Quantificazione di microrganismi e virus ambientali mediante qPCR

1. Raccolta dei campioni

1. Raccogli il terreno usando una coclea o una pala a una determinata profondità. Se si raccoglie il terreno dalla rizosfera, raccogliere il terreno solo entro 7 mm intorno alla radice della pianta, colpendo il terreno in eccesso dalla radice e raschiando il terreno desiderato in un barile di raccolta.
2. Mettere un flacone sterile di Nalgene nel bastoncino da immersione. Tenere l'estremità del bastone e raccogliere l'acqua immergendo la bottiglia. Metti la bottiglia in un dispositivo di raffreddamento con ghiaccio.
3. Trasferire i campioni al laboratorio.

2. Estrazione degli acidi nucleici

1. Per isolare i microrganismi dai campioni raccolti e per estrarre DNA e/ o RNA da essi, si prega di vedere il video Di JoVE Science Education sull'estrazione di acidi nucleici della comunità.

3. Trascrizione inversa

1. Se il materiale genetico da dosare è l'RNA, deve essere utilizzato per generare DNA complementare (cDNA) tramite trascrizione inversa prima di procedere alla PCR. Per i dettagli, fare riferimento al video Di JoVE Science Education su RT-PCR.

4. Impostazione di qPCR

1. Recuperare i reagenti conservati a -20 °C e scongelarli sul ghiaccio o a temperatura ambiente all'interno di una cappa pulita. I reagenti utilizzati in questo esempio includono la miscela di reazione qPCR (dipendente dalla macchina qPCR utilizzata; contiene DNA polimerasi), primer avanti e indietro e la sonda TaqMan. Le sequenze di primer e sonda sono progettate con sequenze specifiche per l'organismo che viene enumerato. Fare riferimento alla letteratura corrente per trovare sequenze di interesse. In questo esempio, verrà utilizzato il sistema di reagenti Roche Light Cycler 480 Probes Mix. Il virus della mottle lieve del pepe sarà enumerato nel campione di acqua. ^1,2 Vedere la Tabella 1 per le sequenze di primer e sonda.
2. Scongelamento estratto (c)DNA da campioni e il DNA di controllo positivo (che consiste in sequenze specifiche dell'organismo clonate in plasmidi batterici) a temperatura ambiente.
3. Preparare un modello di tabella a 96 celle simile alla piastra qPCR a 96 pozzetti. Etichettare ogni cella con la reazione che verrà caricata sulla piastra. Includere reazioni per ogni campione e standard in triplice copia, nonché per il controllo positivo e il controllo negativo, come una reazione senza DNA.
4. Calcolare i volumi di reagenti necessari per una reazione "master mix", che include tutti i reagenti che sono costanti tra le reazioni, in base alle istruzioni del produttore e alla letteratura. Preparare un mix master sufficiente per le reazioni triplicate per tutti i campioni più i controlli e un ulteriore 10% per tenere conto dell'errore di pipettaggio. Per una ricetta di master mix di esempio, fare riferimento alla Tabella 2.
5. Lavorando all'interno di una cappa pulita, una volta che tutti i reagenti sono completamente scongelati, aggiungere la quantità calcolata di ciascun reagente in un tubo di microfuga a bassa legatura da 1,5 ml per creare una miscela principale. Vortice e minicentrifugare brevemente ogni reagente prima di aggiungere. Cambiare la punta della pipetta tra ciascun reagente per evitare la contaminazione e garantire concentrazioni corrette. Dopo che tutti i reagenti sono stati aggiunti, vortice e minicentrifuga tubo con la miscela master per garantire l'omogeneità.
6. Aliquotare il volume appropriato della miscela master in ciascun pozzo designato nella piastra PCR a 96 pozzi.
7. Aggiungere il volume appropriato di (c) campione di DNA, plasmide di controllo positivo e controllo negativo (acqua di grado molecolare) in pozzi designati.
8. Una volta aggiunti tutti i campioni e i controlli, sigillare la piastra con la pellicola sigillante. Utilizzare uno strumento di tenuta per spingere l'aria fuori da sotto la lamina e prevenire le bolle. Strappare con cura i bordi della lamina.
9. Centrifugare la piastra sigillata a 96 pozzetti in una centrifuga con un portapiatti per raccogliere la miscela sul fondo di ciascun pozzettino. Assicurarsi di utilizzare una piastra di contrappeso per garantire che la centrifuga sia adeguatamente bilanciata durante la rotazione. Centrifuga a impulsi fino a 1000 giri/min, quindi lascia che la centrifuga si fermi lentamente senza freni.

5. Funzionamento qPCR

1. Posizionare la piastra sigillata a 96 pozzi nella macchina qPCR. Assicurarsi che la macchina indichi che è pronta per l'avvio.
2. Seguire le istruzioni della macchina qPCR per inserire correttamente tutte le informazioni necessarie al software, quindi impostare la macchina qPCR per l'esecuzione.
3. Dopo che la macchina ha completato l'esecuzione, il software sarà in grado di utilizzare le concentrazioni note del controllo positivo per calcolare la quantità di cDNA in ogni reazione. La quantità di virus nel campione originale può quindi essere calcolata, in base ai processi di diluizione, filtrazione, concentrazione, amplificazione e / o estrazione eseguiti per ottenere il campione di DNA.

Reagente	Sequenza (5' → 3')	Volume (μL / bene)	Finale Conc.
Primer in avanti	GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA	2.25	900 nM
Primer inverso	TTGTCGGTTGCAATGCAAGT	2.25	900 nM
Sonda	FAM-CCTACCGAAGCAAATG-BHQ1	1.0	200 nM

Tabella 1. Sequenze di primer e sonda per il rilevamento del virus del pepe lieve.

Reagente	Volume (μL / bene)	Numero di pozzi	Volume master mix (μL)
LC 480 Mix	12.5	26	325
Molecolare H2O	4.5		117
Primer in avanti	2.25		58.5
Primer inverso	2.25		58.5
Sonda	1.0		26
Totale	22.5		585

Tabella 2. Volumi di reagenti per reazioni individuali e master mix.