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Test per alimenti geneticamente modificati

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Testing For Genetically Modified Foods

1.3: Using GIS to Investigate Urban Forestry

1.15: Analysis of Earthworm Populations in Soil

89,436 Views

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12:45 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratori di Margaret Workman e Kimberly Frye – Depaul University

La modificazione genetica degli alimenti è stata una questione controversa a causa delle preoccupazioni dibattuto sulla salute e la sicurezza ambientale. Questo esperimento dimostra la comprensione tecnica di come il DNA alimentare viene identificato geneticamente, consentendo un processo decisionale istruito sulla sicurezza e sui potenziali pericoli dell’uso di organismi geneticamente modificati (OGM) nelle forniture alimentari.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) viene utilizzata per amplificare il DNA alimentare per testare la presenza di DNA geneticamente modificato nei prodotti alimentari. La presenza di specifiche bande di DNA viene rilevata utilizzando l’elettroforesi su gel per estrarre il DNA alimentare estratto attraverso un gel di agarose al 3%, una concentrazione abbastanza densa da separare le bande di DNA contenenti il DNA geneticamente modificato. Diversi controlli sono utilizzati nella procedura di elettroforesi per garantire che il DNA venga estratto con successo dagli alimenti di prova (primer vegetale) e per fornire esempi noti di DNA geneticamente modificato (DNA geneticamente modificato acquistato) e DNA non geneticamente modificato (controllo alimentare non OGM certificato acquistato).

Principles

La reazione a catena della polimerasi (PCR) identifica sequenze di DNA che sono state inserite nella pianta GM. A differenza delle proteine, il DNA è una molecola relativamente stabile, quindi i frammenti di DNA possono essere isolati da beni altamente trasformati e sono sufficientemente intatti per essere amplificati dalla PCR. Gli ingegneri genetici usano solo un piccolo numero di sequenze regolatorie (sequenze promotore e terminatore) per controllare l’espressione dei geni inseriti, e quindi queste sequenze sono comuni alla maggior parte delle colture GM. Le due sequenze identificate in questa procedura sono due delle sequenze regolatorie più comuni, il gene promotore 35S dal virus del mosaico del cavolfiore (CaMV) e il gene terminatore della nopalina sintasi (NOS) da Agrobacterium tumefaciens.

La PCR comporta cicli ripetitivi, ciascuno costituito da denaturazione del modello, ricottura del primer ed estensione del primer ricotto da Taq DNA polimerasi. Una volta estratto il DNA dal cibo, un termociclatore viene utilizzato per manipolare rapidamente la temperatura, causando le fasi dei cicli PCR.

La fase di denaturazione si verifica quando i campioni vengono rapidamente riscaldati a 94 °C, causando la separazione dei filamenti di DNA. Il raffreddamento rapido a 59 °C consente ai primer di ricottura ai filamenti di DNA separati, quindi di riscaldarsi a 72 °C per la DNA polimerasi Taq per estendere i primer, facendo copie complete di ciascun filamento di DNA e completando un ciclo termico.

Il DNA amplificato può quindi essere fatto passare attraverso un gel di agarose con elettroforesi per separare il DNA in bande visibili per l’identificazione del gene promotore 35S e del terminatore NOS. Il DNA amplificato viene caricato in pozzeggi a un’estremità del gel, utilizzando un colorante di carico acquistato che aiuta ad appesantire il campione per prevenire la dissoluzione nel tampone circostante. Il colorante di carico fornisce anche una visuale, quindi il movimento del DNA può essere visto durante l’elettroforesi nel colorante “anteriore”. Il processo di elettroforesi funziona utilizzando una corrente elettrica separata in estremità catodiche e anodiche. Il DNA viene caricato nel gel all’estremità più vicina al lato catodico della camera e la carica negativa del DNA viene attratta dall’estremità anodica della camera e viene tirata attraverso l’agarose. Le sequenze più grandi di DNA (aumento del numero di coppie di basi) non possono muoversi così facilmente attraverso l’agarose e si separeranno presto, mentre le sequenze più piccole sono in grado di viaggiare più in basso nel gel verso l’estremità dell’anodo.

Un processo di colorazione aiuta legandosi al DNA al fine di aggiungere contrasto tra il gel di fondo e le banche di DNA per una migliore visualizzazione dei risultati. Utilizzando le posizioni note fornite per le diverse dimensioni delle sequenze di DNA, ogni gel di prova può essere analizzato per la presenza o l’assenza dei geni del promotore 35S e del terminatore NOS.

I controlli vengono utilizzati per garantire che il DNA sia estratto correttamente e per fornire un confronto con i campioni di alimenti in esame. Il primer vegetale acquistato viene aggiunto a ciascun campione per fornire acidi nucleici comuni a tutte le piante. Ciò consente un controllo di qualità sul processo di estrazione del DNA, perché qualsiasi DNA vegetale estratto dovrebbe essere esteso con questo primer durante la PCR e dovrebbe anche essere visto sul gel dopo che l’elettroforesi è completa. Il primer acquistato per i geni 35S e NOS viene utilizzato come controllo positivo per fornire bande di DNA sul gel per la modificazione genetica. Se il controllo del modello OGM-positivo non si amplifica, c’è un problema con la reazione PCR e non ci si può fidare di un risultato NEGATIVO AGLI OGM dal cibo in esame. Un prodotto alimentare non OGM certificato viene anche acquistato e utilizzato come controllo negativo per mostrare come appare la separazione del DNA quando non è presente materiale geneticamente modificato.

Procedure

1. Estrazione del DNA da campioni di cibo

Aggiungere 500 μL di matrice di miscelazione PCR acquistata a ciascuno dei 2 tubi a vite utilizzando un pipetto di trasferimento o una micropipetta a volume regolabile da 200-1.000 μL. Pipettare su e giù con il pipetto tra ogni aliquota per mescolare uniformemente la matrice PCR.
Etichettare un tubo con tappo a vite “non-OGM” e l’altro “test”.
Pesare 0,5 g di cibo certificato non OGM e metterlo nella malta.
Aggiungere 2,5 ml di acqua distillata e macinare con pestello per 2 minuti per formare un impasto.
Aggiungere altri 2,5 ml di acqua distillata e continuare a macinare con pestello fino a quando il liquame diventa abbastanza liscio da pipettare.
Pipetta 50 μL di liquame macinato al tubo a vite contenente 500 μL di premiscela PCR etichettato “non OGM” utilizzando il marchio 50 μL su un pipetto graduato. Tubo di riepilogo.
Ripetere i passaggi 1.3–1.6 per preparare il campione alimentare di prova.
Pipettare 50 μL di liquame alimentare di prova a terra al tubo a vite etichettato “test”. Tubo di riepilogo.
Vortice il cibo non OGM e testare i tubi PCR degli alimenti per 1 minuto e posizionare i tubi a bagnomaria a 95 ° C per 5 minuti. Se non è disponibile alcun vortice, scorrere il tubo più volte per mescolare prima di metterlo a bagnomaria.
Mettere i tubi in una centrifuga per 5 minuti. Un pellet solido dovrebbe formarsi sul fondo del tubo. Se il pellet non si forma dopo 5 minuti, centrifugare di nuovo per intervalli di 2 minuti fino alla formazione del pellet.
I tubi possono essere utilizzati immediatamente per la PCR o conservati in frigorifero per un massimo di 1 settimana.

2. Impostazione delle reazioni PCR

Numero di tubi PCR 1-6 e iniziali. I numeri devono corrispondere al seguente contenuto del tubo elencato nella tabella 1.
Posizionare ogni tubo PCR etichettato in un supporto per microtubi con i tappi aperti.
Utilizzando una nuova punta per ogni aggiunta, aggiungere 20 μL del primer indicato nella Tabella 1 a ciascun tubo PCR. Tubi del cappuccio.
Utilizzando una punta fresca per ogni tubo, aggiungere 20 μL del campione di DNA indicato nella Tabella 1 a ciascun tubo PCR, assicurandosi di pipettare solo dal surnatante ed evitando il pellet solido sul fondo dei tubi.
Dopo che ogni campione di DNA è stato pipettato nel tubo PCR corrispondente, utilizzare la pipetta per mescolare DNA e primer pipettando delicatamente su e giù; tubi di riepilogo.
Posizionare i tubi PCR nel termocicclatore e programmare il cycler per:
Denaturazione iniziale: 1 ciclo a 94 °C per 2 min.
Amplificazione: 40 cicli a 94 °C per 1 min (denaturazione), 59 °C per 1 min (ricottura) e 72 °C per 2 min (estensione).
Estensione finale: 1 ciclo a 72 °C per 10 min.
Tenere: 4 °C a tempo indeterminato.

3. 3% di preparazione del gel di acarosio

Usando nastro da laboratorio o da mascheratura, togliere saldamente il nastro dalle estremità aperte del vassoio del gel. Assicurarsi che il nastro sia sigillato ai bordi del vassoio per evitare che l’agarose fuso fuoriesca.
Pesare 3 g di agarose in un matraccio Erlenmeyer da 250 ml o superiore.
Aggiungere 100 ml di 1x tampone TAE (acquistato o preparato dal concentrato).
Utilizzando una piastra calda magnetica con una barra di agitazione, riscaldare il becher fino a quando l’agarose è completamente sciolto nel tampone e la soluzione bolle e diventa limpida. In alternativa, un forno a microonde può essere utilizzato mettendo il becher nel forno e riscaldando per intervalli di 30 s, usando un’asta di agitazione per mescolare ogni 10 s, ripetendo fino a quando la miscela è bollente e diventa chiara.
Invertire un matraccio Erlenmeyer da 50 mL nell’apertura del matraccio da 250 mL per agire come reflusso, impedendo l’evaporazione della soluzione di agarose.
Lasciare raffreddare la soluzione di agarose a 60 °C e versare 30-50 ml in ogni vassoio di gel nastrato.
Metti un pettine di gel nel primo paio di tacche per creare pozzette di gel.
Lasciare raffreddare completamente il gel prima di rimuovere il nastro e pettinare. Il gel si solidificherà e si trasformerà da limpido a torbido quando sarà pronto, circa 10-20 minuti.

4. Elettroforesi dei prodotti PCR

Posizionare un gel di acarosio al 3% precondito su un vassoio di gel o utilizzare un vassoio di gel che è stato utilizzato per lanciare un gel di agarose al 3% versato.
Far scorrere il vassoio in gel nella camera di elettroforesi con i pozzeli più vicini all’estremità del catodo (nero).
Versare 1x tampone TAE nella camera, sufficiente per avere 2 mm di tampone sopra la parte superiore del vassoio del gel.
Ottenere tubi PCR dal termociclatore e posizionarli nel supporto per microtubi.
Utilizzando ogni volta una punta di pipetta fresca, aggiungere 10 μL di colorante di caricamento Orange G (LD) acquistato a ciascun campione e mescolare bene.
Caricare 20 μl del righello del peso molecolare e 20 μL di ciascun campione nel gel nell’ordine indicato (Tabella 2).
Eseguire l’elettroforesi su gel per 30 minuti a 100 V.
Rimuovere il vassoio di gel dalla camera e far scorrere il gel per rimuovere dal vassoio. Mettere il gel in un vassoio di colorazione.
Immergere il gel nella macchia di gel DNA acquistata per 5 minuti, scuotendo accuratamente il vassoio per aiutare a distribuire la macchia in tutto il gel.
Trasferire il gel in un contenitore di lavaggio e risciacquare con acqua di rubinetto (40-55 °C) per circa 10 s.
Destain lavando 3 volte in acqua calda del rubinetto per 6 minuti ciascuno con un leggero scuotimento per ottenere i migliori risultati. Se necessario, continuare a destaining in acqua tiepida fino a raggiungere il contrasto desiderato.

Numero del tubo	Abbecedario	Campione di DNA
1	20 μL Primer vegetale (verde)	20 μL DNA per il controllo degli alimenti non OGM
2	20 μL primer OGM (rosso)	20 μL DNA per il controllo degli alimenti non OGM
3	20 μL Primer vegetale (verde)	20 μL Dna alimentare di prova
4	20 μL primer OGM (rosso)	20 μL Dna alimentare di prova
5	20 μL Primer vegetale (verde)	20 μL DNA di controllo OGM positivo
6	20 μL primer OGM (rosso)	20 μL DNA di controllo OGM positivo

Tabella 1. Elenco dei numeri di tubo appropriati, primer e campioni di DNA.

Pozzo 1	Campione 1 Controllo degli alimenti non OGM con primer vegetali da 20 μL.
Pozzo 2	Campione 2 Controllo degli alimenti non OGM con primer OGM 20 μL.
Pozzo 3	Campione 3 Alimento di prova con primer vegetali 20 μL.
Pozzo 4	Campione 4 Alimento di prova con primer OGM 20 μL.
Pozzo 5	Campione 5 DNA OGM positivo con primer vegetali 20 μL.
Pozzo 6	Campione 6 DNA OGM positivo con primer OGM 20 μL.
Pozzo 7	Righello peso molecolare PCR 20 μL.
Pozzo 8	Lasciare vuoto.

Tabella 2. L’ordine appropriato per caricare 20 μL del righello del peso molecolare e 20 μL di ciascun campione nel gel.

Gli alimenti geneticamente modificati sono prodotti che contengono uno o più ingredienti il cui DNA è stato specificamente alterato. La presenza di queste modifiche può essere rilevata utilizzando una tecnica chiamata reazione a catena della polimerasi.

La modificazione genetica degli alimenti è stata una questione controversa a causa delle preoccupazioni dibattuto sulla salute e la sicurezza ambientale. La capacità di rilevare dna geneticamente modificato in campioni alimentari di interesse consente un processo decisionale istruito sulla sicurezza e sui potenziali pericoli dell’uso di organismi geneticamente modificati, o OGM, nelle forniture alimentari.

La reazione a catena della polimerasi, o PCR, viene utilizzata per amplificare il DNA alimentare per determinare la presenza o l’assenza di sequenze geneticamente modificate. L’elettroforesi su gel quindi tira il DNA amplificato attraverso una matrice di gel di acarosio e separa bande di DNA di diverse dimensioni che corrispondono a marcatori modificati o non modificati. Questi vengono quindi confrontati con le bande di controllo di alimenti noti per contenere OGM o noti per essere privi di modifiche.

Questo video illustrerà i principi alla base del rilevamento del DNA geneticamente modificato da campioni di cibo, come estrarre il DNA e amplificare i marcatori utilizzati nel processo di modificazione genetica e come stabilire la presenza o l’assenza di OGM nei campioni di cibo.

La reazione a catena della polimerasi identifica sequenze di DNA che sono state inserite nell’alimento geneticamente modificato. Il DNA è una molecola relativamente stabile, quindi frammenti di DNA vitali adatti all’amplificazione possono essere isolati anche da prodotti altamente trasformati, come patatine di mais o hamburger vegetali.
Un piccolo numero di sequenze di DNA regolatorie vengono utilizzate per controllare l’espressione dei geni inseriti, quindi queste sequenze sono presenti nella maggior parte delle colture GM. Questa procedura identifica due dei più comunemente usati, il gene promotore 35S e il gene terminatore della nopalina sintasi. La sequenza 35S è un forte promotore e, se attaccata a un gene inserito, guiderà livelli di espressione costanti e alti. Il terminatore della nopalina sintasi è incluso per interrompere la trascrizione del gene inserito all’endpoint desiderato.

La PCR comporta cicli ripetitivi di riscaldamento e raffreddamento in un termociclatore, una macchina che controlla strettamente la temperatura dei tubi di reazione PCR. Il riscaldamento del campione a 94 °C fa sì che i filamenti di DNA si denaturano e si separtino. Il raffreddamento rapido tra 45 e 65 °C consente ai primer di ricottura ai filamenti di DNA separati. Infine, il riscedamento a 72 °C consente all’enzima Taq polimerasi di estendere i primer e completare la duplicazione della regione target.

Il primer vegetale acquistato viene aggiunto a ciascun campione e si amplifica in campioni contenenti DNA vegetale. I modelli positivi agli OGM per 35S e NOS sono utilizzati per fornire un controllo positivo per gli OGM. Un non-OGM certificato viene utilizzato come controllo negativo. Se una di queste reazioni di controllo mostra bande inaspettate, non ci si può fidare dei risultati dei campioni di prova.

Il DNA amplificato viene fatto passare attraverso un gel di acarosio mediante elettroforesi. I prodotti PCR vengono miscelati con un colorante e caricati in pozzerati. Il DNA è caricato negativamente e, quando caricato nel gel all’estremità catodica della camera, si muoverà verso l’estremità dell’anodo quando viene applicata la corrente. I frammenti di DNA più grandi non possono muoversi così facilmente attraverso la matrice del gel, quindi rimarranno più vicini al catodo, mentre le sequenze più piccole si muovono verso l’estremità dell’anodo, con conseguente separazione del DNA di dimensioni diverse in bande distinte.

Dopo l’elettroforesi, la colorazione del gel aiuta a visualizzare le bande di DNA separate.

Ora che abbiamo familiarità con i principi alla base del rilevamento degli OGM e dell’uso della PCR e dell’elettroforesi per l’identificazione degli OGM, diamo un’occhiata a come questo può essere effettuato in laboratorio.

Una volta identificati i prodotti alimentari di interesse, l’analisi può iniziare. Per estrarre il DNA, prendere due tubi a vite puliti e in ciascuno di questi trasferire 500 μL di reagente di isolamento del DNA acquistato, assicurandosi di pipettare la miscela su e giù tra le aliquote per mescolare uniformemente il reagente. Etichettare uno dei tubi “non OGM” e l’altro “Test”.

Quindi, pesare 0,5 g di cibo certificato non OGM e metterlo in una malta pulita. Aggiungere 2,5 ml di acqua distillata e macinare con il pestello per 2 minuti per formare un impasto. Aggiungere altri 2,5 ml di acqua distillata e continuare a macinare il liquame fino a quando non diventa abbastanza liscio da pipettare.

Pipettare 50 μL del noto liquame non OGM al tubo a vite etichettato “non OGM” contenente il reagente di isolamento del DNA. Ora aggiungi 50 μL del liquame campione alimentare di prova al tubo avvitato contrassegnato “Test”. Vortice le due provette contenenti i campioni di cibo e il reagente DNA per 1 min. Quindi, posizionare i tubi a bagnomaria a 95 ° C per 5 minuti. Infine, posizionare i tubi in una centrifuga per 5 minuti. Dopo l’esame, un pellet solido dovrebbe essere formato sul fondo del tubo. Se un pellet non si forma dopo 5 minuti, centrifugare di nuovo per intervalli di 2 minuti fino a quando non si forma un pellet. I campioni possono ora essere utilizzati immediatamente per la PCR o conservati in frigorifero per un massimo di 1 settimana.

Innanzitutto, il numero sei tubi PCR. Questi numeri corrisponderanno al contenuto del tubo elencato nella tabella. Posizionare ciascuno dei tubi PCR etichettati in un supporto per microtubi con i tappi aperti.

Utilizzando una nuova punta per ogni aggiunta, aggiungere 20 μL di primer indicato nella tabella a ciascun tubo PCR. Quindi, aggiungere 20 μL dei campioni di DNA indicati nella tabella a ciascun tubo PCR. Pipetta su e giù per mescolare. Per i campioni pellettizzato, assicurarsi di pipettare solo dal surnatante ed evitare il pellet solido sul fondo dei tubi. Infine, posizionare i tubi PCR in un termociclo e programmarlo per passare attraverso le fasi di riscaldamento e raffreddamento indicate nella tabella.

Posizionare un gel di agarose al 3% nella camera di elettroforesi con i pozzeli più vicini all’estremità del catodo. Aggiungere il tampone TAE nella camera per coprire 2 mm sopra il vassoio del gel. Raccogliere i tubi PCR dal termociclatore e posizionarli in un supporto per microtubi. Usando ogni volta una punta di pipetta fresca, aggiungere 10 μL di colorante di caricamento del DNA acquistato a ciascun campione e mescolare bene.

Usando una punta fresca ogni volta, caricare i pozzezzeli del gel di acarosio con 20 μL di righello di peso molecolare in un pozzedo e 20 μL di ciascun campione in pozzezzeri successivi, come indicato in questa tabella. Impostare la camera di elettroforesi in modo che funzioni a 100 V per 30 minuti.

Una volta che il gel ha finito di funzionare, scollegare con cura la camera del gel, rimuovere il vassoio e far scorrere il gel in un vassoio di colorazione. Immergere il gel nella macchia di gel 100x acquistata per 5 minuti agitando delicatamente il vassoio per distribuire la macchia. Una volta macchiato, trasferire il gel in un contenitore di lavaggio e risciacquare con acqua di rubinetto per circa 10 s. Detersivo lavando tre volte in acqua calda del rubinetto per 3 minuti ciascuno, ciascuno con un leggero scuotimento per ottenere i migliori risultati. Se necessario, continuare a destaining in acqua tiepida fino a raggiungere il contrasto desiderato.

La presenza o l’assenza di una banda di 200 bp nella corsia 4 indica se l’alimento in esame contiene OGM. I primer vegetali determinano se il DNA della pianta è stato estratto con successo dal campione. Il controllo degli alimenti non OGM è un indicatore di risultati falsi positivi, se dovessero verificarsi. Se il controllo degli alimenti non OGM risulta positivo, significa che la PCR è stata contaminata ad un certo punto. Il controllo del modello OGM-positivo è un indicatore di falsi negativi. Se il controllo del modello OGM-positivo non si amplifica, c’è un problema con la reazione PCR e non ci si può fidare di un risultato NEGATIVO AGLI OGM dal cibo in esame.

I gel possono essere posizionati su una carta bianca o gialla per fornire uno sfondo contrastante per evidenziare le bande del DNA, oppure è possibile ottenere un maggiore contrasto utilizzando una scatola di luce UV.

La capacità di testare i prodotti alimentari o i prodotti per ingredienti geneticamente modificati è pertinente a una serie di applicazioni scientifiche o normative.

Ci sono alcune prove che il DNA transgenico proveniente da colture geneticamente modificate può introgredire nei genomi delle popolazioni di colture selvatiche. Ad esempio, gli impollinatori possono facilitare questo trasferimento fertilizzando piante selvatiche con polline proveniente da una fonte geneticamente modificata. Questa è una preoccupazione, in quanto gli impatti della diffusione di questi geni inseriti sugli ecosistemi nel loro complesso non sono ben compresi. Il test PCR delle popolazioni selvatiche può fornire dati sulla potenziale diffusione, o sul successo del contenimento, degli inserti genetici.

La mancanza di etichettatura o l’etichettatura errata degli ingredienti geneticamente modificati può essere una preoccupazione per i consumatori. Ciò può essere dovuto alla preferenza del consumatore per il consumo o alla potenziale introduzione di allergeni durante il processo GM, sebbene quest’ultimo sia controverso. In alcuni paesi, gli ingredienti geneticamente modificati devono essere elencati sulle confezioni degli alimenti. I comitati di regolamentazione in tali paesi possono utilizzare i test PCR per verificare l’accuratezza dell’etichettatura degli alimenti.

Laddove la modificazione genetica introdotta in una coltura conferisce resistenza ai pesticidi, alcuni studi hanno sollevato preoccupazioni sulla produzione di “super-inertie”. Essenzialmente, questi possono essere qualsiasi pianta non inizialmente mirata alla modifica che ottiene la resistenza ai pesticidi attraverso meccanismi come l’introgressione o l’ibridazione. Queste piante possono quindi essere in grado di diffondersi con maggiore successo ed essere più difficili da controllare rispetto a quelle senza l’inserto. Il test PCR per la modificazione genetica può aiutare a evidenziare e tracciare tali potenziali popolazioni per determinare se questa diffusione potrebbe rivelarsi problematica.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE ai test per gli alimenti OGM. Ora dovresti capire i principi alla base dell’identificazione di alimenti geneticamente modificati utilizzando la PCR, come estrarre e amplificare il DNA dal cibo e come determinare se il tuo campione di cibo è stato geneticamente modificato. Grazie per l’attenzione!

Results

Dopo la dessazione, i gel possono essere analizzati osservando le corsie alimentari di prova (Tabella 3) per determinare se le bande di DNA per il promotore 35S e i geni terminatore NOS sono presenti nelle posizioni note sul gel. Posizionare il gel su una scatola di luce UV può aiutare a fornire un maggiore contrasto (Figura 1). In alternativa, i gel possono essere posizionati su carta bianca o gialla per fornire uno sfondo contrastante per evidenziare le bande del DNA (Figura 2).

Figura 1. Un gel contaminato che mostra bande separate di DNA. Gel di agarose a seguito di elettroforesi su gel di agarose su scatola di luce UV.

Figura 2. Diagramma delle posizioni note per il promotore 35S e il DNA del terminatore NOS. La presenza o l’assenza di una banda di 200 bp nella corsia 5 indica se l’alimento in esame contiene o meno OGM.

Corsia 1: Alimenti non OGM con primer vegetali	455 bp
Corsia 2: Alimenti non OGM con primer OGM	Nessuna band
Corsia 3: Testare il cibo con primer vegetali	455 bp
Corsia 4: Testare gli alimenti con primer OGM	200 bp o nessuna banda
Corsia 5: Modello OGM-positivo con primer vegetali	455 bp
Corsia 6: Modello OGM-positivo con primer OGM	200 bp
Corsia 7: Righello a peso molecolare PCR	1.000, 700, 500, 200, 100 bp

Tabella 3. Dimensioni della banda del campione PCR (coppie di basi (bp)).

Applications and Summary

La reazione a catena della polimerasi (PCR) viene utilizzata per amplificare il DNA, consentendo una vasta gamma di test di laboratorio del DNA. Un’area di test ora possibile con la PCR è identificare gli OGM testando la presenza o l’assenza delle sequenze di DNA utilizzate nella modificazione genetica delle colture alimentari. Tipicamente, una coltura è geneticamente modificata per conferire un vantaggio contro i deterrenti naturali alle rese ideali, ad esempio parassiti (Figura 3), malattie, condizioni di siccità (Figura 4), ecc. Poiché il vantaggio si ottiene inserendo materiale genetico di una specie diversa nel DNA della pianta vegetale, i potenziali rischi per la salute umana e l’ambiente sono stati identificati con l’uso di OGM. Una preoccupazione ambientale è la capacità del DNA geneticamente modificato di essere scambiato involontariamente attraverso processi di impollinazione, il che potrebbe portare a DNA geneticamente modificato che entra nei genomi di colture destinate ad essere vendute come non OGM.

Figura 3. Larve di coleottero del Colorado, divorando foglie di una patata.

Figura 4. Mais distrutto dalla siccità.

Transcript

Genetically modified foods are products which contain an ingredient or ingredients whose DNA has been specifically altered. Presence of these modifications can be detected using a technique called the polymerase chain reaction.

Genetic modification of foods has been a controversial issue due to debated concerns over health and environmental safety. The ability to detect genetically altered DNA in food samples of interest allows for educated decision-making about the safety and potential dangers of using genetically modified organisms, or GMO’s, in food supplies.

The polymerase chain reaction, or PCR, is used to amplify food DNA to determine the presence or absence of genetically modified sequences. Gel electrophoresis then pulls the amplified DNA through an agarose gel matrix and separates DNA bands of different sizes that correspond to modified or non-modified markers. These are then compared to control bands from foods known to contain GMO’s, or known to be modification free.

This video will illustrate the principles behind detecting genetically modified DNA from food samples, how to extract DNA and amplify markers used in the genetic modification process, and how the presence or absence of GMO’s in food samples can be established.

Polymerase chain reaction identifies sequences of DNA that have been inserted into the genetically modified food. DNA is a relatively stable molecule, so viable DNA fragments suitable for amplification can be isolated even from highly processed goods, like corn chips or vegetable burgers. A small number of regulatory DNA sequences are used to control the expression of inserted genes, so these sequences are present in the majority of GM crops. This procedure identifies two of the most commonly used, the 35S promoter gene and the nopaline synthase terminator gene. The 35S sequence is a strong promoter, and when attached to an inserted gene will drive constant, high levels of expression. The nopaline synthase terminator is included to stop transcription of the inserted gene at the desired endpoint.

PCR involves repetitive heating and cooling cycles in a thermal cycler, a machine that tightly controls the temperature of PCR reaction tubes. Heating the sample to 94 °C causes DNA strands to denature and separate. Rapid cooling to between 45 and 65 °C allows primers to anneal to the separated DNA strands. Finally, reheating to 72 °C allows the Taq polymerase enzyme to extend the primers and complete duplication of the target region.

Purchased plant primer is added to each sample, and will amplify in samples containing plant DNA. GMO positive templates for 35S and NOS are used to provide a positive control for GMOs. A certified non-GMO is used as a negative control. If any of these control reactions show unexpected bands, the results of test samples cannot be trusted.

Amplified DNA is run through an agarose gel by electrophoresis. PCR products are mixed with a dye and loaded into wells. DNA is negatively charged, and when loaded into the gel at the cathode end of the chamber will move toward the anode end when current is applied. Larger DNA fragments cannot move as easily through the gel matrix so will stay closer to the cathode, while smaller sequences move toward the anode end, resulting in separation of differently sized DNA into distinct bands.

After electrophoresis, gel staining helps visualize separated DNA bands.

Now that we are familiar with the principles behind GMO detection and the use of PCR and electrophoresis for GMO identification, let’s take a look at how this can be carried out in the laboratory.

Once the food products of interest have been identified, analysis can begin. To extract the DNA, take two clean screwcap tubes, and into each of these transfer 500 μL of purchased DNA isolation reagent, making sure to pipette the mix up and down between aliquots to evenly mix the reagent. Label one of the tubes “non-GMO”, and the other “Test”.

Next, weigh out 0.5 g of certified non-GMO food, and place into a clean mortar. Add 2.5 mL of distilled water, and grind with the pestle for 2 min to form a slurry. Add another 2.5 mL distilled water and continue grinding the slurry until it becomes smooth enough to pipette.

Pipette 50 μL of the known non-GMO slurry to the “non-GMO” labeled screwcap tube containing the DNA isolation reagent. Now add 50 μL of the test food sample slurry to the screwcap tube marked “Test”. Vortex the two tubes containing the food samples and DNA reagent for 1 min. Next, place the tubes in a water bath at 95 °C for 5 min. Finally, place the tubes in a centrifuge for 5 min. Upon examination, a solid pellet should be formed at the bottom of the tube. If a pellet is not formed after 5 min, centrifuge again for 2-min intervals until a pellet forms. Samples can now be used immediately for PCR, or stored in a refrigerator for up to 1 week.

First, number six PCR tubes. These numbers will correspond to the tube contents listed in the Table. Place each of the labeled PCR tubes in a microtube holder with caps open.

Using a fresh tip for each addition, add 20 μL primer indicated in the Table to each PCR tube. Next, add 20 μL of the DNA samples indicated in the Table to each PCR tube. Pipette up and down to mix. For pelleted samples, be sure to pipette only from the supernatant, and avoid the solid pellet at the bottom of the tubes. Finally, place the PCR tubes into a thermal cycler and program it to cycle through the heating and cooling steps indicated in the table.

Place a 3% agarose gel into the electrophoresis chamber with the wells closest to the cathode end. Add TAE buffer into the chamber to cover 2 mm above the gel tray. Collect the PCR tubes from the thermocycler and place them in a microtube holder. Using a fresh pipette tip each time, add 10 μL of purchased DNA loading dye to each sample and mix well.

Using a fresh tip each time, load the wells of the agarose gel with 20 μL of molecular weight ruler into one well, and 20 μL of each sample into subsequent wells, as indicated in this table. Set the electrophoresis chamber to run at 100 V for 30 min.

Once the gel has finished running, carefully unplug the gel chamber, remove the tray, and slide the gel into a staining tray. Immerse the gel in purchased 100x gel stain for 5 min shaking the tray gently to distribute the stain. Once stained, transfer the gel into a washing container and rinse with tap water for approximately 10 s. Destain by washing three times in warm tap water for 3 min each, each with gentle shaking for best results. If necessary, continue destaining in warm water until the desired contrast is reached.

The presence or absence of a 200 bp band in lane 4 indicates whether the test food contains GMOs. The plant primers determine whether plant DNA was successfully extracted from the sample. The non-GMO food control is an indicator of false positive results, should they occur. If the non-GMO food control comes out as positive, it means the PCR was contaminated at some point. The GMO-positive template control is an indicator of false negatives. If the GMO-positive template control does not amplify, there is a problem with the PCR reaction and a GMO-negative result from the test food can’t be trusted.

Gels can be placed on a white or yellow paper to provide contrasting background to highlight DNA bands, or increased contrast can be achieved using a UV light box.

The ability to test foodstuffs or products for genetically modified ingredients is pertinent to a number of scientific or regulatory applications.

There is some evidence that transgenic DNA from genetically modified crops can become introgressed into the genomes of wild crop populations. For example, pollinators may facilitate this transfer by fertilizing wild-type plants with pollen from a genetically modified source. This is a concern, as the impacts of the spread of these inserted genes on ecosystems as a whole are not well understood. PCR testing of wild populations can provide data on the potential spread, or successful containment, of genetic inserts.

Lack of labeling, or incorrect labeling of genetically modified ingredients can be a consumer concern. This may be due to the consumer’s preference of consumption, or potential introduction of allergens during the GM process, though the latter is controversial. In some countries, genetically modified ingredients are required to be listed on food packaging. Regulatory boards in such countries may use PCR testing to check the accuracy of food labeling.

Where the genetic modification introduced to a crop confers pesticide resistance, some studies have raised concerns about the production of “super-weeds”. Essentially, these can be any plant not initially targeted for modification that obtains the resistance to pesticide through mechanisms such as introgression or hybridization. These plants may then be able to spread more successfully, and be harder to control than those without the insert. PCR testing for genetic modification can help to highlight and track such potential populations to determine if this spread could prove problematic.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Testing for GMO Foods. You should now understand the principles behind identifying genetically modified foods using PCR, how to extract and amplify DNA from food, and how to determine if your food sample has been genetically modified. Thanks for watching!

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