Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

Summary

In questo video vi mostreremo come il complesso della catena respiratoria mitocondriale di cellule staminali embrionali umane possono essere analizzati utilizzando nelle prove di attività gel.

Abstract

I mitocondri sono organelli citoplasmatici che hanno un ruolo primario nel metabolismo cellulare e l'omeostasi, la regolamentazione della rete di segnalazione cellulare, e la morte cellulare programmata. I mitocondri producono ATP, regolare lo stato redox citoplasmatico e Ca2 + equilibrio, catabolizzare acidi grassi, sintesi dell'eme, nucleotidi, ormoni steroidi, amminoacidi, e aiutare assemblare ferro-zolfo in proteine. I mitocondri hanno anche un ruolo essenziale nella produzione di calore. Le mutazioni del genoma mitocondriale causa diversi tipi di disturbo umano. L'accumulo di mutazioni del mtDNA è correlata con l'invecchiamento e si sospetta di avere un ruolo importante nello sviluppo del cancro. Grazie al loro ruolo di vitale importanza in tutti i tipi di cellule, la funzione dei mitocondri devono anche essere critico per le cellule staminali. Progressi fondamentali sono stati fatti nella comprensione della vitalità delle cellule staminali, proliferazione, e la capacità di differenziazione. Ma l'attività funzionale delle cellule staminali, in particolare il loro stato di energia, non era ancora stato studiato in dettaglio. Quasi nulla si sa circa le proprietà mitocondriale di cellule staminali embrionali umane (hESC) e la loro progenie precursore differenziata. Un modo per comprendere e valutare il ruolo dei mitocondri nella funzione hESC e potenziale di sviluppo è quello di misurare direttamente l'attività dei complessi respiratori mitocondriali. Qui, descriviamo alta elettroforesi su gel chiaro risoluzione nativa e la successiva visualizzazione in attività di gel come un metodo per analizzare i cinque complessi della catena respiratoria di hESC.

Protocol

Alta Electophoresis risoluzione nativa gel trasparente (hrCNE) per complessi mitocondriale In-Gel Attività saggi

Cellule staminali embrionali umane (hESC) sono stati mantenuti su un monostrato di ˠ-irradiati o mitomicina C trattati con fibroblasti embrionali di topo (MEF), poi passati a una crescita su Matrigel per 5 giorni in MEF condizionata media con condizioni standard. Per rimuovere i contaminanti MEF, hESC sono stati ri-placcato su Matrigel e cresciuto in MEF condizionata medio per altri 3 giorni. Microscopia di immunofluorescenza per i marcatori pluripotenza Oct-4 e SSE-4 è stato utilizzato per confermare la mancanza di differenziazi....

Discussion

In questo video, che abbiamo descritto l'estrazione di complessi proteici mitocondriali di cellule staminali embrionali umane, la loro separazione da alte elettroforesi su gel chiaro risoluzione nativa (hrCNE), e la successiva analisi di in-gel saggi di attività catalitica. hrCNE risolve complessi proteici della membrana mitocondriale con una risoluzione paragonabile a quella di blu elettroforesi su gel nativi ed è superiore per in-gel prove di attività. Questa tecnica può essere utilizzato non solo per quantificare respiratoria mit.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 M EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	regola il pH a 8,0 con NaOH
1M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-500MG
1M succinato di sodio	Fisher Scientific	S413-500
0,1 M tampone fosfato di sodio pH 7,2	Fisher Scientific	BP332-1 e BP329-1	Miscelare 68,4 ml di 1M Na2HPO4 e 31,6 ml di 1M NaH2PO4 per preparare un tampone fosfato di sodio 0,1M con pH 7,2 a 25 C
1M Tricina, pH 7,0 (regolato con NaOH)	EMD Millipore	9010	conservare a 4 C
1M imidazolo/HCl, pH 7,0	Sigma-Aldrich	I-2399	conservare a 4 C
1M Tris-HCl, pH 7,4	Fisher Scientific	BP153-1
20% (wt/vol) dodecil-b-D-maltoside (DDM)	Fluka	44205-500MG	Disciolto in acqua. Conservare le aliquote da 1 ml a – 20 C.
10% (peso/vol) digitonina (> 50% di purezza, utilizzato senza ricristallizzazione)	Fluka	37008-1G	Disciolto in acqua. Negozio 0.1– Aliquote da 1 ml a – 20 C. Deve essere riscaldato fino a 95 C prima dell'uso.
2M Acido 6-amminoesanoico	Fluka	07260-100G	conservare a 4 C
10x Ponceau S/glicerolo soluzione madre	Sigma-Aldrich	P-3504 e G6279-1L	0,1% Ponceau S, 50% glicerolo, (wt/vol) in acqua.
10% p/v desossicolato di sodio	Fluka	30970-25G	Disciolto in acqua. Deve essere protetto dalla luce. Regolare il pH a 7,0 con HCl, filtrare e conservare a temperatura ambiente.
250 mM di fenazina metasolfato (PMS)	TCI America	P0083	Disciolto in DMSO e aliquotato. Negozio a – 20 C.
Nitro-blu tetrazolio (NBT)	Amresco	0329-1G
3,3'-diaminobenzidina tetracloridrato (DAB)	TCI America	D0078
Pb(NO3)2	Fisher Scientific	L62-100
MgSO4	Fisher Scientific	BP213-1
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Glicina	Fisher Scientific	G45-212
Adenosina 5'-trifosfato sale disodico (ATP)	Sigma-Aldrich	A2383-5G	Grado I, minimo 99%
beta-nicotineamide adenina dinucleotide (NADH) forma ridotta	Sigma-Aldrich	N-8129
Citocromo c Da cuore di cavallo	Sigma-Aldrich	C2506-250MG
Saccarosio	Fisher Scientific	BP220-212
100x cocktail di inibitori della proteasi	Sigma-Aldrich	P8340	Conservare a – 20 C.
Dimetil solfossido (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Tripano blu Colorazione 0,4%	GIBCO, di Life Technologies	15250-061
10x Tripsina (0,5%)	GIBCO, di Life Technologies	15400-054
Inibitore della tripsina	GIBCO, di Life Technologies	17075-029