Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Sommario

Questo video dimostra a 2 colori montare tutto ibridazione in situ, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale dei 2 geni differenti possono essere visualizzati in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham e David Ish-Horowicz.

Abstract

L'embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare l'espressione genica nel cervello, del tubo neurale, somite e il cuore la formazione di primordi. Questo video mostra le varie fasi a 2 colori montare tutto ibridazione in situ; In primo luogo, l'embrione è sezionato dall'uovo e fissati in paraformaldeide. In secondo luogo, l'embrione è trasformato per prehybridization. L'embrione viene quindi ibridato con due sonde diverse, una accoppiata a scavare, e uno accoppiato al FITC. A seguito di ibridazione durante la notte, l'embrione viene incubato con l'anticorpo DIG accoppiati. Reazione del colore per substrato DIG viene eseguita, e la regione di interesse appare blu. L'embrione viene quindi incubato con anticorpo FITC accoppiati. L'embrione è trasformato per una reazione a colori con FITC, e la regione di interesse appare rosso. Infine, l'embrione è fisso e trattati per phtograph e sezionamento. Una guida alla risoluzione è anche presentato.

Protocollo

Parte 1: fissaggio degli embrioni

1. Riempire piatto dissezione di ghiaccio freddo DEPC-PBS. Tenere su ghiaccio. Aprire l'uovo toccando il guscio con una pinza e rimuovere pezzi di conchiglia.
2. Rimuovere spessore albumina con una pinza. Tilt sacco vitellino con una pinza grossolana in modo che embrione rivolto verso l'alto.
3. Utilizzando le forbici, tagliare un quadrato di tutto il sacco vitellino dell'embrione.
4. Utilizzando un cucchiaio, togliere embrione dal tuorlo e luogo sul ghiaccio freddo DEPC-PBS.
5. Sotto il microscopio, rimuovere membrane e tuorlo e trasferimento piatto fissazione.
6. Definire, rimuovere DEPC-PBS. Sostituire con 4% PFA in DEPC-PBS e fissare O / N a 4 ° C.
7. Rimuovere fissativo. Sostituire con ghiaccio freddo DEPC-PBS. Utilizzando un ago smussato fine microcapillare o un coltello microdissezione, perforare il sistema nervoso e le cavità del cuore, per evitare cattura della sonda.
8. Lavare 2x 10 mn DEPC-PBS con 0,1% di Tween-20 (PBT). Disidratare 10 minuti ciascuno in 25%, 50%, 75% di metanolo in PBT. Disidratare embrioni due volte in 100% di metanolo. Conservare a -20 ° C nel metanolo.

Parte 2: Prehybridization

1. Reidratare embrioni 10 minuti ciascuna nel 75%, 50% e 25% di metanolo in PBT. Lavare 2x 10 mn in PBT.
2. Nel frattempo, preparare fissativo freddo ghiaccio (4% paraformaldeide in PBT). Sostituire PBT con soluzione proteinasi K (3 ml / flacone; [? 5 g / ml] finale in PBT). Assicurarsi che la fiala intera è esposta alla soluzione proteinasi K da dolci colline del flaconcino, vedere Risoluzione dei problemi per tempi di esposizione.
3. Utilizzando RNasi libero pipetta Pasteur rimuovere proteinasi K e aggiungere fissativo (2 ml). Immediatamente posto in ghiaccio per esattamente 20 minuti.
4. Tutti i lavaggi RT vengono eseguite su nutator. Lavare 2x 10 milioni nel PBT, e 1x 10mn in PBT contenente tampone di ibridazione 50%.
5. Lavare 1x nel buffer di ibridazione. Incubare a 65 ° C in 2 ml di buffer di ibridazione per 4-5 ore.

Parte 3: gli embrioni ibridare con sonde

1. DIG e FITC sintesi accoppiata sonda è descritto in appendice. La sonda dovrebbe dare un segnale forte, dovrebbe essere synhesized con FITC contenenti nucleotidi, la sonda più deboli dovrebbero essere sintetizzati con con DIG contenenti nucleotidi.
2. Preriscaldare sonde in tampone di ibridazione (500 ng / ml) utilizzando un flaconcino da 2 ml. Immediatamente sostituire il tampone di ibridazione con la soluzione della sonda. Non lasciare che gli embrioni a secco. Incubare per 16 ore a 65 ° C.
3. Sostituire la sonda con tampone di ibridazione, 2 lavaggi, 30 minuti ciascuna a 65 ° C. Lavare 15 minuti in tampone di ibridazione / MABT (1 / 1 v / v /) a 65 ° C.

Parte 4: incubazione degli anticorpi DIG e colore di reazione

1. Lavare 2x20 milioni nel MABT. Lavare 1 ora in 2% BBR / MABT. Lavare 5 ore nel 2% BBR/20% HISS / MABT (tampone di bloccaggio). Incubare in anticorpi 1:2000 DIG diluito in tampone di bloccaggio, O / N a 4 ° C su nutator.
2. Lavare 3x 10 minuti ciascuno in MABT, e 3x 1 ora ciascuno in MABT.
3. Lavare 2x 20 milioni nel NTMT. Aggiungi 200ul NBT / BCIP substrato NTMT a 10 ml. Rimuovere immediatamente NTMT dal flacone e sostituirlo con 1-2 ml NBT / BCIP buffer. Posto al buio. Monitorare la reazione del colore dopo 20 minuti, e ad intervalli di 20 minuti dopo.
4. A seguito di reazione di colore (dovrebbe apparire blu), lavare in PBS per 10 milioni di euro, da definire sulla fissazione piatto pieno di PBS, e sostituire la soluzione con 4% PFA in PBS. Fix O / N a 4 ° C.
5. Trasferimento a fiala di scintillazione nuovo. Lavare in PBST (PBS con 1% di Tween-20) 2x10 mn. Lavare in MABT 2x 10 mn.
6. Incubare in MABT 30 mn a 63 ° C.

Parte 5: incubazione anticorpo FITC e il colore di reazione

1. Lavare 2x 10 milioni nel MABT, 1 ora in 2% BBR / MABT, 5 ore in tampone di bloccaggio
2. Incubare in fosfatasi alcalina accoppiamento anti-FITC-anticorpo (1:500) O / N a 4 ° C.
3. Lavare 3x 10 minuti ciascuno in MABT, e 3x 1 ora ciascuno in MABT.
4. Lavare in 2x 20 milioni nel TBS pH 8,45 con 0,1% di Tween-20 (TBST).
5. Preparare vettore soluzione Rosso di lavoro (5 ml) in TBST utilizzando reagenti 1,2 e 3 fornito in kit. Rimuovere immediatamente TBST dal flacone e sostituirlo con tampone vettore rosso. Posto al buio. Monitorare la reazione del colore dopo 40 milioni di euro, e ad intervalli di 30 minuti dopo.
6. Colore seguente reazione (dovrebbe apparire rosso), il trasferimento di embrioni PBS.

Parte 6: Fissazione ed elaborazione

1. Trasferimento al piatto fissazione contenente PBS, e fissare nel 4% PFA per 20 minuti a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
2. Lavare in PBS, 2x 10 mn. Al processo per la fotografia, il trasferimento del 20% glicerolo in PBS (questo renderà gli embrioni traslucido). Per creare una camera, taglio 2 strisce di nastro adesivo in PVC, sovrapporle sul vetrino. Tagliare una piazza del centro con una lama. Rimuovere le pinze piazza utilizzando.
3. Al processo per il sezionamento cera, trasferimento a PBS, lavare 2x 10 mn, disidratano in serie graduata di metanolo (25%, 50%, 75% e 100% in PBS, a 10 minuti ciascuno).
4. Sostituire con propanolo, 3mn. Sostituire con 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, 20 minuti seguita da Histoclear (2 x 1 ora). Sostituire con histoclear / cera 1 / 1 (v / v) 60 ° C per 1 ora. Sostituire con cera un processoper l'esame istologico.

Parte 7: Soluzioni

Buffer di ibridazione, conservare a -20 ° C in Falcon da 50 ml: 25 formammide ml 3,25 ml (20xSSC), 0,5 ml (0,5 M EDTA), 1 ml (10% di Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml tRNA);. 100ul (50 mg / ml di eparina) MABT, preparare 100mM acido maleico, il pH a 7,5 con NaOH pellet. Aggiungi 150mm NaCl e lo 0,1% Tween-20.

NTMT (fatta al momento dell'uso), 50 ml: 1 ml (5M NaCl), 2,5 ml (2 M Tris-HCl pH9.5), 1,25 ml (2M MgCl _2), 5 ml (10% di Tween-20).

TBST: 0.1M Tris-HCl, 0,15 m di NaCl, pH 8,45, 0,1% Tween-20.

Parte 8: Risoluzione dei problemi

Problema	Causa	Rimedio
Embrione è arrotolato	Disidratazione insufficiente / reidratazione	Mantenere intervalli di 10 minuti durante la successiva disidratazione / reidratazione passi
Non vi è alcun segnale della sonda	La sonda è degradata contaminazione RNasi in flaconcino	Esegui sonda su 1% gel Assicurarsi che la fiala intera è esposta alla soluzione proteinasi K al punto 2
Sonda è cavità etichette di cuore un tubo neurale	Sonda è intrappolato	Al punto 2, assicurarsi che tutte le cavità sono perforate coltello microdissezione con o microcapillare
Embrione disintegrato ibridazione seguente (punto 3)	Proteinasi K passo sinistra temperatura di ibridazione troppo a lungo è troppo alta	Proteinasi K non deve essere lasciato più lungo di 1mn (stadi 3 + e 4), 2 milioni (fase 5 a 7), 3 milioni di euro (stadio 8-10), 4 milioni di euro (stadio 11-13) Non ibridizzare a T o superiore di 65 ° C

Parte 9: Risultati Rappresentante

Embrioni rappresentante sono riportati di seguito: (A) Embrione (stadio HH7) è etichettato con un DIG-Sox sonda (blu) e una FITC-delta-1 sonda (rosso). (B) Embrione (stadio HH8) è etichettato con un DIG-Pax6 sonda (blu) e una FITC-Shh sonda (rosso). Nf, neurali piega, anp, piastra neurale anteriore, PSM, mesoderma presomitic, n, notocorda, nt, del tubo neurale). Doni sonda dai laboratori di Drs. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, e J. Briscoe.

Discussione

Il 2-colore montare tutto nel metodo di ibridazione in situ è ​​utilizzato per determinare sia i modelli spaziali e temporali di espressione genica, utilizzando uno o due geni di interesse. Le applicazioni includono la valutazione dei pattern di espressione genica di nuovi geni (ad esempio ^1,2, così come i cambiamenti nel gene insulto seguente espressione (manipolazione embrionale ^3, perline ^4, ed elettroporazione di RNA o DNA costruisce ^5).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Uova	Animale	Charles River Laboratories	Premium Fertile
Stereomicroscopio	Microscopio	Leica Microsystems	MZ9.5
Incubatrice automatica Marsh	Strumento	Lyon	RX
Incubatrice per ibridazione	Strumento	Hybaid	Micro-4
Mixer orbitale Adams Nutator	Strumento	Fisher Scientific	14-062
Pinze curve (1)	Strumento	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forbici fini	Strumento	Fine Science Tools	14161-10
Cucchiaio	Strumento	Fine Science Tools	10370-18
Pipetta capillare Pasteur		Electron Microscopy Sciences	70950-12
Tubo microcapillare		Sigma-Aldrich	P1049-1PAK	Tirare utilizzando un estrattore verticale per micropipette; arrotondare l'estremità con pinze fini
Lama per microdissezione		Fine Science Tools	10056-12	Utilizzare per forare le cavità prima dell'ibridazione in situ
Perlini 0,2 mm di diametro		Fine Science Tools	26002-20	Mantenere i perlini insieme utilizzando un agitatore magnetico;
Agente indurente e base di elastomero siliconico Sylgard 184	Reagente	Dow Corning	0001986475	Mescolare 1 parte di agente indurente con 9 parti di base; lasciare solidificare O/N a 37 °C
Diethylpirocarbonato (DEPC)	Reagente	Acros Organics	10025025	Aggiungere 1 ml di DEPC a 1 l di PBS; agitare; autoclavare
PFA al 16%	Reagente	Electron Microscopy Sciences	15710
Tween-20	Reagente	Sigma-Aldrich	P1379-100ML
Proteinasi K		Sigma-Aldrich	P2308-5MG	Preparare una soluzione madre a 10 mg/ml in H₂O-DEPC in aliquote da 10 µl. Conservare a -20 °C.
Formammide, deionizzata	Reagente	Ambion	9342
tRNA di lievito - 25 mg	Reagente	Invitrogen	15401-011	Preparare una soluzione madre a 20 mg/ml in H₂O-DEPC in aliquote da 125 µl. Conservare a -20 °C
Eparina sodica	Reagente	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	Preparare una soluzione madre a 50 mg/ml in H₂O-DEPC in aliquote da 100 µl. Conservare a -20 °C.
SSC 20x pH 5,5	Reagente	Fisher Scientific	PR-V4261
EDTA (0,5 M)	PR-V4231	Fisher Scientific
SDS	Reagente	Fisher Scientific	BP166-100
Acido malico	Reagente	Fluka	63189
Reagente bloccante B–hringer	Reagente	Roche Group	11096176001	Utilizzare al 2% in MABT. Per prepararlo, riscaldare con MABT per 20 min a 60 °C. È possibile preparare una soluzione madre e conservarla in aliquote da 1-5 ml a 20 °C.
Serum di pecora inattivato per riscaldamento	Reagente	Jackson ImmunoResearch	013-000-121	Sciogliere in 10 ml di H₂O; riscaldare a 550 °C per 30 min. Aliquotare da 1 ml e conservare a -20 °C.
Anti-digossigenina-AP, frammenti Fab	Reagente	Roche Group	11093274910
Soluzione madre NBT/BCIP	Reagente	Roche Group	11681451001
Anti-fluoresceina-AP, frammenti Fab	Reagente	Roche Group	11426338910
Tris 2 M	BP1759-500	Fisher Scientific
Kit substrato per fosfatasi alcalina Vector Red	Reagente	Vector Laboratories	SK-5100
1,2,3,4-tetraidronaftalene	Reagente	Sigma-Aldrich	429325-100ML	Sotto cappa