Il protocollo testo completo di questo approccio sperimentale è disponibile in <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">protocolli di corrente in Biologia Cellulare</a> .

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

conteggio e determinazione della vitalità delle cellule in coltura

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determinazione del numero di cellule in coltura è importante nella standardizzazione delle condizioni di coltura e nello svolgimento di esperimenti di quantificazione precisa. Un emocitometro è una lastra di vetro spessa con una zona centrale progettata come una camera di conteggio. Sospensione cellulare viene applicato a una zona definita e conteggiati in modo densità cellulare può essere calcolato.

Determinazione del numero di cellule in coltura è importante nella standardizzazione delle condizioni di coltura e nello svolgimento di esperimenti di quantificazione precisa. In questo video ci dimostra come le cellule vengono conteggiati utilizzando un emocitometro.

Conteggio e determinazione della vitalità delle cellule in coltura

Determinare il numero di cellule in coltura è fondamentale per la standardizzazione delle condizioni di coltura e per l'esecuzione di esperimenti di quantificazione accurati. Un ...

La determinazione del numero di cellule e della coltura è importante per la standardizzazione delle condizioni di coltura e quando si eseguono esperimenti che richiedono numeri precisi di cellule. In questo video vi mostreremo come contare le cellule utilizzando un emocitometro e come calcolare la concentrazione di cellule presenti in sospensione. Vi mostreremo inoltre come determinare il numero di cellule vitali presenti nella vostra coltura mediante il saggio di vitalità con Trypan Blue.Ciao, sono Ricky, del laboratorio del Dr. LAN presso la Molecular Pathology Laboratories Network nell'East Tennessee. Oggi vi mostrerò come contare le cellule in sospensione e come determinarne la vitalità. Per preparare l'ematocitometro al conteggio cellulare, è necessario innanzitutto pulire la sua superficie e il relativo vetrino coprioggetto con etanolo al 70%.Il vetrino coprioggetto e il vetrino portaoggetto devono essere puliti, asciutti e privi di pelucchi, impronte digitali e aloni d'acqua. Successivamente, inumidire leggermente i bordi dell'emocitometro con acqua corrente e premere il coprioggetto sopra di esso. Il coprioggetto deve appoggiarsi in modo uniforme sulla zona argentata di conteggio.Ora siamo pronti per preparare la sospensione cellulare da contare. Per prima cosa, se le cellule sono state coltivate in colture a monolayer, staccare le cellule dalla superficie della piastra utilizzando la tripsina, come mostrato nel video relativo al passaggio delle cellule. Una volta che le cellule si sono staccate dalla piastra, diluirle secondo necessità per ottenere una sospensione uniforme.Assicurarsi di disperdere eventuali grumi nella sospensione quando si utilizza l'emocitometro. Si raccomanda un numero massimo di cellule compreso tra 20 e 50 per ogni quadrato di un millimetro. Quando si è pronti per caricare l'emocitometro con il campione cellulare, utilizzare una micropipetta per trasferire la sospensione cellulare sul bordo della camera di conteggio dell'emocitometro.Tenere la punta della pipetta sotto il coprivetrino ed erogare una goccia di sospensione. La sospensione verrà aspirata sotto il coprivetrino per azione capillare. Dopo aver riempito la prima camera, riempire la seconda camera di conteggio ed essere pronti per contare le cellule prima di iniziare il conteggio.Lasciare che le cellule si depositino per alcuni minuti. Una volta che le cellule si sono depositate, è utile asciugare eventuali liquidi in eccesso. È possibile osservare il vetrino al microscopio con un ingrandimento di cento volte.Dovresti vedere la grande area centrale della griglia, delimitata da un insieme di tre linee parallele. Le suddivisioni all'interno della grande area centrale sono anch'esse delimitate da tre linee parallele e ciascuna suddivisione è divisa in 16 quadratini più piccoli da linee singole. Le cellule all'interno di quest'area devono essere distribuite uniformemente, senza aggregazioni.Se le cellule non sono distribuite in modo uniforme, lavare e ricaricare. Utilizzare un emocitometro con un contatore manuale per contare le cellule in ciascuno dei quattro quadrati angolari e nel quadrato centrale. Non contare le cellule che toccano la linea centrale delle linee triple nella parte superiore e sinistra dei quadrati; contare invece le cellule che toccano la linea centrale delle linee triple nella parte inferiore e destra del quadrato.Ripetere il conteggio per la seconda camera di conteggio. Una volta contate le cellule, è possibile determinare il numero di cellule per millilitro. Per fare ciò, calcolare la media dei conteggi delle cellule per quadrato e moltiplicare per il fattore di diluizione e per 10.000 per ottenere il numero di cellule nel campione.Moltiplicare il numero di cellule per millilitro per il volume totale della sospensione cellulare da cui è stato prelevato il campione. Ora siamo pronti a determinare la Viabilità della nostra sospensione. Per determinare il numero di cellule vitali nel campione, utilizzeremo il blu di trian D: innanzitutto, mescolare 0,5 millilitri di blu di trian al 4%, 0,03 millilitri di HBSS e 0,1 millilitri della sospensione cellulare in un piccolo tubo, omogeneizzare accuratamente e lasciare in riposo il tubo per cinque minuti prima di caricare l’emocitometro.Le cellule vitali devono rimanere non colorate, ma le cellule morte appariranno blu al citometro ematico. Contare il numero totale di cellule e il numero totale di cellule vitali, ovvero non colorate, e calcolare la percentuale di cellule vitali nel campione. Al termine, decontaminare il coprivetrino del citometro ematico risciacquandolo con etanolo al 70% e successivamente con acqua deionizzata.Lasciarlo asciugare all'aria e conservarlo per un uso futuro. Vi abbiamo appena mostrato come determinare il numero e la vitalità delle vostre cellule in coltura. Ecco fatto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con tutti i vostri esperimenti.

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