2.9: Quantificazione di microrganismi e virus ambientali mediante qPCR

1. Raccolta dei campioni

1. Raccogli il terreno usando una coclea o una pala a una determinata profondità. Se si raccoglie il terreno dalla rizosfera, raccogliere il terreno solo entro 7 mm intorno alla radice della pianta, colpendo il terreno in eccesso dalla radice e raschiando il terreno desiderato in un barile di raccolta.
2. Mettere un flacone sterile di Nalgene nel bastoncino da immersione. Tenere l'estremità del bastone e raccogliere l'acqua immergendo la bottiglia. Metti la bottiglia in un dispositivo di raffreddamento con ghiaccio.
3. Trasferire i campioni al laboratorio.

2. Estrazione degli acidi nucleici

1. Per isolare i microrganismi dai campioni raccolti e per estrarre DNA e/ o RNA da essi, si prega di vedere il video Di JoVE Science Education sull'estrazione di acidi nucleici della comunità.

3. Trascrizione inversa

1. Se il materiale genetico da dosare è l'RNA, deve essere utilizzato per generare DNA complementare (cDNA) tramite trascrizione inversa prima di procedere alla PCR. Per i dettagli, fare riferimento al video Di JoVE Science Education su RT-PCR.

4. Impostazione di qPCR

1. Recuperare i reagenti conservati a -20 °C e scongelarli sul ghiaccio o a temperatura ambiente all'interno di una cappa pulita. I reagenti utilizzati in questo esempio includono la miscela di reazione qPCR (dipendente dalla macchina qPCR utilizzata; contiene DNA polimerasi), primer avanti e indietro e la sonda TaqMan. Le sequenze di primer e sonda sono progettate con sequenze specifiche per l'organismo che viene enumerato. Fare riferimento alla letteratura corrente per trovare sequenze di interesse. In questo esempio, verrà utilizzato il sistema di reagenti Roche Light Cycler 480 Probes Mix. Il virus della mottle lieve del pepe sarà enumerato nel campione di acqua. ^1,2 Vedere la Tabella 1 per le sequenze di primer e sonda.
2. Scongelamento estratto (c)DNA da campioni e il DNA di controllo positivo (che consiste in sequenze specifiche dell'organismo clonate in plasmidi batterici) a temperatura ambiente.
3. Preparare un modello di tabella a 96 celle simile alla piastra qPCR a 96 pozzetti. Etichettare ogni cella con la reazione che verrà caricata sulla piastra. Includere reazioni per ogni campione e standard in triplice copia, nonché per il controllo positivo e il controllo negativo, come una reazione senza DNA.
4. Calcolare i volumi di reagenti necessari per una reazione "master mix", che include tutti i reagenti che sono costanti tra le reazioni, in base alle istruzioni del produttore e alla letteratura. Preparare un mix master sufficiente per le reazioni triplicate per tutti i campioni più i controlli e un ulteriore 10% per tenere conto dell'errore di pipettaggio. Per una ricetta di master mix di esempio, fare riferimento alla Tabella 2.
5. Lavorando all'interno di una cappa pulita, una volta che tutti i reagenti sono completamente scongelati, aggiungere la quantità calcolata di ciascun reagente in un tubo di microfuga a bassa legatura da 1,5 ml per creare una miscela principale. Vortice e minicentrifugare brevemente ogni reagente prima di aggiungere. Cambiare la punta della pipetta tra ciascun reagente per evitare la contaminazione e garantire concentrazioni corrette. Dopo che tutti i reagenti sono stati aggiunti, vortice e minicentrifuga tubo con la miscela master per garantire l'omogeneità.
6. Aliquotare il volume appropriato della miscela master in ciascun pozzo designato nella piastra PCR a 96 pozzi.
7. Aggiungere il volume appropriato di (c) campione di DNA, plasmide di controllo positivo e controllo negativo (acqua di grado molecolare) in pozzi designati.
8. Una volta aggiunti tutti i campioni e i controlli, sigillare la piastra con la pellicola sigillante. Utilizzare uno strumento di tenuta per spingere l'aria fuori da sotto la lamina e prevenire le bolle. Strappare con cura i bordi della lamina.
9. Centrifugare la piastra sigillata a 96 pozzetti in una centrifuga con un portapiatti per raccogliere la miscela sul fondo di ciascun pozzettino. Assicurarsi di utilizzare una piastra di contrappeso per garantire che la centrifuga sia adeguatamente bilanciata durante la rotazione. Centrifuga a impulsi fino a 1000 giri/min, quindi lascia che la centrifuga si fermi lentamente senza freni.

5. Funzionamento qPCR

1. Posizionare la piastra sigillata a 96 pozzi nella macchina qPCR. Assicurarsi che la macchina indichi che è pronta per l'avvio.
2. Seguire le istruzioni della macchina qPCR per inserire correttamente tutte le informazioni necessarie al software, quindi impostare la macchina qPCR per l'esecuzione.
3. Dopo che la macchina ha completato l'esecuzione, il software sarà in grado di utilizzare le concentrazioni note del controllo positivo per calcolare la quantità di cDNA in ogni reazione. La quantità di virus nel campione originale può quindi essere calcolata, in base ai processi di diluizione, filtrazione, concentrazione, amplificazione e / o estrazione eseguiti per ottenere il campione di DNA.

Tabella 1. Sequenze di primer e sonda per il rilevamento del virus del pepe lieve.

Tabella 2. Volumi di reagenti per reazioni individuali e master mix.

L'avvento della reazione quantitativa della polimerasi a catena, o qPCR, ha reso possibile determinare quantitativamente la quantità di qualsiasi microrganismo in un campione ambientale.

Come la PCR standard, la qPCR identifica i microrganismi rilevando la presenza o l'assenza di sequenze di DNA specifiche per gli organismi di interesse. Ciò consente il rilevamento di microbi che non possono essere coltivati in laboratorio, rendendo possibile il dosaggio di una gamma molto più ampia di organismi ambientali. Inoltre, la qPCR consente di valutare quantitativamente la quantità di DNA. Ma allo stesso tempo, le metodologie PCR rilevano il DNA di tutti gli organismi vivi o morti, limitando la capacità di cercare solo microbi in crescita attiva nel campione.

Questo video esaminerà le innovazioni chimiche che distinguono la qPCR dalla PCR normale, spiegherà come la qPCR può essere utilizzata per misurare quantitativamente il DNA, dimostrerà un protocollo per l'utilizzo della qPCR per rilevare un virus a RNA da campioni di suolo e, infine, mostrerà come la qPCR viene applicata alla microbiologia ambientale oggi.

I principi di base alla base della qPCR sono gli stessi della PCR normale: cicli ripetuti di ricottura del primer al modello, allungamento del prodotto PCR e denaturazione del prodotto dal modello, che portano all'amplificazione esponenziale di una sequenza target di interesse, nota come amplicona, da un pool di materiale di partenza.

L'innovazione della qPCR consiste nell'aggiunta di sostanze chimiche fluorescenti nella reazione, che consente di visualizzare direttamente la sintesi del prodotto PCR ad ogni ciclo in "tempo reale" da termociclatori specializzati, rendendo possibile quantificare la quantità di sequenza modello nel campione originale. La quantità viene solitamente misurata in termini di ciclo di soglia, abbreviato Ct, noto anche come ciclo di quantificazione o Cq, che è il ciclo PCR in cui la quantità di prodotti fluorescenti supera il livello di fondo.

La quantificazione può essere relativa, in cui il valore Ct di una sequenza viene confrontato con quello di un'altra sequenza standard o di controllo; la quantità relativa è uguale a due elevata alla potenza della differenza in Ct. In alternativa, se una serie di DNA di quantità nota viene eseguita accanto ai campioni nella reazione, può essere prodotta una curva standard che confronta il valore di fluorescenza con la quantità di DNA e consente di quantificare il DNA del campione in modo assoluto.

Esistono due tipi generali di molecole fluorescenti utilizzate nella qPCR. In un caso, nella reazione sono inclusi coloranti fluorescenti che si legano specificamente al DNA a doppio filamento. Il colorante diventa fluorescente solo quando è legato al DNA, consentendo così di quantificare la quantità di prodotto di DNA a doppio filamento.

Nell'altro metodo, un breve tratto di DNA, noto come sonda, è progettato contro una specifica sequenza bersaglio di interesse. La sonda è attaccata chimicamente a un colorante fluorescente e a una molecola di "quencher" che sopprime il segnale di fluorescenza dal colorante quando si trova nelle immediate vicinanze. L'enzima polimerasi, che sintetizza il prodotto del DNA, ha un'attività degradante del DNA che provocherebbe il "rilascio" della molecola fluorescente dalla sonda, separando così il colorante dal quencher e permettendo di rilevare il segnale di fluorescenza.

Ora che hai compreso i principi alla base della qPCR, diamo un'occhiata a un protocollo per utilizzare questa tecnica per identificare un virus a RNA che infetta le piante, il virus della chiazza lieve del pepe, da campioni di suolo.

In questa dimostrazione, il campione sarà raccolto dalla rizosfera, la zona di terreno di circa 7 mm attorno alle radici delle piante che è influenzata dalle radici e dai loro microrganismi simbiotici.

Per raccogliere il terreno della rizosfera, prima estrai con cura la pianta di interesse dal terreno e colpiscila per rimuovere quanto più terreno in eccesso possibile. Imballare l'impianto per l'ulteriore lavorazione in laboratorio.

Dopo aver riportato i campioni in laboratorio, utilizzare una spatola sterile per raschiare il terreno desiderato in un recipiente di raccolta. Quindi, raccogli il virus dal terreno ed estrai l'RNA.

Una volta che l'RNA è stato raccolto dal campione, convertirlo in cDNA complementare o cDNA tramite trascrizione inversa. Si prega di fare riferimento al video JoVE SciEd sulla trascrizione inversa-PCR per i dettagli di questa procedura.

Quando si è pronti per eseguire la qPCR, scongelare i reagenti congelati a temperatura ambiente all'interno di una cappa a flusso laminare dedicata e metterli sul ghiaccio una volta scongelati. I componenti reagenti contenenti l'enzima DNA polimerasi devono essere sempre mantenuti in ghiaccio.

Scongelare il cDNA del campione e un DNA di controllo positivo, come un pezzo di DNA circolare noto come plasmide che ha l'amplicone di interesse clonato al suo interno.

Prima di assemblare le reazioni in una piastra qPCR a 96 pozzetti, preparare un modello di tabella a 96 celle su carta ed etichettare ogni cella con la reazione che verrà caricata nella piastra. Includere le reazioni per ogni campione e standard in triplicato, nonché per il controllo positivo e il controllo negativo, come una reazione senza DNA.

Calcolare i volumi di reagenti necessari per una "miscela master" di reazione, che include tutti i reagenti che sono costanti tra le reazioni. Preparare una quantità sufficiente di master mix per le reazioni di triplicato per tutti i campioni e i controlli e un ulteriore 10% per tenere conto dell'errore di pipettaggio.

Una volta scongelati i reagenti, assemblare la miscela master in una provetta per microfuge a basso adsorbimento da 1,5 mL. Per fare ciò, agitare brevemente ogni reagente in modo che si mescoli accuratamente, raccogliere il liquido sul lato delle provette utilizzando una mini-centrifuga e pipettare il reagente nella provetta per microfuge. Assicurarsi di utilizzare nuovi puntali per pipette per ogni componente di reazione. Dopo che tutti i reagenti sono stati aggiunti, vortice per mescolare e centrifugare. Quindi, aliquotare la quantità appropriata di miscela master nei pozzetti designati sulla piastra PCR.

Quindi, agitare e centrifugare ogni provetta con il campione e il DNA di controllo e pipettare la quantità appropriata nei rispettivi pozzetti sulla piastra PCR. Una volta aggiunti i campioni, sigillare la piastra con una pellicola sigillante e utilizzare lo strumento di sigillatura per appiattire completamente il sigillo ed espellere eventuali bolle d'aria. Strappare con cautela le linguette non adesive dalle estremità del sigillo.

Per raccogliere completamente la miscela di reazione sul fondo dei pozzetti, posizionare la piastra di reazione in una centrifuga con un portapiastre e bilanciare correttamente il rotore con una piastra di contrappeso. Centrifugare la piastra a impulsi fino a 1.000 giri/min, quindi lasciare che la centrifuga si fermi lentamente senza freni.

Posizionare la piastra di reazione nella macchina qPCR. Impostare il programma PCR in base alle specifiche del produttore, impostando la temperatura di fusione in base alla coppia di primer utilizzata. Impostare l'esecuzione del programma di reazione.

Una volta completato il programma qPCR, il software sarà in grado di utilizzare le concentrazioni note del controllo positivo per calcolare la quantità di cDNA in ogni reazione. È quindi possibile calcolare la quantità di virus nel campione originale.

Una volta completato il programma qPCR, il software sarà in grado di utilizzare le concentrazioni note del controllo positivo per calcolare la quantità di cDNA in ogni reazione.

Con i risultati della qPCR, il volume trasferito nei pozzetti, l'estrazione dal suolo e il fattore della trascrizione inversa, è possibile calcolare il numero di virus nel campione iniziale di terreno.

Ora che sai come viene eseguita la qPCR, diamo un'occhiata a come può essere utilizzata per analizzare diversi campioni ambientali.

qPCR può essere utilizzata per quantificare la quantità di virus recuperati da molti tipi diversi di campioni. In questa applicazione, due diversi tipi di adenovirus sono stati concentrati da campioni d'acqua con una serie di metodi diversi. Il DNA è stato quindi estratto dai virus e sottoposto a qPCR, per valutare l'efficienza relativa dei metodi di concentrazione.

Un'altra applicazione per l'enumerazione microbica basata sulla qPCR è quella di quantificare il contenuto batterico in campioni alimentari e agricoli, in questo esempio, campioni di feci e lettiere provenienti da allevamenti di polli. Piuttosto che prendere di mira singole specie, gli scienziati hanno eseguito la qPCR utilizzando primer contro un gene altamente conservato trovato in tutti i batteri e hanno quantificato la comunità batterica totale trovata nei campioni.

Infine, come accennato in precedenza, uno svantaggio della metodologia qPCR tradizionale è che i microbi vivi e morti non possono essere distinti. Tuttavia, aggiungendo una sostanza chimica nota come monoazide di propidio, o PMA, che può entrare solo nelle cellule morte dove si lega al DNA per inibire le successive reazioni enzimatiche come la PCR, i ricercatori sono stati in grado di distinguere tra colture vive e morte di E. coli O157: H7, un ceppo patogeno comune trovato nel cibo e nell'acqua contaminati.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla quantificazione di microrganismi e virus ambientali utilizzando la qPCR. A questo punto dovresti capire come funziona la qPCR, come utilizzare la qPCR per misurare la quantità di un microbo in un campione ambientale e alcune applicazioni di questa tecnica. Grazie per l'attenzione!