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Biocarburanti: produzione di etanolo da materiali cellulosici

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Biofuels: Producing Ethanol from Cellulosic Material

1.3: Using GIS to Investigate Urban Forestry

1.15: Analysis of Earthworm Populations in Soil

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07:34 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratori di Margaret Workman e Kimberly Frye – Depaul University

In questo esperimento, il materiale cellulosico (come gambi di mais, foglie, erbe, ecc.) sarà utilizzato come materia prima per la produzione di etanolo. Il materiale cellulosico viene prima pretrattato (macinato e riscaldato), digerito con enzimi e quindi fermentato con lievito. La produzione di etanolo viene monitorata utilizzando una sonda a etanolo. L’esperimento può essere esteso per ottimizzare la produzione di etanolo variando la materia prima utilizzata, le condizioni di pretrattamento, la variazione enzimatica, la variazione del lievito, ecc. Un metodo alternativo di monitoraggio della reazione consiste nel misurare l’anidride carbonica prodotta (utilizzando un sensore di gas) al posto dell’etanolo. Come alternativa a bassa tecnologia, i glucometri (che si trovano in qualsiasi farmacia) possono essere utilizzati per monitorare il glucosio durante il processo, se non è disponibile una sonda di etanolo o un sensore di gas di anidride carbonica.

Con una maggiore enfasi sull'”apprendimento basato sull’indagine”, le sonde scientifiche stanno diventando sempre più popolari. Dispositivi portatili come il Vernier Lab Quest utilizzati in combinazione con una varietà di sonde (come quelle per conducibilità, ossigeno disciolto, tensione e altro) consentono una minore attenzione alla raccolta di dati e / o alla creazione di grafici e più sull’analisi dei dati e sulla previsione. Un altro vantaggio è che questi sono piccoli e leggeri e possono essere portati sul campo per le misurazioni.

Principles

Gli Stati Uniti stanno cercando di svezzare se stessi dai combustibili fossili, in particolare dal petrolio utilizzato nella benzina. Il cambiamento climatico globale, la dipendenza da paesi stranieri e l’aumento dell’instabilità politica in tutto il mondo sono solo alcune delle ragioni per cui. Un modo possibile per ridurre la dipendenza dal petrolio come carburante per il trasporto è utilizzare più etanolo. Attualmente, la benzina normale contiene circa il 10% di etanolo come additivo. I veicoli speciali flex-fuel possono utilizzare benzina E85, che è l’85% di etanolo. ¹

In Brasile, l’etanolo è prodotto utilizzando la canna da zucchero come materia prima. Il prodotto principale della canna da zucchero è il saccarosio, che è un disaccaride di glucosio e fruttosio. La maggior parte delle specie di lievito hanno l’enzima sucrasi e sono in grado di scindere il legame glucosio-fruttosio. Il saccarosio (C₁₂H₂₂O₁₁₎viene fermentato dal lievito per produrre etanolo e anidride carbonica. La reazione chimica complessiva è mostrata nell’equazione 1. ^2,3

Tuttavia, negli Stati Uniti, l’etanolo è prodotto dal mais. Il mais immagazzina carboidrati come un polisaccaride chiamato amido. Ciò richiede uno sforzo maggiore rispetto alla produzione di etanolo dalla canna da zucchero perché il lievito non può scindere i legami nell’amido. Per produrre etanolo dal mais, prima i chicchi di mais devono essere macinati, quindi il mais macinato trattato con enzimi per convertire l’amido nel mais in glucosio. Dopo questa fase, il processo continua come nel metodo della canna da zucchero sopra utilizzando il lievito per fermentare il glucosio in etanolo e anidride carbonica. La reazione chimica è mostrata nell’equazione 2. ²

La produzione di etanolo dal mais è problematica, tuttavia. Per prima cosa, toglie un po ‘di mais dall’approvvigionamento alimentare, in particolare i mangimi per il bestiame, facendo così salire i prezzi. È anche energivoro e fertilizzante per produrre mais, diminuendo la sua desiderabilità come carburante per il trasporto alternativo al petrolio. Pertanto, gli scienziati si rivolgono sempre più al materiale cellulosico per produrre etanolo. Questi materiali includono legno, erbe e parti non commestibili delle piante. Questi sono più desiderabili in quanto non influiscono sull’approvvigionamento alimentare. Tuttavia, al fine di rilasciare il glucosio dal materiale cellulosico, è necessario molto più sforzo, poiché il glucosio dal materiale cellulosico è legato in cellulosa, che viene quindi avvolto con emicellulosi e lignina. In primo luogo la cellulosa deve essere estratta dalle emicellulosi e dai leganti della lignina. Questo viene fatto attraverso un pretrattamento della macinazione e dell’idrolisi acida. Quindi, la cellulosa viene trattata con enzimi per scomporla nel suo glucosio componente. Infine, il glucosio può essere fermentato con lievito per produrre etanolo e acqua. Il processo può essere riassunto come mostrato nell’equazione 3.

Questo è attualmente troppo dispendioso in termini di energia per renderlo un metodo pratico per la produzione di etanolo su larga scala. Tuttavia, la ricerca è in corso per migliorare il processo. ^2,3

Procedure

1. Preparazione del campione

Selezionare il materiale cellulosico da utilizzare come materia prima. Questo può essere gambi di mais, erbe, foglie, lettiere per animali domestici o carta.
Utilizzando un macinino a sfere (o un macinino da caffè se il macinino a sfere non è disponibile), macinare le materie prime in una polvere fine senza pezzi di grandi dimensioni rimanenti.
Misurare 1,0 g di materia prima e posizionarla in un tubo centrifuga da 50 ml. Etichettare il tubo con la materia prima scelta.
Etichettare un secondo tubo centrifugo da 50 ml come “Controllo”. Non mettere alcuna materia prima in questo tubo.

2. Pretrattamento

Impostare un becher da 500 ml con circa 400 ml di acqua su una piastra elettrica e riscaldare a ebollizione delicata.
Aggiungere 25 ml di acqua distillata ai 2 tubi della centrifuga. Vortice da mescolare. Mettere il tappo sui tubi della centrifuga liberamente.
Mettere i tubi della centrifuga nel becher pieno di acqua bollente delicatamente. Assicurarsi che l’acqua dal bagno d’acqua non fuoriesca nei tubi. Lasciare bollire per 30 min.
Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente.

3. Digestione enzimatica

Aggiungere 1 mL di enzima cellulasi ad entrambi i tubi.
Mettere i tubi in un’incubatrice a 50 °C per 24 ore.
Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente.

4. Fermentazione

Aggiungere 1,0 g di lievito attivo (il normale lievito del negozio di alimentari è ok) a ciascuno dei tubi della centrifuga. Vortice da mescolare.
Metti una camera d’aria sopra il tubo della centrifuga. L’airlock consente alla CO₂ di fuoriuscire, mantenendo bassa la pressione nel tubo della centrifuga.
Posizionare i tubi della centrifuga in una griglia e mettere in un incubatore a 37 °C per 24 ore.
Utilizzando un sensore di etanolo, misurare la concentrazione di etanolo nel tubo di controllo (Figura 1). I sensori di etanolo possono essere acquistati tramite Vernier o PASCO per circa $ 100 ciascuno.

Figura 1. Sonda a etanolo che misura la concentrazione di etanolo nel tubo di controllo.
Utilizzando un sensore di etanolo, misurare la concentrazione di etanolo nella provetta del campione (Figura 2).

Figura 2. Tablet portatile con percentuale di etanolo.

I biocarburanti sono combustibili derivati da materia biologica, come le piante. I biocarburanti servono come alternativa ai combustibili fossili, in quanto possono essere acquistati da colture in molte parti del mondo. Inoltre, sono più puliti bruciando, riducendo così le emissioni di gas serra.

Uno dei biocarburanti più utilizzati è l’etanolo derivato dalla biomassa vegetale, tipicamente canna da zucchero e mais. Negli Stati Uniti, la maggior parte dei biocarburanti a base di etanolo è prodotta dal mais.

L’uso delle colture di mais come materia prima è controverso, poiché il mais è ad alta intensità energetica per crescere, utilizza una grande quantità di fertilizzanti e il suo uso come materia prima rimuove una grande quantità di mais dall’approvvigionamento alimentare, in particolare i mangimi per il bestiame. Di conseguenza, l’uso di altri materiali vegetali o materiali lignocellulosici, come erba, foglie, carta e parti non commestibili delle colture è in aumento.

Questo video coprirà le basi della derivazione dell’etanolo da materiale lignocellulosico e dimostrerà la produzione di etanolo da materie prime lignocellulosiche in laboratorio.

La biomassa lignocellulosica si riferisce alla materia vegetale con pareti cellulari legnose. Questo tipo di materia vegetale è una delle materie prime più abbondanti disponibili, in quanto è spesso un prodotto di scarto dell’agricoltura e della produzione.

Le pareti cellulari sono composte dal polimero altamente reticolato, la lignina e due carboidrati complessi, l’emicellulosa e la cellulosa. La cellulosa è la fonte primaria di zuccheri fermentabili, come il glucosio, ma deve essere prima separata dai componenti lignina ed emicellulosa.

Il primo passo nella lavorazione del materiale lignocellulosico è quello di macinare finemente la sostanza vegetale secca in polvere. La materia prima macinata viene quindi sottoposta a pretrattamento per abbattere la barriera di lignina ed emicellulosa nella parete cellulare e consentire l’accesso alla cellulosa.

Successivamente, la cellulosa viene trattata con enzimi idrolitici, come cellulasi ed emicellulasi. L’idrolisi enzimatica scompone la cellulosa in glucosio. Infine, il glucosio viene fermentato con lievito per produrre etanolo.

Il seguente esperimento dimostra questo metodo graduale di produzione di etanolo dalla biomassa cellulosica attraverso la rimozione di lignina ed emicellulosa, seguita dal trattamento enzimatico della cellulosa e dalla fermentazione del glucosio per produrre etanolo.

In questo esperimento, l’etanolo sarà prodotto da stover di mais, foglie e gambi di piante di mais. Utilizzando una smerigliatrice a sfere, macinare la materia prima in una polvere fine e assicurarsi che non rimangano pezzi di grandi dimensioni.

Pesare 1 g di materia prima, metterla in un tubo di centrifuga da 50 ml ed etichettarla. Etichettare un secondo tubo come campione di controllo e non aggiungere alcuna materia prima. Per pretrattare i campioni, impostare un becher da 500 ml con circa 400 ml di acqua e portarlo a ebollizione delicata.

Aggiungere 25 ml di acqua distillata ai due tubi della centrifuga preparati e tapparli liberamente. Ruotare i tubi per mescolare. Posizionare i tubi nell’acqua bollente e assicurarsi che l’acqua del bagno non fuoriesca nei tubi. Lasciarli bollire per 30 minuti, quindi rimuoverli e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.

Una volta raffreddati i tubi, aggiungere 1 mL di enzima cellulasi ad entrambi i tubi. Posizionare i tubi in un’incubatrice per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere i tubi e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. L’etanolo è prodotto dal materiale cellulosico digerito attraverso la fermentazione da parte del lievito. Per iniziare questo processo, aggiungere 1 g di lievito attivo a ciascuno dei tubi della centrifuga e ruotare per mescolare.

Posizionare un airlock sui tubi della centrifuga. L’airlock consente all’anidride carbonica generata durante la fermentazione di fuoriuscire in modo che la pressione non si accumuli nel tubo. Posizionare i tubi della centrifuga in un rack e metterli in un incubatore a 37 °C. Una volta completata la fermentazione, utilizzare un sensore di etanolo per misurare la concentrazione di etanolo nelle provette di controllo e campione.

Per rendere i biocarburanti una fonte di energia competitiva, è necessario rispondere ad alcune domande sulla struttura e le prestazioni delle materie prime.

È importante comprendere la distribuzione della lignina in varie piante, in modo che la sua rimozione possa essere eseguita in modo efficiente. In questo esempio, la distribuzione della lignina nelle pareti cellulari delle piante è stata analizzata affettando strati sottili da uno stelo vegetale. Le fette sottili sono state poi riprese utilizzando la microscopia confocale con luce laser a 532 nm per creare immagini tridimensionali del fusto della pianta.

Il contenuto di lignina è stato determinato utilizzando la spettroscopia Raman. Combinando le immagini confocali e gli spettri Raman, è stata generata una mappa tridimensionale della distribuzione della lignina.

Al fine di massimizzare la quantità di bioetanolo derivato dalle materie prime vegetali, è necessario confrontare i tipi di materie prime. In questo esempio, l’etanolo è stato prodotto dal cartone e confrontato con lo stover di mais. Il cartone è stato preparato come mostrato in precedenza, dove il cartone macinato è stato sottoposto a pretrattamento, seguito da digestione enzimatica al fine di separare la lignina e l’emicellulosa dal materiale e scomporre la cellulosa in glucosio. Il glucosio estratto è stato poi fermentato con lievito per produrre etanolo. Il cartone si è rivelato una materia prima superiore allo stover di mais, in quanto ha prodotto più del doppio della concentrazione di etanolo in soluzione.

Negli Stati Uniti, la stragrande maggioranza del bioetanolo è prodotta dal mais. Mentre la produzione di etanolo dal mais è ad alta intensità energetica, è meno complessa della produzione di etanolo dalla biomassa cellulosica.

Per allontanarsi dalle materie prime di mais, la resa della biomassa cellulosica deve essere migliore di quella del mais. In questo esempio, la farina di mais e lo stover di mais sono stati confrontati utilizzando la stessa procedura mostrata in precedenza.

La farina di mais ha prodotto una maggiore concentrazione di etanolo rispetto allo stover di mais, dimostrando che il mais è una materia prima leggermente migliore rispetto ai gambi di mais stessi. Tuttavia, i gambi di mais e altre materie prime cellulosiche sono più abbondanti e poco costosi e possono fornire una valida alternativa.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE ai biocarburanti. Ora dovresti capire la produzione di etanolo dalle materie prime vegetali e le sfide associate al processo. Grazie per l’attenzione!

Results

La % di etanolo nella soluzione verrà visualizzata sullo schermo del tablet portatile utilizzando il software relativo alla marca del sensore di etanolo utilizzato (Figura 2).

I risultati rappresentativi della percentuale di etanolo prodotta da varie materie prime possono essere visti nella Tabella 1.

Feedstock	Etanolo prodotto
Segatura	0.70%
Gambi di mais	0.60%
Cartone	1.67%
Switchgrass ·	0.37%
Controllo	0.11%

Tabella 1. Risultati rappresentativi della percentuale di etanolo prodotta da varie materie prime.

Applications and Summary

L’Energy Independence and Security Act del 2007 ha stabilito in legge uno standard sui combustibili rinnovabili. Ha creato un phase-in per i volumi di carburante rinnovabile a partire da 9 miliardi di galloni nel 2008 e terminando a 36 miliardi di galloni nel 2022. Di quei 36 miliardi, ci si aspettava che 16 miliardi di questi sarebbero venuti da materiali cellulosici. Per il 2014, la proposta originale era di 18,15 miliardi di galloni di combustibile rinnovabile, 1,75 miliardi di quelli provenienti da materiale cellulosico. Sfortunatamente, sulla base del volume di etanolo cellulosico che è possibile produrre attualmente, questo numero ha dovuto essere ridotto a 17 milioni di galloni secondo una recente proposta dell’EPA. ¹ Migliorare il processo di creazione di etanolo da materiale cellulosico è attualmente un’area di ricerca molto calda. In questo esperimento, gli studenti emuleranno le pratiche scientifiche che gli scienziati nei migliori laboratori di ricerca stanno seguendo.

Una varietà di materie prime da biomassa può essere utilizzata per produrre etanolo cellulosico per il trasporto. L’ufficio per le tecnologie bioenergetiche del Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti è focalizzato sullo sviluppo di materie prime cellulosiche da materiale vegetale non alimentare e sulle tecnologie correlate che consentiranno una conversione economicamente fattibile di questa biomassa in carburante per il trasporto. Stanno studiando fonti di biomassa che vanno dai residui agricoli, alle colture energetiche erbacee e ai materiali forestali ai materiali di scarto e alle alghe. In questa attività di laboratorio, gli studenti possono variare la materia prima che usano e confrontare la quantità di etanolo che risulta. Le possibilità includono stover di mais, erbe, foglie, cartone, giornale, carta, fiori, ecc.

Un ostacolo alla produzione su larga scala di etanolo cellulosico è la natura costosa (sia in termini di denaro che di energia) del processo di pretrattamento. Molte ricerche sono in corso per ridurre questi costi e rendere più facile la scomposizione del materiale cellulosico. Le aziende enzimatiche stanno spendendo molto tempo e denaro per sviluppare nuovi enzimi per aumentare la resa di etanolo. In questa attività di laboratorio, gli studenti possono variare gli enzimi che usano e confrontare la quantità di etanolo che risulta. Una varietà di enzimi cellulasi può essere acquistata da aziende chimiche che vendono alle scuole, come la cellulasi di Aspergillus niger o la cellulasi di Trichoderma virde. Oppure gli enzimi proprietari possono essere acquistati da aziende specializzate in enzimi, tuttavia questi sono costosi. Altri enzimi possono essere utilizzati, come l’amilasi, per confrontare la loro capacità di produrre etanolo da materiale cellulosico a quella delle cellulasi.

Un’altra area emergente di ricerca è il miglioramento della capacità del lievito di convertire la biomassa cellulosica in etanolo. La lignocellulosa si è evoluta nelle piante per fornire stabilità. Ciò è dovuto alla reticolazione tra cellulosa ed emicellulosa e ai legami estere nella lignina. È necessario separare la cellulosa dalla lignina e quindi trattare la cellulosa per scomporla in un monosaccaride. Inoltre, l’emicellulosa ha un’alta percentuale di pentosi come lo xilosio, che è più difficile da fermentare di un esosio come il glucosio. ⁴

References

The Energy Independence and Security Act of 2007. United States Congress, Washington DC. January 4, (2007).
Balat, M., Balat, H., Oz, C. Progress in bioethanol processing. Progress in Energy and Combustion Science. 34 (2008).
Ragauskas, A.J., Williams, C.K., Davison, B.H., Britovsek, G., Cairney, J., Eckert, C.A., Frederick Jr, W.J., Hallett, J.P., Leak, D.J., Liotta, C.L., Mielenz, J.R., Murphy, R., Templer, R., Tschaplinski, T. The Path Forward for Biofuels and Biomaterials. Science. 311 484 (2006).
Demirbas, A. Bioethanol from Cellulosic Materials: A Renewable Motor Fuel from Biomass. Energy Source. 27 327-337 (2005).

Transcript

Biofuels are fuels that are derived from biological matter, such as plants. Biofuels serve as an alternative to fossil fuels, as they can be sourced from crops in many parts of the world. Additionally, they are cleaner burning, thereby reducing greenhouse gas emissions.

One of the most widely used biofuels is ethanol derived from plant biomass, typically sugar cane and corn. In the US, the majority of ethanol biofuel is produced from corn.

The use of corn crops as a feedstock is controversial, as corn is energy intensive to grow, uses a large quantity of fertilizers, and its use as a feedstock removes a large quantity of corn from the food supply, especially feed for livestock. As a result, the use of other plant materials, or lignocellulosic materials, such as grass, leaves, paper, and non-edible parts of crops is increasing.

This video will cover the basics of deriving ethanol from lignocellulosic material, and demonstrate the production of ethanol from lignocellulosic feedstocks in the laboratory.

Lignocellulosic biomass refers to plant matter with woody cell walls. This type of plant matter is one of the most abundant raw materials available, as it is frequently a waste product of agriculture and manufacturing.

The cell walls are composed of the highly crosslinked polymer, lignin, and two complex carbohydrates, hemicellulose, and cellulose. Cellulose is the primary source of fermentable sugars, such as glucose, but it must be first separated from the lignin and hemicellulose components.

The first step in processing of the lignocellulosic material is to finely grind the dry plant matter into a powder. The ground feedstock then undergoes pretreatment to break down the lignin and hemicellulose barrier in the cell wall, and enable access to the cellulose.

Next, the cellulose is treated with hydrolytic enzymes, such as cellulase and hemicellulase. The enzymatic hydrolysis breaks down cellulose into glucose. Finally, the glucose is fermented with yeast to produce ethanol.

The following experiment demonstrates this step-wise method of producing ethanol from cellulosic biomass through the removal of lignin and hemicellulose, followed by the enzymatic treatment of cellulose, and the fermentation of glucose to produce ethanol.

In this experiment, ethanol will be produced from corn stover, the leaves and stalks from corn plants. Using a ball mill grinder, grind the feedstock into a fine powder, and ensure that no large pieces remain.

Weigh 1 g of feedstock, place it into a 50-mL centrifuge tube, and label it. Label a second tube as the control sample, and do not add any feedstock. To pretreat the samples, set up a 500-mL beaker with approximately 400 mL of water, and bring it to a gentle boil.

Add 25 mL of distilled water to the two prepared centrifuge tubes and cap them loosely. Swirl the tubes to mix. Place the tubes in the boiling water, and ensure that the water from the bath does not leak into the tubes. Allow them to boil for 30 min, then remove and let them cool to room temperature.

Once the tubes have cooled, add 1 mL of cellulase enzyme to both tubes. Place the tubes in an incubator for 24 h. After 24 h, remove the tubes and allow them to cool to room temperature. Ethanol is produced from the digested cellulosic material through fermentation by yeast. To begin this process, add 1 g of active yeast to each of the centrifuge tubes, and swirl to mix.

Place an airlock on the centrifuge tubes. The airlock allows the carbon dioxide that is generated during the fermentation to escape so pressure does not build up in the tube. Place the centrifuge tubes in a rack, and place in an incubator at 37 °C. Once fermentation is complete, use an ethanol sensor to measure the ethanol concentration in the control and sample tubes.

To make biofuels a competitive energy source, certain questions about the structure and performance of the feedstocks must be answered.

It is important to understand the distribution of lignin in various plants, so its removal can be performed efficiently. In this example, the lignin distribution in plant cell walls was analyzed by slicing thin layers from a plant stem. The thin slices were then imaged using confocal microscopy with 532 nm laser light to create three-dimensional images of the plant stem.

Lignin content was determined using Raman spectroscopy. By combining the confocal images and the Raman spectra, a three-dimensional map of lignin distribution was generated.

In order to maximize the amount of bioethanol derived from plant feedstocks, the types of feedstocks must be compared. In this example, ethanol was produced from cardboard, and compared to corn stover.The cardboard was prepared as shown previously, where the ground cardboard was subjected to pretreatment, followed by enzymatic digestion in order to separate lignin and hemicellulose from the material and break down the cellulose to glucose. The extracted glucose was then fermented with yeast to produce ethanol. Cardboard proved to be a superior feedstock to corn stover, as it produced more than double the concentration of ethanol in solution.

In the United States, the vast majority of bioethanol is produced from corn. While the production of ethanol from corn is energy intensive, it is less complex than the production of ethanol from cellulosic biomass.

In order to transition away from corn feedstocks, the yield from cellulosic biomass must be better than that of corn. In this example, cornmeal and corn stover were compared using the same procedure as shown previously.

Cornmeal produced a higher concentration of ethanol than corn stover, showing that corn is a slightly better feedstock than the corn stalks themselves. However, corn stalks and other cellulosic feedstocks, are more plentiful and inexpensive and may provide a viable alternative.

You’ve just watched JoVE’s Introduction to Biofuels. You should now understand the production of ethanol from plant feedstocks, and the challenges associated with the process. Thanks for watching!

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