della fluorescenza aumentava con l'aumento della concentrazione di acido lattico da 100 μM a 10 mM. Il sensore ha mostrato forti risposte di fluorescenza sia all'acido L-lattico (Figura 5A). Tuttavia, rimane pienamente adatto al presente studio per due motivi. Innanzitutto, B. coagulans ATCC 7050 è un produttore di acido L-lattico ben caratterizzato con formazione trascurabile di acido D-lattico, come confermato dal suo profilo metabolico dominato da L-LDH. In secondo luogo, l'accuratezza del sensore per la quantificazione dell'acido L-lattico in campioni di fermentazione effettivi è stata validata confrontando con HPLC (Figura 5B). Pertanto, nonostante la reattività incrociata in vitro con l'acido D-lattico, il sensore riporta in modo affidabile i livelli di acido L-lattico nel nostro flusso di lavoro di screening. Per validare la fattibilità della rilevazione quantitativa dell'acido lattico utilizzando il sensore di acido lattico, sono stati misurati i tassi di recupero del sensore sia nella soluzione acquosa che nel mezzo di schermo. I risultati hanno mostrato un alto tasso di recupero del 108,81% nel mezzo di screening e del 98,39% nella soluzione acquosa, rispettivamente, con deviazioni standard relative < 5% (Figura 5C). La lieve elevazione del mezzo si trova nell'intervallo accettabile del 90–110%, indicando nessuna interferenza matrice significativa. Nei saghi su microplacche, il sensore è stato miscelato 1:1 con standard di acido L-lattico, incubato per 5 minuti e ha mostrato un'eccellente linearità nell'intervallo di 0–0,6 g/L (Figura 5D). Inoltre, il metodo della fluorescenza ha permesso di rilevare 96 campioni in 5 minuti, rappresentando una riduzione di 384 volte del tempo totale di rilevamento rispetto all'HPLC. Per convalidare ulteriormente la fattibilità del sensore di acido lattico nello screening a base di gocce, sono state fabbricate gocce contenenti acido L-lattico a concentrazioni variabili e un volume uguale del sensore di acido lattico è stato injectato pico-iniettato in ciascuna goccia. L'intensità di fluorescenza delle gocce è stata rilevata utilizzando la piattaforma microfluidica automatica delle gocce. I risultati hanno dimostrato uno spostamento significativo verso destra del segnale di fluorescenza con l'aumento della concentrazione di acido L-lattico (Figura 5E). Per la conservazione, il sensore di lattato veniva integrato con glicerolo al 5% e conservato a -80 °C, mantenendo la stabilità della rilevazione per almeno un mese (Figura Supplementare 6).

Oltre a selezionare un sensore appropriato per l'allevamento tramite la tecnologia FADS, è fondamentale determinare la durata ottimale della coltura dei ceppi nelle gocce. Un tempo di coltura insufficiente può portare a una secrezione insufficiente di acido L-lattico, con conseguente segnale di bassa fluorescenza che non distinguono tra ceppi ad alto rendimento e bassi rendimenti. Al contrario, un tempo di coltura eccessivamente prolungato può causare un accumulo eccessivo di acido L-lattico, che supera il raggio di rilevamento del sensore di acido lattico. Per affrontare questo problema, la durata della coltura dei ceppi nelle gocce è stata ottimizzata monitorandone dinamicamente lo stato di crescita. I ceppi sono entrati nella fase di crescita logaritmica dopo 6 ore di coltura nelle gocce, e la biomassa batterica nelle gocce è aumentata significativamente dopo 10 ore (Figura 6A). Al contrario, quando la durata della coltura superava le 12 ore, le gocce mostravano un ritiro distinto. Questo fenomeno è attribuito a variazioni di pressione osmotiche all'interno delle goccioline durante la fase avanzata della crescita della deformazione, che inducono il ritiro delle gocce. Tale ritiro può portare a volumi di iniezione pico incoerenti tra le diverse gocce negli esperimenti successivi. Per determinare il tempo ottimale di coltura, è stato iniettato un volume uguale del sensore di acido lattico nelle gocce coltivate per periodi diversi. Si è riscontrato che il segnale di fluorescenza delle goccioline era significativamente aumentato dopo 10 ore di coltura; pertanto, 10 ore sono state selezionate come durata ottimale della coltura per ceppi in gocce (Figura 6B).

In un singolo ciclo di screening, le gocce sono state poi selezionate utilizzando un chip di selezione a una velocità di 100 Hz per 4 ore, e è stato raccolto il primo 0,1% delle gocce con la massima intensità di fluorescenza (Figura 6C). Le gocce positive sono state raccolte in un tubo sterile di raccolta e trattate con 500 μL di demulsificante e 500 μL di mezzo fresco per semi. Dopo una lieve agitazione per 5 minuti, sono stati prelevati 20 μL della fase acquosa superiore, diluiti di 10 volte e distribuiti su due piastre solide di agar. Dopo l'incubazione a 50 °C per 2 giorni, 200 singole colonie furono selezionate casualmente e inoculate in piastre profonde a 24 pozzi per la coltura di espansione. Tra i 200 cloni coltivati, 78 ceppi mutanti mostrarono rese di acido L-lattico più elevate rispetto al ceppo parentale (Figura Supplementare 7). Questi 78 mutanti sono stati poi sottoposti a convalidazione con fiaschette shake-flask e sono stati infine ottenuti 17 ceppi con rese migliori rispetto al ceppo parentale. Tra questi, l'ADC-17 mutante ha mostrato il maggiore aumento, da 57,2 g/L a 67,04 g/L, rappresentando un miglioramento del 17,2% (Figura 6D). La stabilità genetica di ADC-17 è stata valutata su quattro generazioni consecutive. Non è stata osservata differenza significativa tra le quattro generazioni (p > 0,05), indicando che il tratto ad alta resa dell'ADC-17 è rimasto stabile in quattro sottoculture consecutive (Figura 6E). Questi risultati dimostrano l'efficienza e l'affidabilità della piattaforma FADS, che utilizza un sensore di acido lattico per arricchire ceppi ad alta resa provenienti da librerie mutanti casuali in un singolo round di schermatura.

Figura 1: Composizione della piattaforma microfluidica automatica delle gocce. (A) Struttura interna della banchina. Comprende quattro moduli principali: controllo dei fluidi a pressione, imaging CMOS ad alta velocità, rilevamento della fluorescenza a doppio laser a 488 nm/633 nm e un sistema di controllo host per la manipolazione delle goccioline e l'output dei dati. (B) La piattaforma automatica di funzionamento microfluidica a gocce. I componenti etichettati includono a. Piattaforma di posizionamento, b. Telecamera ad alta velocità, c. elettrodi a chip, d. morsetto di fissaggio a chip, e. scanalatura di posizionamento dei chip, f. bagno metallico, g. Pompa d'aria 1: Controlla la fase dell'olio, h. Pompa d'aria 2: Controlla il campione. Pompa d'aria 3: Controlla l'iniezione del reagente. La Figura 1A è creata utilizzando Biorender ed è fornita una licenza per il copyright. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Consumabili sperimentali. (A) Tubo di iniezione: per iniettare la fase oleosa, il campione di sospensione batterica e la soluzione reagente. (B) Tubo di raccolta: per raccogliere gocce e coltivarle successive. (C) Chip di preparazione delle gocce: genera 14 gocce di pL. (D) Microiniezione a gocce: microinietta i reagenti nelle gocce. (E) Chip di selezione delle gocce: seleziona le ceppi positive tramite elettrodi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Interfacce software chiave della piattaforma microfluidica automatica a gocce. (A) Introduzione all'interfaccia software per la generazione di gocce. R. Inizia: clicca per iniziare la generazione delle gocce. B. Velocità: Regola la velocità di generazione delle gocce. C. Dimensioni: Regola il volume delle gocce. D. Fermo: Clicca per fermare la generazione di gocce. (B) Interfaccia pico-iniezione a gocce. E. Volume di iniezione: Regolare il volume di iniezione del reagente. F. Forza di fusione: Tre livelli di tensione (Alto/Medio/Basso). (C) Introduzione all'interfaccia di ordinamento delle gocce. G. Laser. Seleziona il tipo di laser (488 nm o 633 nm). H. Registrazione dati. I. Forza di flessione: tre livelli di tensione (Alto/Medio/Basso). J. Interruttore di ordinamento: Clicca per iniziare l'ordinamento delle gocce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Flusso di lavoro di screening ad alta produttività basato sulla piattaforma microfluidica automatica a gocce. (A) Costruzione di biblioteche mutanti tramite mutagenesi ARTP. (B) Generazione e incubazione delle gocce. Le singole cellule sono compartimentalizzate nelle gocce di picolitre. (C). Pico-iniezione di gocciole. Un sensore fluorescente viene iniettato con pico in ogni goccia. (D) Selezione delle gocce. Le gocce con alta fluorescenza (che indica un'elevata produzione di acido L-lattico) sono arricchite dalla FADS. (E) Validazione positiva del clone in micropiastre e fiaschette da scuotere. Abbreviazione; FADS = Selezione delle Gocce Attivate dalla Fluorescenza. La Figura 4 è creata utilizzando Biorender ed è fornita una licenza per copyright. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Caratterizzazione del sensore di acido lattico in vitro. (A) Intervallo di risposta del sensore di acido lattico all'acido L-lattico. Eccitazione/Emissione = 485/515 nm. Media ± SD da tre esperimenti indipendenti (n = 3, ciascuno con repliche tecniche triplicate). (B) Correlazione con HPLC. Sei campioni di fermentazione (diversi momenti) sono stati analizzati una volta sia dal sensore di lattato che dall'HPLC. La regressione lineare ha dato R² = 0,9927. Eccitazione/Emissione = 485/515 nm. (C) Esperimento di recupero con acido lattico. L-acido lattico è stato inserito in acqua ultrapura e mezzo di screening a 0,5 g/L. I dati sono media ± SD (n = 3 esperimenti indipendenti). I recuperi sono stati del 98,39% (acqua) e del 108,81% (mezzo di screening), con MST < 5%. Eccitazione/Emissione = 485/515 nm. (D) Ottimizzazione del tempo di rilevamento. Il sensore è stato miscelato con standard di acido L-lattico (0–0,6 g/L) e incubato per 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minuti. Il massimo^{R 2} = 0,990 è stato ottenuto dopo 5 minuti di miscelazione. I dati provengono da tre esperimenti indipendenti (n = 3). Eccitazione/Emissione = 485/515 nm. (E) Istogramma a fluorescenza a gocce. Sono state analizzate almeno 2000 gocce per ogni concentrazione di acido L-lattico. Canale di rilevamento: 488 nm, DC (V) = il segnale di tensione che rappresenta l'intensità di fluorescenza di una goccia. Abbreviazione; STD = deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Screening ad alta produttività di B. coagulans con elevata produzione di acido L-lattico. (A) La morfologia della deformazione all'interno delle gocce è stata osservata a 0, 2, 4, 6, 8 e 10 ore. Barra di scala: 20 μm. Tempo di esposizione: 100 ms. (B) Cambiamenti nell'intensità di fluorescenza delle gocce contenenti B. coagulans dopo incubazione per diversi periodi, con iniezione di sensori di acido lattico. Le immagini sono state acquisite con un tempo di esposizione di 2000 ms e un guadagno del 1500%. Barra di scala: 50 μm. (C) Distribuzione dell'intensità di fluorescenza delle gocce. Soglia di screening: intensità FL > 2750 (u.a.). Canale di rilevamento: 488 nm (D) dati di acido L-lattico (g/L) del ceppo parentale (ATCC 7050) e mutanti rappresentativi positivi. I dati sono media ± SD (n = 3 fiaschette di shake-flask indipendenti per ceppo). P < 0,0001 rispetto al ceppo parentale. Il mutante con le migliori prestazioni, ADC-17, mostra un aumento del 17,2%. (E) Stabilità genetica del B . coagulans ADC-17, con le migliori prestazioni, su quattro generazioni consecutive (1–4). Le rese di acido L-lattico sono state determinate dall'HPLC dopo 24 ore di fermentazione a fiaschetta agitata. I dati sono media ± SD (n = 3 fiaschette per generazione). L'ANOVA unidirezionale non ha mostrato differenze significative tra generazioni (p > 0,05, ns). Abbreviazione; HPLC = Cromatografia liquida ad alte prestazioni; SD = Deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: La purificazione del sensore di lattato eLACCO1.1. La proteina è stata eluata con 500 mM di imidazolo e conservata a -80 °C con glicerolo al 5%. La concentrazione operativa è di 0,1 mg/mL, e il limite di rilevamento è 2 mg/L. La Figura Supplementare 1 è stata interamente ricreata dagli autori utilizzando solo gli strumenti di disegno nativi di Microsoft PowerPoint (inclusi forme di base, linee e caselle di testo). Non sono state utilizzate icone, template o fonti di immagini esterne di terze parti. Tutti gli elementi sono creazioni originali degli autori. Pertanto, questa cifra non richiede alcuna licenza di pubblicazione aggiuntiva. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Curva di crescita di B. coagulans ATCC 7050. La varietà è stata coltivata in mezzo a 50 °C con scuotimento a 200 giri/min. I dati sono presentati come media ± SD (n = 3 colture indipendenti). La coltura ha raggiunto la fase logaritmica tardiva intorno alle 12 ore, e questo punto è stato utilizzato per la preparazione dell'inoculo in esperimenti successivi. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Curva di calibrazione di OD₆₀₀ rispetto alla concentrazione cellulare vitale per B. coagulans ATCC 7050. Furono preparate diluizioni seriali di una coltura a fase logaritmica media e misurato il OD₆₀₀ . Le corrispondenti unità formative di colonie (CFU/mL) sono state determinate diffondendo 100 μL di diluizioni appropriate su piastre agar del mezzo seme e incubando a 50 °C per 24 ore. I dati sono presentati come media ± SD (n = 3 esperimenti indipendenti). Secondo questa curva, OD₆₀₀ = 0,5 corrisponde a circa 1 × 10⁸ CFU/mL. Questa calibrazione veniva utilizzata per determinare le densità cellulari iniziali per l'incapsulamento delle gocce. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Curva di letalità di B. coagulans ATCC 7050 sotto mutagenesi ARTP. Le cellule sono state esposte al plasma elio per diverse durate (5, 10, 15, 20, 25, 30 s). Dopo l'irradiazione, le cellule sono state impiegate su agar di mezzo seme e le CFU sono state conteggiate dopo un'incubazione di 24 ore a 50 °C. La letalità (%) è stata calcolata secondo l'Equazione (2). I dati sono presentati come media ± SD (n = 3 repliche indipendenti). La freccia indica il tempo di mutagenesi selezionato (20 s) con un tasso di letalità di circa il 90%. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: Determinazione dell'efficienza dell'incapsulamento a singola cella tramite colorazione DAPI. B. coagulans Le celle ATCC 7050 sono state colorate con DAPI e incapsulate in gocce a λ = 0,1. Un totale di 2000 gocce sono state esaminate al microscopio a fluorescenza e sono state conteggiate le gocce contenenti 0, 1 o ≥2 cellule. L'efficienza osservata nell'incapsulamento a singola cellula è stata dell'11,2%, leggermente superiore all'aspettativa teorica di Poisson (9,0% per λ = 0,1). Questa deviazione è attribuibile a fattori come la dispersione attiva delle cellule, la colorazione DAPI non specifica delle cellule compromesse e la rottura indotta da taglio di piccoli aggregati durante la formazione delle gocce. Barra della scala: 30 μm. Sono state analizzate almeno 2000 microgocce. Le immagini sono state acquisite con un tempo di esposizione di 2000 ms e un guadagno del 1500%. Abbreviazione; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 6: Stabilità dello stoccaggio dei sensori.  Mostra la risposta di fluorescenza del sensore immagazzinato a -80 °C con glicerolo al 5% in quattro settimane. Non è stata osservata una perdita significativa di segnale, confermando una buona stabilità di memorizzazione (p > 0,05). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 7: Risultati di screening primario di 78 ceppi che mostrano una produzione di acido lattico superiore rispetto al controllo nelle piastre di pozzo profondo. In questo screening primario sono stati identificati in totale 78 ceppi mutanti con rese di acido L-lattico superiori a quelle del ceppo principale. Tutti i dati sui ceppi mutanti rappresentano risultati di screening a singolo punto senza repliche biologiche. La deformazione genitore (controllo) è stata distribuita casualmente su 24 piastre di pozzi profondi come riferimento, e i suoi dati sono presentati come la deviazione media ± standard su tre repliche indipendenti di 24 piastre profonde (n = 3). L'asse y mostra la resa dell'acido L-lattico (g/L) per ogni deformazione sull'asse x; Le barre di errore sono visualizzate solo per il controllo di deformazione genitore. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standardizzato per lo screening microbico industriale basato su una piattaforma microfluidica automatica a gocce. Il flusso di lavoro integrato comprende la costruzione di librerie mutanti, la generazione di gocce e l'incapsulamento di singola cellula, la coltivazione di microreattori, l'iniezione di biosensori, la selezione delle gocce attivate dalla fluorescenza e la validazione finale dei ceppi bersaglio. Utilizzando lo screening ad alta produttività di un B. coagulans ad alto rendimento che produce acido L-lattico come caso di validazione, questo flusso di lavoro ha dimostrato molteplici vantaggi rispetto ai metodi convenzionali a micropiastre e agar nel contesto del miglioramento della ceppa di B. coagulans. In termini di throughput di screening ed efficienza, la piattaforma sfrutta chip microfluidici per generare e processare in parallelo migliaia o decine di migliaia di gocce al secondo, ottenendo un aumento di circa^{10 volte e 4} volte della capacità di screening su singolo round rispetto ai metodi tradizionali basati su^{micropiastre 12}. Per B. coagulans, il flusso di lavoro può selezionare 10^{goccioline da 6} gocce in 4 ore, accorciando così il ciclo di sviluppo del ceppo da diverse settimane a pochi giorni e accelerando significativamente il processo di riproduzione. L'efficienza dello screening del sistema FADS è circa 3 × 10³ volte superiore a quella del sistema basato su lastre, riducendo significativamente i costi di infrastruttura, manodopera e^{consumabili 13}. Tuttavia, a causa delle caratteristiche intrinseche dei diversi microrganismi, è necessaria un'ottimizzazione mirata di questo flusso di lavoro standard. Ad esempio, dopo 36 ore di coltivazione del lievito, i cambiamenti nella pressione osmotica portano a una riduzione del volume delle gocce, rendendo necessari aggiustamenti alla durata dell'incubazione per garantire la stabilità delle operazioni di iniezione e^{selezione 14}. Per i funghi filamentosi, di solito è necessario aumentare il volume delle gocce per evitare che l'interfaccia delle gocce si rompa o si fonda a causa della crescita^{miceliale 15,16}.

Inoltre, a causa del volume ultra-piccolo di gocce in scala di picolitro, è essenziale sviluppare biosensori fluorescenti su misura per ciascun prodotto bersaglio. Diversi classici reagenti di rilevamento fluorescente per proteasi e metaboliti di piccole molecole sono già disponibili commercialmente, come quelli per perossido^{di idrogeno 17}, glicosidasi¹⁸,^{etanolo 19} e^{glucosio 20}. Tuttavia, le sonde fluorescenti chimicamente sintetizzate hanno tipi limitati e tendono a fuoriuscire dalle gocce nelle gocce vuote adiacenti, portando a un aumento della fluorescenza di fondo. Ciò è attribuito principalmente al fatto che molecole fluorescenti idrofobe possono penetrare facilmente l'interfaccia^{olio-acqua 21}.

Negli ultimi anni, i biosensori includono principalmente due tipi: biosensori codificati geneticamente e biosensori basati su fattori di trascrizione (TF). I biosensori fluorescenti codificati geneticamente si riferiscono a proteine chimeriche che possono essere espresse intracellulari e ingegnerizzate per fungere da sensori per monitorare la trasduzione del segnale in vivo . Grazie alla loro eccellente stabilità, rapida risposta fluorescente e alta specificità, i biosensori fluorescenti codificati geneticamente sono stati applicati in molteplici scenari^22. Un team ha impiegato il reporter fluorescente a sensore di glutammato basato sull'intensità (iGluSnFR) all'interno di un sistema di selezione microfluidica delle gocce, stabilendo un flusso di lavoro ad alta produttività per lo screening dei mutanti di Bacillus amyloliquefaciens con maggiore produzione di glutaminosi. Questa piattaforma basata su biosensori ha permesso un rapporto di arricchimento di 56 volte e ha infine isolato una variante con un aumento superiore al 47% nella produzione di glutaminosi da una libreria di mutanti^{a intero genoma di 5 membri 23}.

I biosensori a cellula intera basati su fattori di trascrizione (TF) sono una classe importante di biosensori a cellula intera, costruiti attorno ai fattori di trascrizione. I fattori di trascrizione sono una classe di proteine che regolano l'espressione genica legandosi a sequenze specifiche di DNA¹⁴. Alcuni fattori di trascrizione si attivano legandosi a metaboliti o composti esogeni; questi sono chiamati fattori di trascrizione allosterici (aTF). Una volta attivate, le aTF subiscono cambiamenti conformazionali che, a loro volta, portano alla loro dissociazione o al lego alla sequenza di DNA a monte dei geni bersaglio, attivando o inibendo così l'espressione di quei geni. I fattori di trascrizione possono essere combinati con altri elementi del DNA comunemente utilizzati nella biologia sintetica (come promotori, siti di legame ribosomi, terminatori e geni reporter) per costruire circuiti genetici biosensoriali basati su TF. Questi elementi genetici possono rilevare la concentrazione di vari liganti nella cellula o nell'ambiente e rispondere di conseguenza²⁴. La rilevazione dell'eritritolo è stata implementata con successo utilizzando un biosensore basato su fattori di trascrizione integrato con una piattaforma FADS, permettendo l'isolamento di un ceppo mutante con una produzione di eritritolo^{significativamente migliorata 14}. Lo sviluppo di questi due tipi di biosensori ha un grande potenziale per promuovere l'applicazione delle piattaforme FADS nell'allevamento microbico, superando i limiti delle sonde chimiche tradizionali e ampliando il campo dei prodotti target che possono essere screenati.

In sintesi, è stato presentato un flusso di lavoro standard di screening ad alto rendimento per i microrganismi industriali. L'affidabilità di questo flusso di lavoro è stata dimostrata dalla sua applicazione con successo allo screening di ceppi di B. coagulans ad alto rendimento produttori di acido L-lattico. Questo flusso di lavoro fornisce un riferimento prezioso per i futuri ricercatori che conducono screening ad alto rendimento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	Per la preparazione di piastre solide
Etanolo anidro	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Pulizia e disinfezione di banchi e apparecchi di laboratorio
Plasma atmosferico e a temperatura ambiente (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	ARTP  è stato impiegato per costruire la libreria mutante per la mutagenesi dei ceppi.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050 è stato utilizzato come ceppo di partenza per la mutagenesi e come obiettivo per lo screening a gocciolina ad alta produttività.
Micropiatto nero (96 pozzetti)	Corning	3925	Il micropiatto nero a 96 pozzetti è stato utilizzato per i saggi del sensore di lattato e per la determinazione della concentrazione di acido lattico.
Carbonato di calcio	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	Per isolare iperproduttori di acido L-lattico
Cloruro di calcio	Sinopharm	10005819	Il cloruro di calcio viene utilizzato per la preparazione del terreno di coltura microbica, fornendo nutrienti essenziali per la crescita microbica.
L-lattato di calcio	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	Utilizzato come campioni per la preparazione della curva standard nel processo di rilevamento.
Tubo per centrifuga (15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	Utilizzato per la diluizione del liquido batterico
Tubo di raccolta	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	Per la raccolta delle goccioline e la successiva coltivazione
Computer	Lenovo	E450	Installazione del software e controllo di DREM Cell.
DAPI	Solarbio	c0065	Per la colorazione cellulare.
Piatto profondo (24 pozzetti)	BKMAMLAB	110424008	Per la verifica iniziale della resa dei mutanti di B. coagulans utilizzando piastre a pozzetti profondi
Demulsificante (1H,1H,2H,2H-Perfluoroottanolo)	MACKLIN	H817022	Il demulsificante per goccioline viene utilizzato per rompere le microgoccioline di acqua in olio e rilasciare le cellule interne, i ceppi o il surnatante per la successiva rilevazione e analisi.
D-Glucosio	Solarbio	G8150-1000	Il D-Glucosio viene utilizzato per la preparazione del terreno di coltura microbica, fornendo nutrienti essenziali per la crescita microbica.
Citrato di diammonio e idrogeno	Solarbio	D9950	Il citrato di diammonio e idrogeno viene utilizzato per la preparazione del terreno di coltura microbica, fornendo nutrienti essenziali per la crescita microbica.
Fosfato dipotassico anidro	Sigma-Aldrich	P8281	Il fosfato dipotassico anidro viene utilizzato per la preparazione del terreno di coltura microbica, fornendo nutrienti essenziali per la crescita microbica.
Versione del software DREM	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	Per il controllo dello strumento DREM Cell. Il software DREM è un programma commerciale proprietario esclusivamente per lo strumento DREM Cell della Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. Non ha accesso ufficiale pubblico o URL di download e viene distribuito solo con lo strumento sotto autorizzazione.
Cello-sorter microfluidico di microgoccioline che intrappola le goccioline (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	È stato utilizzato per l'incapsulazione e la selezione ad alta produttività di singole cellule per lo screening rapido di ceppi ad alta resa dalla libreria mutante.
Chip per la generazione di goccioline	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	Il chip per la generazione di goccioline viene utilizzato per produrre goccioline monodisperse in scala picolitro (pL) per l'incapsulazione di singole cellule.
Chip per l'iniezione di goccioline	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	Il chip per l'iniezione di goccioline viene utilizzato per ottenere l'iniezione precisa e traccia di reagenti in goccioline preformate per le successive reazioni biochimiche.
Chip di ordinamento delle goccioline	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	Il chip di ordinamento delle goccioline viene utilizzato per ordinare le goccioline bersaglio contenenti cellule ad alta resa in base ai segnali di fluorescenza.
Bicchiere di Erlenmeyer per agitazione (250 mL)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	Utilizzato per la verifica della cultura su scala dei ceppi mutanti di B. coagulans dopo la selezione primaria con piastre a pozzetti profondi, al fine di confermare la stabilità e la riproducibilità dei ceppi ad alta resa.
Membrane filtranti (0,22 µm)	Merck	SLGPR33RB	Utilizzato per la filtrazione del brodo di fermentazione.
Microscopio a inversione fluorescente	Olympus	IX73	Il microscopio a inversione fluorescente Olympus IX73 è stato utilizzato per osservare la morfologia batterica all'interno delle goccioline
Olio fluorurato	Bio-Rad	1864006	L'olio fluorurato serve come fase continua nella microfluidica a goccioline per generare microgoccioline di acqua in olio stabili, monodisperse e non interferenti, supportando la coltura e lo screening di singole cellule.
Colonna per cromatografia liquida ad alta prestazione	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	Viene utilizzato per separare l'acido lattico da altri componenti nel brodo di fermentazione in base alle loro diverse proprietà di ritenzione, al fine di realizzare il rilevamento quantitativo accurato dell'acido lattico.
Cromatografia liquida ad alta prestazione	Shimadzu	228-34001-02	L'HPLC viene utilizzata per il rilevamento quantitativo e l'analisi dell'acido L-lattico nei campioni di fermentazione.
Tubo di iniezione	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-1N	Per l'iniezione della fase oleosa, della sospensione batterica campione e della soluzione di reagente
Solfato di ferro(III) eptaidrato	Solfato di ferro(III) eptaidrato	Solfato di ferro(III) eptaidrato	Solfato di ferro(III) eptaidrato
Cappuccio a flusso laminare	Shanghai SHP Instrument Equipment Co., Ltd	SP20230501	Utilizzato per operazioni asettiche nella coltura e fermentazione di B.