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Alta Electophoresis risoluzione nativa gel trasparente (hrCNE) per complessi mitocondriale In-Gel Attività saggi
Cellule staminali embrionali umane (hESC) sono stati mantenuti su un monostrato di ˠ-irradiati o mitomicina C trattati con fibroblasti embrionali di topo (MEF), poi passati a una crescita su Matrigel per 5 giorni in MEF condizionata media con condizioni standard. Per rimuovere i contaminanti MEF, hESC sono stati ri-placcato su Matrigel e cresciuto in MEF condizionata medio per altri 3 giorni. Microscopia di immunofluorescenza per i marcatori pluripotenza Oct-4 e SSE-4 è stato utilizzato per confermare la mancanza di differenziazione hESC.
- Lavare le cellule con caldo 1x PBS, pH 7,4, seguita da tripsinizzazione (1x 1 ml di tripsina per bene in un 6-pozzetti) per 5 min.
- Aggiungere un uguale volume di fresca inibitore della tripsina (1mg/ml in 1x PBS, pH 7,4). Celle di raccolta e centrifugare a 200g, 5 min, temperatura ambiente.
- Eliminare le cellule surnatante e risospendere pellet in 0,8 - 1.7ml (in base alle dimensioni del pellet) di tampone di ghiaccio freddo isolamento dei mitocondri (83mm saccarosio; 6,6 mm imidazolo / HCl, pH 7,0) con appena preparato 1 'Cocktail di inibitori della proteasi. Incubare in ghiaccio per 10 minuti.
- Dounce cellule con un omogeneizzatore (~ 40 - 50 colpi). Macchia una aliquota di cellule dounced con trypan blu per verificare la completezza di omogeneizzazione utilizzando un microscopio ottico.
- Centrifugare a 20.000 g per 10 minuti a 4 ° C per ottenere un grezzo mitocondriale pellet che contiene anche i nuclei e frammenti di cellule più grandi. Decantare e scartare il surnatante e pesare il greggio precipitato a pellet mitocondriale. Il pellet può essere conservato a -80 ° C a seguito immediato congelamento in azoto liquido, se questo è un punto di arresto.
NOTA: centrifugazione differenziale o altri gradiente basato su procedure possono essere utilizzate per l'isolamento e la raccolta di una frazione pura membrana mitocondriale. Vedi rif. 4 per i dettagli. Questo approccio alternativo produrrà l'attività mitocondriale complesso per mg di proteina mitocondriale invece di complessa attività per mg di peso cellulare o numero di cellulare. La concentrazione di proteine mitocondriali dovrà essere determinato dopo la purificazione per fare questo confronto. Inoltre, un buffer di isolamento diversi possono essere richiesti per questo approccio. Per la solubilizzazione della frazione pura membrana mitocondriale, vedere la nota seguente punto 6.
- Solubilizzare il greggio mitocondriale pellet su ghiaccio con il vortex con il tampone di solubilizzazione ghiaccio freddo (50 mM NaCl, 50 mM imidazolo / HCl pH 7.0, 1mM EDTA, 2mM 6-aminohexanoic acido). L'acido 6-aminohexanoic può essere sostituito con il Cocktail 1x inibitore della proteasi. L'uso 35μl di tampone solubilizzazione per 20 mg di peso a pellet. Aggiungere 20μl del 10% w / v digitonina per 20 mg di peso a pellet e mescolare muovendo il tubo. Incubare per 5-10 minuti sul ghiaccio. Dodecil-BD-maltoside o Triton X-100 può essere sostituito per digitonina per solubilizzare le proteine. La scelta del detersivo e la sua quantità può influenzare la formazione di supercomplexes o forme multimerica di complessi mitocondriali. Per ulteriori informazioni, vedere rif.1.
NOTA: La quantità di detersivo necessaria per solubilizzare una frazione pura membrana mitocondriale corrisponde ad un detergente / proteine di peso che varia dai 2-6g / g. Il rapporto ottimale per solubilizzare le membrane mitocondriali è 2.5g / g per dodecil-BD-maltoside, 3g / g per Triton X-100, e 6 g / g per digitonina.
- Centrifugare il pellet solubilizzato a 100.000 g per 15 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante.
- Aggiungi il caricamento del buffer ad una finale del 5% w / v glicerolo e 0,01% w / v Ponceau S (uso un 50% w / v glicerolo, 0,1% w / v tampone Ponceau S soluzione di carico magazzino).
- Carico pozzi gel con un volume che contiene i 20-40mg del greggio mitocondriale pellet per corsia. Utilizzare un gel gradiente di acrilammide (4 -13%) con un 3,5% stacking gel.
NOTA: preparazione gel elettroforesi e condizioni:
Per la preparazione di gel, utilizzare un acrilamide / bis-acrilamide (AA / bisAA) 3 miscela come segue: 48 g di acrilamide e 1,5 g di bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Se T è la concentrazione totale di AA e bisAA e C è la percentuale di reticolante (bisAA) per monomero totale).
Gel tampone (3 '): 1,5 M 6-aminohexanoic acido; 75mm imidazolo, pH 7,0
| Gradiente di gel: | 4% | 13% | Stacking gel: | 3,5% |
| AA / bisAA 3 mix | 2 ml | 6,5 ml | | 0,6 ml |
| Gel tampone 3 ' | 8,3 ml | 8,3 ml | | 2,7 ml |
| Glicerina | | 5 g | | |
| H 2 O | 14,7 ml | 5 ml | | 4,7 ml |
| Volume totale | 25 ml | 25 ml | | 8 ml |
| 10% di APS | 139 microlitri | 125 microlitri | | 67 microlitri |
| TEMED | 14 microlitri | 12,5 microlitri | | 6,7 microlitri |
Anodo buffer: 25mM imidazolo / HCl, pH 7,0
Catodo buffer: Tricine 50mm, 7.5mm imidazolo / HCl, 0,02% w / v dodecil-BD-maltoside, 0,05% w / v desossicolato, pH 7,0
Versare ed eseguire gel in una stanza fredda (4-7 ° C). La tensione iniziale utilizzato è 100V. Quando il campione è entrato nel gel impilati, la tensione è aumentata a 500V con la corrente limitata a 15mA (per 0,15 '14' 14 cm di gel). Elettroforesi viene arrestata dopo 3-4 ore quando la linea netta di colorante rosso del Ponceau S si avvicina alla parte anteriore gel. In alternativa, un gel può essere eseguito durante la notte con tensione costante a 70-100V.
- In-gel attività saggi. Il tempo di incubazione per ogni test dipende dall'efficienza di solubilizzazione delle proteine e la quantità di materiale caricato per bene. Complessi I, IV e V di solito resa più forti segnali di complessi II e III.
Complesso I (CI)
Incubare la fetta gel con CI tampone (5mm Tris-HCl, pH 7.4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) a temperatura ambiente per diverse ore.
IC buffer: Aggiungere per 100 ml di 5mM Tris-HCl, pH 7,4:
0.01g NADH
0,25 g NBT
Fissare il gel in metanolo al 50% e 10% di acido acetico per 15-45 min. Il gel fisso è conservata nel 10% di acido acetico.
Complesso II (CII)
Incubare la fetta gel con CII buffer (20 mM di sodio succinato; methasulfate phenazine 0,2 mm; 2.5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) a temperatura ambiente per diverse ore.
CII buffer: Aggiungi 5mM per 100 ml di Tris-HCl, pH 7,4:
200μl succinato di sodio 1M
80μl methasulfate phenazine (PMS 250mm sciolto in DMSO)
0,25 g NBT
Fissare il gel come descritto per il complesso I
Complesso III (CIII)
Incubare la fetta gel con CIII tampone (fosfato di sodio 50mM, pH 7,2, 0,05% 3,3 '-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB)) a temperatura ambiente per diverse ore.
CIII buffer: Aggiungere per 100 ml di 50 mM di sodio-fosfato, pH 7,2:
50mg diaminobenzidina tetraidrocloruro
Fissare il gel come descritto per il complesso I
Complesso IV (CIV)
Incubare la fetta gel con CIV tampone (fosfato di sodio 50mM, pH 7,2, 0,05% 3,3 '-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB), 50 micron cavallo cuore citocromo c) a temperatura ambiente per diverse ore.
CIV buffer: Aggiungere per 100 ml di 50 mM di sodio-fosfato, pH 7,2:
50mg diaminobenzidina tetraidrocloruro
0.1g cavallo cuore citocromo c
Fissare il gel come descritto per il complesso I
Complesso V (CV)
Incubare la fetta gel con CV buffer (Tris-base da 35 mm, 270 mm glicina, pH 8.3 a 25 ° C, 14 mm MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8 mm ATP) a temperatura ambiente per diverse ore.
CV buffer: 100 ml di soluzione Per aggiungere:
| Tris-base | 0.424g |
| Glicina | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| Pb (NO 3) 2 | 0.29g |
Non è necessario aggiustare il pH (dovrebbe essere 8.3) - non usare l'acido o di base. Filtrare e aggiungere
Fissare il gel in metanolo al 50% per 30 min e trasferimento in acqua.