Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 3 di 3.
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Articolo metodologico
Dal MEF per Matrigel 3: hESC Passaging da Matrigel su Matrigel
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata.
Protocollo
HESC scissione da Matrigel a Matrigel
Di solito un confluenti 6 pozzetti di hESC su Matrigel possono essere divisi 1:03-01:05 ad un altro piatto Matrigel, con i pozzi di diventare confluenti ancora 4-5 giorni dopo la divisione.
- CM e le piastre Matrigel sono preparati come descritto in precedenza prima di sciogliersi.
- Il giorno della scissione, lavare i pozzetti per la scissione con 1 × PBS, pH7.4, aggiungere 1 ml di 1mg/ml dispasi (soluzione madre diluita 5mg/ml con DMEM/F12 media) in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 3 min.
- Lavare i pozzetti tre volte con 1 × PBS, pH7.4, aggiungere 1 ml di ES media s....
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Discussione
Questa serie di 3 video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule di alimentazione (video 1), come passaggio a Matrigel cell-free alimentatore piastre (video 2), e come mantenere hESC da passaging in alimentatore Matrigel condizioni cell-free (video 3). Numerosi studi precedenti hanno mostrato che il mantenimento della vitali, hESC indifferenziato richiede cultura sulle cellule inattivate alimentatore MEF. Tuttavia, per molti esperimenti, una popolazione pura di .......
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Ringraziamenti
Embrionali umane studi sulle cellule staminali in laboratorio Teitell sono supportati da una California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) sementi concedere RS1-00313. Ringraziamo i membri del Centro di Medicina Rigenerativa Broad e ricerca sulle cellule staminali presso la UCLA, in particolare il Dott. Amander Clark, il Dr. Jerome Zack, e membri del Fondo per la UCLA Stem Cell Institute Broad core per il loro sostegno dei nostri studi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Sostituto del siero per knockout (KSR) | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Aminoacidi non essenziali | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagente | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutammina | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagente | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagente | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenasi IV | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispasi | Reagente | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillina / Stretomicina | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatina | Reagente | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagente | BD Biosciences | 354277 | |
| Anticorpo anti-Oct-4 | Reagente | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| Anticorpo monoclonale di topo IgG3 coniugato con fito–eritrina anti-h/mSSEA-4 | Reagente | R&D Systems | FAB1435P | |
| Anticorpo secondario anti-coniglio IgG coniugato con FITC | Reagente | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Riferimenti
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK.
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Ristampe e permessi
