Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 2 di 3.
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Articolo metodologico
Dal MEF per Matrigel 2: hESC scissione dal MEF sul Matrigel
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule di alimentazione, come hESC passaggio da piastre MEF per alimentatore cell-free piastre Matrigel.
Protocollo
hESC manutenzione cultura quotidiana
- terreni di coltura hESC deve essere cambiato ogni 24 ore. Dalla bottiglia ES magazzino multimediali memorizzati a 4 ° C, estrarre la quantità di soluzione necessaria (~ 20ml per 6 pozzetti), posto in un tubo da 50 ml falco, e calda a 37 ° C in un bagno d'acqua. Una volta che la media è riscaldato, aggiungere bFGF conservato a 4 ° C ad una concentrazione finale di 10ng/ml. Mettete il brodo bFGF torna a 4 ° C subito dopo l'uso!
- Togliere dal 6 pozzetti tutti ma ~ 500μl dei media. Assicurati di agitare il piatto cultura di sospendere i detriti per la rimozione. Assicurarsi che il bFGF in terreni di coltura....
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Discussione
Questo video mostra come hESC passaggio da piastre MEF per alimentatore cell-free piastre Matrigel. Si noti che la densità colonia su Matrigel è superiore alla densità delle colonie dividendo consueto MEF. Immunofluorescenza e la citometria a flusso o microscopia per i marcatori hESC pluripotenza, come Oct-4 e SSE-4, sono necessari per confermare la manutenzione di hESC in uno stato indifferenziato di alimentazione priva di condizioni di coltura.
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Ringraziamenti
Embrionali umane studi sulle cellule staminali in laboratorio Teitell sono supportati da una California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) sementi concedere RS1-00313. Ringraziamo i membri del Centro di Medicina Rigenerativa Broad e ricerca sulle cellule staminali presso la UCLA, in particolare il Dott. Amander Clark, il Dr. Jerome Zack, e membri del Fondo per la UCLA Stem Cell Institute Broad core per il loro sostegno dei nostri studi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Sostituto del siero per knockout (KSR) | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Aminoacidi non essenziali | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagente | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutammina | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagente | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagente | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenasi IV | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispasi | Reagente | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillina / Stretomicina | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatina | Reagente | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagente | BD Biosciences | 354277 | |
| Anticorpo anti-Oct-4 | Reagente | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| Anticorpo monoclonale di topo IgG3 coniugato con fito–eritrina anti-h/mSSEA-4 | Reagente | R&D Systems | FAB1435P | |
| Antitopo IgG coniugato con FITC | Reagente | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Riferimenti
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK.
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Ristampe e permessi
