Una tecnica rapida per la visualizzazione di Live cellule di lievito immobilizzato

Sommario

Una tecnica rapida per la visualizzazione di crescere cellule di lievito immobilizzate, qui applicata ai giornalisti fluorescenti al silenzioso accoppiamento loci HML e HMR

Abstract

Vi presentiamo qui una tecnica semplice, rapido ed estremamente flessibile per l'immobilizzazione e la visualizzazione di cellule di lievito in crescita mediante microscopia in epifluorescenza. La tecnica è ideale per la visualizzazione delle popolazioni di lieviti statica, o corsi di tempo esperimenti fino a dieci ore di lunghezza. Il mio microscopia indaga l'eredità epigenetica al loci di accoppiamento in silenzio di S. cerevisiae. Ci sono due loci di accoppiamento silenzioso, HML e HMR, che normalmente non sono espressi come sono confezionati in eterocromatina. Nel silenzio sir1 sfondo mutante è indebolito in modo tale che ciascun locus può essere nello stato espresso o tacere epigenetico, così nella popolazione nel suo complesso vi è un mix di cellule di diversi stati epigenetici sia per HML e HMR. Il mio microscopio ha dimostrato che non esiste una relazione tra lo stato epigenetico di HML e HMR in una singola cella. sir1 cellule stocasticamente interruttore stati epigenetici, che stabilisce il silenziamento di un locus precedentemente espresso o esprimono un locus precedentemente messo a tacere. Il mio corso di microscopia volta rintracciato sir1 singole cellule e la loro progenie di segnare la frequenza di ognuna delle quattro interruttori possibile epigenetica, e quindi la stabilità di ciascuno degli stati epigenetici in sir1 cellule. Vedi anche Xu et al. Mol. Cell 2006.

Protocollo

1. Cellule immobilizzate per l'epifluorescenza corso del tempo. Si prega di notare che questo protocollo è utile solo se le lenti dell'obiettivo del microscopio sono al di sotto del portaoggetti.
   
   
2. Cellule posto a concentrazione desiderata in mezzo liquido su un vetrino lungo (circa 24x50mm)
   
   
3. Tagliare un blocco di agar della dimensione desiderata da un piatto di sintesi dei media (questi sono inferiori autofluorescenza) e posto sulle celle. Posizionare il lato del blocco di agar non gestiti da una pinzetta in contatto con le cellule.
   
   
4. Per i corsi di tempo più brevi (fino a 3 ore), questa impostazione è sufficiente. Se le cellule si muovono quando visualizzato sul microscopio, abbassare il volume delle cellule o area incremento del blocco di agar.
   
   
5. Per i corsi di tempo più lungo, mettere una goccia di fresca liquidi sulla parte superiore del blocco di agar, e posto una lastra di vetro sulla parte superiore del blocco di agar. Questa diapositiva riduce l'evaporazione attraverso la parte superiore del blocco di agar. Se lo si desidera, i bordi del blocco di agar in contatto con la polizza di copertura può essere sigillato con vaselina per ridurre ulteriormente l'umidità. Ho usato questo set up per i film fino a 9 ore, con la divisione cellulare a tariffe di tipo selvatico.

Discussione

Si tratta di una tecnica rapida che immobilizza le cellule di lievito, pur consentendo la crescita. Abbiamo seguito la crescita del lievito per un massimo di dieci ore, con il lievito selvatico visualizzazione tassi di divisione tipo tutto l'esperimento. Si noti che questa configurazione richiede la lente dell'obiettivo da sotto il palco microscopio.