Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Sommario

Questo video dimostra a 2 colori montare tutto ibridazione in situ, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale dei 2 geni differenti possono essere visualizzati in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham e David Ish-Horowicz.

Abstract

L'embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare l'espressione genica nel cervello, del tubo neurale, somite e il cuore la formazione di primordi. Questo video mostra le varie fasi a 2 colori montare tutto ibridazione in situ; In primo luogo, l'embrione è sezionato dall'uovo e fissati in paraformaldeide. In secondo luogo, l'embrione è trasformato per prehybridization. L'embrione viene quindi ibridato con due sonde diverse, una accoppiata a scavare, e uno accoppiato al FITC. A seguito di ibridazione durante la notte, l'embrione viene incubato con l'anticorpo DIG accoppiati. Reazione del colore per substrato DIG viene eseguita, e la regione di interesse appare blu. L'embrione viene quindi incubato con anticorpo FITC accoppiati. L'embrione è trasformato per una reazione a colori con FITC, e la regione di interesse appare rosso. Infine, l'embrione è fisso e trattati per phtograph e sezionamento. Una guida alla risoluzione è anche presentato.

Protocollo

Parte 1: fissaggio degli embrioni

1. Riempire piatto dissezione di ghiaccio freddo DEPC-PBS. Tenere su ghiaccio. Aprire l'uovo toccando il guscio con una pinza e rimuovere pezzi di conchiglia.
2. Rimuovere spessore albumina con una pinza. Tilt sacco vitellino con una pinza grossolana in modo che embrione rivolto verso l'alto.
3. Utilizzando le forbici, tagliare un quadrato di tutto il sacco vitellino dell'embrione.
4. Utilizzando un cucchiaio, togliere embrione dal tuorlo e luogo sul ghiaccio freddo DEPC-PBS.
5. Sotto il microscopio, rimuovere membrane e tuorlo e trasferimento piatto fissazione.
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Discussione

Il 2-colore montare tutto nel metodo di ibridazione in situ è ​​utilizzato per determinare sia i modelli spaziali e temporali di espressione genica, utilizzando uno o due geni di interesse. Le applicazioni includono la valutazione dei pattern di espressione genica di nuovi geni (ad esempio ^1,2, così come i cambiamenti nel gene insulto seguente espressione (manipolazione embrionale ^3, perline ^4, ed elettroporazione di RNA o DNA costruisce ^5).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Uova	Animale	Charles River Laboratories	Premium Fertile
Stereomicroscopio	Microscopio	Leica Microsystems	MZ9.5
Incubatrice automatica Marsh	Strumento	Lyon	RX
Incubatrice per ibridazione	Strumento	Hybaid	Micro-4
Mixer orbitale Adams Nutator	Strumento	Fisher Scientific	14-062
Pinze curve (1)	Strumento	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forbici fini	Strumento	Fine Science Tools	14161-10
Cucchiaio	Strumento	Fine Science Tools	10370-18
Pipetta capillare Pasteur		Electron Microscopy Sciences	70950-12
Tubo microcapillare		Sigma-Aldrich	P1049-1PAK	Tirare utilizzando un estrattore verticale per micropipette; arrotondare l'estremità con pinze fini
Lama per microdissezione		Fine Science Tools	10056-12	Utilizzare per forare le cavità prima dell'ibridazione in situ
Perlini 0,2 mm di diametro		Fine Science Tools	26002-20	Mantenere i perlini insieme utilizzando un agitatore magnetico;
Agente indurente e base di elastomero siliconico Sylgard 184	Reagente	Dow Corning	0001986475	Mescolare 1 parte di agente indurente con 9 parti di base; lasciare solidificare O/N a 37 °C
Diethylpirocarbonato (DEPC)	Reagente	Acros Organics	10025025	Aggiungere 1 ml di DEPC a 1 l di PBS; agitare; autoclavare
PFA al 16%	Reagente	Electron Microscopy Sciences	15710
Tween-20	Reagente	Sigma-Aldrich	P1379-100ML
Proteinasi K		Sigma-Aldrich	P2308-5MG	Preparare una soluzione madre a 10 mg/ml in H₂O-DEPC in aliquote da 10 µl. Conservare a -20 °C.
Formammide, deionizzata	Reagente	Ambion	9342
tRNA di lievito - 25 mg	Reagente	Invitrogen	15401-011	Preparare una soluzione madre a 20 mg/ml in H₂O-DEPC in aliquote da 125 µl. Conservare a -20 °C
Eparina sodica	Reagente	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	Preparare una soluzione madre a 50 mg/ml in H₂O-DEPC in aliquote da 100 µl. Conservare a -20 °C.
SSC 20x pH 5,5	Reagente	Fisher Scientific	PR-V4261
EDTA (0,5 M)	PR-V4231	Fisher Scientific
SDS	Reagente	Fisher Scientific	BP166-100
Acido malico	Reagente	Fluka	63189
Reagente bloccante B–hringer	Reagente	Roche Group	11096176001	Utilizzare al 2% in MABT. Per prepararlo, riscaldare con MABT per 20 min a 60 °C. È possibile preparare una soluzione madre e conservarla in aliquote da 1-5 ml a 20 °C.
Serum di pecora inattivato per riscaldamento	Reagente	Jackson ImmunoResearch	013-000-121	Sciogliere in 10 ml di H₂O; riscaldare a 550 °C per 30 min. Aliquotare da 1 ml e conservare a -20 °C.
Anti-digossigenina-AP, frammenti Fab	Reagente	Roche Group	11093274910
Soluzione madre NBT/BCIP	Reagente	Roche Group	11681451001
Anti-fluoresceina-AP, frammenti Fab	Reagente	Roche Group	11426338910
Tris 2 M	BP1759-500	Fisher Scientific
Kit substrato per fosfatasi alcalina Vector Red	Reagente	Vector Laboratories	SK-5100
1,2,3,4-tetraidronaftalene	Reagente	Sigma-Aldrich	429325-100ML	Sotto cappa