Test per alimenti geneticamente modificati

1. Estrazione del DNA da campioni di cibo

1. Aggiungere 500 μL di matrice di miscelazione PCR acquistata a ciascuno dei 2 tubi a vite utilizzando un pipetto di trasferimento o una micropipetta a volume regolabile da 200-1.000 μL. Pipettare su e giù con il pipetto tra ogni aliquota per mescolare uniformemente la matrice PCR.
2. Etichettare un tubo con tappo a vite "non-OGM" e l'altro "test".
3. Pesare 0,5 g di cibo certificato non OGM e metterlo nella malta.
4. Aggiungere 2,5 ml di acqua distillata e macinare con pestello per 2 minuti per formare un impasto.
5. Aggiungere altri 2,5 ml di acqua distillata e continuare a macinare con pestello fino a quando il liquame diventa abbastanza liscio da pipettare.
6. Pipetta 50 μL di liquame macinato al tubo a vite contenente 500 μL di premiscela PCR etichettato "non OGM" utilizzando il marchio 50 μL su un pipetto graduato. Tubo di riepilogo.
7. Ripetere i passaggi 1.3–1.6 per preparare il campione alimentare di prova.
8. Pipettare 50 μL di liquame alimentare di prova a terra al tubo a vite etichettato "test". Tubo di riepilogo.
9. Vortice il cibo non OGM e testare i tubi PCR degli alimenti per 1 minuto e posizionare i tubi a bagnomaria a 95 ° C per 5 minuti. Se non è disponibile alcun vortice, scorrere il tubo più volte per mescolare prima di metterlo a bagnomaria.
10. Mettere i tubi in una centrifuga per 5 minuti. Un pellet solido dovrebbe formarsi sul fondo del tubo. Se il pellet non si forma dopo 5 minuti, centrifugare di nuovo per intervalli di 2 minuti fino alla formazione del pellet.
11. I tubi possono essere utilizzati immediatamente per la PCR o conservati in frigorifero per un massimo di 1 settimana.

2. Impostazione delle reazioni PCR

1. Numero di tubi PCR 1-6 e iniziali. I numeri devono corrispondere al seguente contenuto del tubo elencato nella tabella 1.
2. Posizionare ogni tubo PCR etichettato in un supporto per microtubi con i tappi aperti.
3. Utilizzando una nuova punta per ogni aggiunta, aggiungere 20 μL del primer indicato nella Tabella 1 a ciascun tubo PCR. Tubi del cappuccio.
4. Utilizzando una punta fresca per ogni tubo, aggiungere 20 μL del campione di DNA indicato nella Tabella 1 a ciascun tubo PCR, assicurandosi di pipettare solo dal surnatante ed evitando il pellet solido sul fondo dei tubi.
5. Dopo che ogni campione di DNA è stato pipettato nel tubo PCR corrispondente, utilizzare la pipetta per mescolare DNA e primer pipettando delicatamente su e giù; tubi di riepilogo.
6. Posizionare i tubi PCR nel termocicclatore e programmare il cycler per:
   Denaturazione iniziale: 1 ciclo a 94 °C per 2 min.
   Amplificazione: 40 cicli a 94 °C per 1 min (denaturazione), 59 °C per 1 min (ricottura) e 72 °C per 2 min (estensione).
   Estensione finale: 1 ciclo a 72 °C per 10 min.
   Tenere: 4 °C a tempo indeterminato.

3. 3% di preparazione del gel di acarosio

1. Usando nastro da laboratorio o da mascheratura, togliere saldamente il nastro dalle estremità aperte del vassoio del gel. Assicurarsi che il nastro sia sigillato ai bordi del vassoio per evitare che l'agarose fuso fuoriesca.
2. Pesare 3 g di agarose in un matraccio Erlenmeyer da 250 ml o superiore.
3. Aggiungere 100 ml di 1x tampone TAE (acquistato o preparato dal concentrato).
4. Utilizzando una piastra calda magnetica con una barra di agitazione, riscaldare il becher fino a quando l'agarose è completamente sciolto nel tampone e la soluzione bolle e diventa limpida. In alternativa, un forno a microonde può essere utilizzato mettendo il becher nel forno e riscaldando per intervalli di 30 s, usando un'asta di agitazione per mescolare ogni 10 s, ripetendo fino a quando la miscela è bollente e diventa chiara.
5. Invertire un matraccio Erlenmeyer da 50 mL nell'apertura del matraccio da 250 mL per agire come reflusso, impedendo l'evaporazione della soluzione di agarose.
6. Lasciare raffreddare la soluzione di agarose a 60 °C e versare 30-50 ml in ogni vassoio di gel nastrato.
7. Metti un pettine di gel nel primo paio di tacche per creare pozzette di gel.
8. Lasciare raffreddare completamente il gel prima di rimuovere il nastro e pettinare. Il gel si solidificherà e si trasformerà da limpido a torbido quando sarà pronto, circa 10-20 minuti.

4. Elettroforesi dei prodotti PCR

1. Posizionare un gel di acarosio al 3% precondito su un vassoio di gel o utilizzare un vassoio di gel che è stato utilizzato per lanciare un gel di agarose al 3% versato.
2. Far scorrere il vassoio in gel nella camera di elettroforesi con i pozzeli più vicini all'estremità del catodo (nero).
3. Versare 1x tampone TAE nella camera, sufficiente per avere 2 mm di tampone sopra la parte superiore del vassoio del gel.
4. Ottenere tubi PCR dal termociclatore e posizionarli nel supporto per microtubi.
5. Utilizzando ogni volta una punta di pipetta fresca, aggiungere 10 μL di colorante di caricamento Orange G (LD) acquistato a ciascun campione e mescolare bene.
6. Caricare 20 μl del righello del peso molecolare e 20 μL di ciascun campione nel gel nell'ordine indicato (Tabella 2).
7. Eseguire l'elettroforesi su gel per 30 minuti a 100 V.
8. Rimuovere il vassoio di gel dalla camera e far scorrere il gel per rimuovere dal vassoio. Mettere il gel in un vassoio di colorazione.
9. Immergere il gel nella macchia di gel DNA acquistata per 5 minuti, scuotendo accuratamente il vassoio per aiutare a distribuire la macchia in tutto il gel.
10. Trasferire il gel in un contenitore di lavaggio e risciacquare con acqua di rubinetto (40-55 °C) per circa 10 s.
11. Destain lavando 3 volte in acqua calda del rubinetto per 6 minuti ciascuno con un leggero scuotimento per ottenere i migliori risultati. Se necessario, continuare a destaining in acqua tiepida fino a raggiungere il contrasto desiderato.

Numero del tubo	Abbecedario	Campione di DNA
1	20 μL Primer vegetale (verde)	20 μL DNA per il controllo degli alimenti non OGM
2	20 μL primer OGM (rosso)	20 μL DNA per il controllo degli alimenti non OGM
3	20 μL Primer vegetale (verde)	20 μL Dna alimentare di prova
4	20 μL primer OGM (rosso)	20 μL Dna alimentare di prova
5	20 μL Primer vegetale (verde)	20 μL DNA di controllo OGM positivo
6	20 μL primer OGM (rosso)	20 μL DNA di controllo OGM positivo

Tabella 1. Elenco dei numeri di tubo appropriati, primer e campioni di DNA.

Pozzo 1	Campione 1 Controllo degli alimenti non OGM con primer vegetali da 20 μL.
Pozzo 2	Campione 2 Controllo degli alimenti non OGM con primer OGM 20 μL.
Pozzo 3	Campione 3 Alimento di prova con primer vegetali 20 μL.
Pozzo 4	Campione 4 Alimento di prova con primer OGM 20 μL.
Pozzo 5	Campione 5 DNA OGM positivo con primer vegetali 20 μL.
Pozzo 6	Campione 6 DNA OGM positivo con primer OGM 20 μL.
Pozzo 7	Righello peso molecolare PCR 20 μL.
Pozzo 8	Lasciare vuoto.

Tabella 2. L'ordine appropriato per caricare 20 μL del righello del peso molecolare e 20 μL di ciascun campione nel gel.