Il protocollo testo completo di questo approccio sperimentale è disponibile in <a class="jove_content" href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract">protocolli di corrente in Biologia Cellulare.</a>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

congelamento, lo scongelamento, e celle di imballaggio per il trasporto

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Coltura di cellule di mammifero sono ampiamente utilizzati negli studi di biologia cellulare. Si richiede un numero di abilità speciali al fine di essere in grado di preservare la struttura, la funzione, il comportamento e la biologia delle cellule in coltura. Questo video descrive le competenze di base necessarie per congelare e conservare cellule e come recuperare scorte congelate.

Coltura di cellule di mammifero sono ampiamente utilizzati negli studi di biologia cellulare. Questo video descrive le competenze di base necessarie per congelare e conservare cellule e come recuperare scorte congelate.

Congelamento, lo scongelamento, e celle di imballaggio per il trasporto

Le cellule di mammifero in coltura sono utilizzate ampiamente negli studi di biologia cellulare. Per essere in grado di preservare la...

Le colture cellulari sono utilizzate in una vasta gamma di applicazioni di ricerca e diagnostica. A volte è utile conservare linee cellulari per lavori futuri, al fine di preservare le cellule, evitare la senescenza, ridurre il rischio di contaminazione e minimizzare gli effetti alla deriva genetica. Le linee cellulari possono essere congelate per la conservazione a lungo termine.In questo video, ti mostriamo come congelare cellule coltivate sia in monostrato che in sospensione, e come scongelarle per farle crescere nuovamente. Ciao, sono Ricky, del laboratorio del Dr. LAN presso la Molecular Pathology Laboratories Network nell'East Tennessee. Oggi ti mostrerò come congelare le cellule per la conservazione a lungo termine e come scongelarle dall'azoto liquido.Per congelare cellule aderenti umane, iniziare sollevandole dalla piastra come si farebbe in caso di confezionamento. Tenere presente che è preferibile utilizzare cellule in fase logaritmica di crescita per la criopreservazione. Una volta che le cellule si sono staccate e la reazione della tripsina è stata arrestata aggiungendo siero o mezzo contenente siero, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga sterile e aggiungere due millilitri.Le cellule in mezzo completo con siero provenienti da tre o più piatti della stessa sottocoltura della stessa origine possono essere unite in un unico tubo. Centrifugare le cellule per cinque minuti a 300-350 ×g a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 10 mL a quattro gradi Celsius.Mezzo completo, aggiungere un volume uguale di mezzo di congelamento a quattro gradi, mescolare accuratamente le cellule, quindi mettere il tubo sul ghiaccio e contare le cellule. Utilizzando un emocitometro, diluire la sospensione con ulteriore mezzo di congelamento per ottenere una concentrazione cellulare finale di 1 milione o 10 milioni di cellule per millilitro. Per congelare le cellule provenienti da una fiasca quadrata da 25 centimetri quasi confluenti, risospendere in circa tre millilitri di mezzo di congelamento e pipettare aliquote da un millilitro di sospensione cellulare in vial criogenici da due millilitri etichettati.Assicurarsi di stringere bene i tappi sui vial. Collocare i vial da un'ora a tutta la notte in un congelatore a -80, quindi trasferirli in un congelatore a azoto liquido. Il congelamento di cellule da coltura in sospensione è simile, in linea di principio, al congelamento di cellule da un monostrato.La differenza principale è che le colture in sospensione non devono essere trattate con tripsina. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga e centrifugare per 10 minuti a 300-350 ×g a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in mezzo di congelamento a quattro gradi, a una densità di 1 milione a 10 milioni di cellule per millilitro.Successivamente, trasferire aliquote da un mil di sospensione cellulare in provette criogeniche e congelare. Come fatto per le colture a monolayer, che nel capitolo precedente è stato dimostrato per scongelare e recuperare le provette congelate. Per prima cosa, rimuovere la provetta delle cellule dal congelatore a azoto liquido e posizionarla immediatamente in un bagno d'acqua a 37 gradi.Agitare continuamente il flaconcino fino a quando il mezzo non si sarà scongelato, il che richiede generalmente meno di 60 secondi. Una volta scongelato, pulire la parte superiore del flaconcino con etanolo al 70% prima di aprirlo. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare scongelata in un tubo da centrifuga sterile contenente due millilitri di mezzo completo caldo e siero fetale bovino al 20% da centrifugare.Centrifugare per 10 minuti a 150-200 ×g a temperatura ambiente. Questo passaggio rimuoverà qualsiasi residuo di DMSO. Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare in una piccola quantità, pari a circa un mil, di mezzo completo con 20% di FBS, quindi trasferire questa sospensione in una piastra per colture opportunamente etichettata contenente la quantità appropriata di mezzo. Generalmente, è necessario un mil di sospensione cellulare in cinque-venti mil di mezzo.Ora, dopo 24 ore, è possibile coltivare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo cinque o sette giorni, o quando l'indicatore di pH nel mezzo di coltura cambia colore, verificare che le cellule si siano attaccate alla piastra e si dovrà sostituire il mezzo di coltura. Si dovrà mantenere le colture in un mezzo contenente il 20% di FBS fino al ripristino della linea cellulare.Se la percentuale di recupero è estremamente bassa, potrebbe crescere solo una sottopopolazione della coltura originale. Prestare particolare attenzione a questo aspetto quando si lavora con linee cellulari note per essere mosaiche. Se le colture devono essere spedite, ciò può essere fatto facilmente sia per colture in monostrato che in sospensione.In fiaschi da coltura tessutale da 25 centimetri, le cellule vengono cresciute fino a raggiungere una confluenza quasi completa in un monostrato o fino alla densità desiderata in sospensione. Per le colture in monostrato, il mezzo viene prima rimosso e poi il fiasco viene riempito con mezzo fresco. È essenziale che il fiasco sia completamente riempito di mezzo per evitare che le cellule si secchino nel caso in cui i fiaschi vengano capovolti durante il trasporto.Per la sospensione, si aggiunge mezzo fresco alle colture per riempire il matraccio. Il tappo viene avvitato e fissato con del parafilm. Il matraccio viene sigillato in un sacchetto di plastica impermeabile o in un altro contenitore a prova di perdite progettato per prevenire fuoriuscite.Nel caso in cui la fiasca dovesse subire danni, il contenitore primario viene quindi posto in un contenitore isolato secondario per proteggerlo da temperature estreme durante il trasporto. Un'etichetta di pericolo per l'acquirente viene applicata all'esterno del pacco. In genere, le colture vengono trasportate in nottata o entro la notte successiva. Corrieri.Abbiamo appena mostrato come congelare e scongelare colture cellulari umane, sia per cellule aderenti che in sospensione. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con tutti i vostri esperimenti.

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Molecular Pathology Laboratory Network, Inc.  Coltura di cellule di mammifero sono ampiamente utilizzati negli studi di biologia cellulare. Questo video descrive le competenze di base necessarie per congelare e conservare cellule e come recuperare scorte congelate.

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