Cellule embrionali staminali endoteliali derivati dalle cellule per il trattamento di ischemia degli arti posteriori
23 gennaio 2009
La procedura chirurgica per la consegna delle cellule staminali embrionali derivate le cellule endoteliali alle arti posteriori ischemico è dimostrato, con il monitoraggio non invasivo per l'imaging bioluminescenza.
Malattia arteriosa periferica. La MAP deriva da un restringimento delle arterie periferiche che forniscono sangue e ossigeno alle gambe e ai piedi, portando a una disfunzione vascolare. Per determinare se le cellule staminali possono essere utilizzate per trattare la MAP, iniettiamo cellule endoteliali derivate da cellule staminali embrionali nell'arto posteriore dopo l'induzione di ischemia.
Poiché queste cellule sono state modificate per esprimere la luciferasi della lucciola, possono essere monitorate mediante imaging bioluminescente per determinare se si dirigono verso il sito della lesione e se hanno un effetto terapeutico. Ciao, sono John Cook. Sono professore di medicina nella divisione di medicina cardiovascolare presso la Stanford University.
Il nostro laboratorio si interessa di angiogenesi e rigenerazione vascolare. In questo video, due dei miei ricercatori postdottorandi, la dottoressa Nan Wong e Hir Niyama, vi illustreranno le procedure per il trapianto terapeutico di cellule nell'ischemia degli arti e per l'imaging non invasivo della sopravvivenza cellulare. Queste procedure comprendono i seguenti passaggi: la somministrazione di cellule staminali embrionali direttamente in cellule stereo per il trattamento dell'ischemia unilaterale dell'arto posteriore e il monitoraggio non invasivo del danno e della sopravvivenza cellulare mediante imaging bioluminescente.
Iniziamo. Iniziare la procedura preparando un topo di otto mesi della ceppa SV 1 29 sottoposto a ischemia dell'arto posteriore per il trapianto cellulare. A tale scopo, posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia contenente da 1 a 3% di ISO fluoruro in ossigeno al 100% con un flusso di un litro al minuto.
Lasciare il topo nella camera di induzione fino a quando non risponde a stimoli esterni. Successivamente, rimuovere l'animale dalla camera di induzione. Quindi posizionare l'animale in posizione supina sul tavolo operatorio e collegarlo a un flusso continuo di 1-3% di ISO in ossigeno al 100% a una portata di un litro al minuto.
Pulire la cute dell'arto posteriore con tre passaggi alternati di Betadina e alcol. Una volta pulita la cute, ottenere 1 milione di cellule endoteliali derivate da cellule staminali embrionali murine in 30 microlitri di soluzione salina tamponata al fosfato. Caricare queste cellule in un ago da 28 gauge utilizzando il PBS.
Quando le cellule sono pronte, sollevare delicatamente ed estendere l'arto posteriore per visualizzare meglio la posizione del muscolo gastrocnemio. Mentre l'arto è esteso, inserire l'ago attraverso la cute nel muscolo sottostante. Prestare attenzione a non avvicinarsi all'osso e iniettare lentamente la miscela cellulare di 30 microlitri nel gastrocnemio.
Per un'iniezione intramuscolare, 30 microlitri è vicino al limite del volume iniettabile. Pertanto, si preferiscono siringhe per insulina da 28 gauge perché, per la nostra esperienza, eliminano il volume perso nei cannelli delle siringhe. Al termine dell'iniezione, riportare il topo nella gabbia di recupero.
Lasciare l'animale in recupero per diverse ore, quindi procedere con l'immagine bioluminescente in vivo delle cellule trapiantate. Le cellule endoteliali derivate da ESC trapiantate sono state modificate per esprimere sia il gene della luciferasi della lucciola sia il gene di fusione della proteina verde fluorescente migliorata sotto il controllo di un promotore ubiquitario interno. Pertanto, la bioluminescenza può essere utilizzata per tracciare le cellule all'interno dell'arto posteriore ischemico.
Per iniziare questo passaggio, accendere il sistema di imaging bioluminescente e il software di acquisizione delle immagini in tempo reale. Quindi inizializzare il sistema di acquisizione. Successivamente, specificare le dimensioni del campo visivo.
Successivamente, posizionare un foglio di carta nera opaca all'interno della scatola di imaging per assorbire l'emissione di fondo. Una volta pronta la scatola di imaging, inserire il topo nella camera di induzione dell'anestesia contenente da 1 a 3% di isoflurano in ossigeno con un flusso di un litro al minuto. Lasciare il topo nella camera di induzione fino a quando non risponde a stimoli esterni.
Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione. Iniettare 10 microlitri di Lucifer per grammo di peso corporeo nel peritoneo. Il luciferina è stato preparato in anticipo in soluzioni stock filtrate da 15 milligrammi per millilitro in PBS.
Dopo l'iniezione della luciferina, posizionare l'animale nella scatola per imaging sopra un foglio di carta nera in posizione supina, collegandolo a un flusso continuo di fluoruro di iso (ISO). Acquisire immagini per 10-60 secondi al fine di determinare il tempo di esposizione ottimale per il quale l'immagine non risulta saturata. Se l'immagine dovesse saturarsi, ridurre il tempo di esposizione.
Se il segnale di bioluminescenza è molto debole, aumentare il tempo di esposizione. Utilizzando il tempo di esposizione ottimale, continuare ad acquisire immagini ogni uno-tre minuti fino a quando il segnale raggiunge il massimo e poi si attenua. Al termine di ogni acquisizione, salvare il file per analizzare i dati, selezionando regioni di interesse o ROI che coprano il sito di iniezione come controllo negativo.
È possibile selezionare un'area di interesse simile per la gamba non operata. Utilizzando il software, misurare la radianza totale per le stesse aree di interesse in ciascun file.
Il valore massimo deve essere utilizzato nei dati finali. I dati possono anche essere esportati in un foglio di calcolo Excel per un uso futuro. Una volta acquisiti tutti i dati, restituire l'animale alla gabbia di recupero e monitorare fino a quando l'animale si sveglia; ripetere questa procedura per tracciare le cellule.
Nel tempo, in un momento prestabilito, l'animale può essere soppresso per la valutazione della funzione tissutale. Di seguito è riportato un andamento rappresentativo dell'imaging della bioluminescenza delle cellule trapiantate nell'arto posteriore ischemico sinistro, rilevato un giorno dopo l'iniezione delle cellule; la regione di interesse (ROI), indicata con un cerchio rosso, corrisponde alla zona in cui le cellule sono state somministrate. La scala cromatica corrisponde al numero di cellule trapiantate, dove i colori rosso e giallo indicano un'intensità di bioluminescenza maggiore rispetto ai colori blu e verde.
Come si può osservare, l'arto di controllo non presenta bioluminescenza, mentre l'arto iniettato con le cellule mostra una forte bioluminescenza durante l'acquisizione del segnale. Nel tempo, il segnale di bioluminescenza nella regione di interesse (ROI) aumenta fino a raggiungere un valore massimo, per poi diminuire in questo grafico. Il valore massimo di bioluminescenza, misurato come massima radianza, viene raggiunto a 27 minuti dall'inizio dell'acquisizione.
Questo valore massimo deve essere riportato per l'analisi dei dati. Abbiamo appena mostrato come somministrare e monitorare cellule staminali embrionali differenziate in cellule seriali per il trattamento dell'ischemia dell'arto inferiore. Questa procedura può essere preceduta dall'induzione di ischemia dell'arto inferiore, che è illustrata in un altro video di JoVE di ER et al.
Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di limitare il volume di cellule iniettate in PBS a un massimo di 30 microlitri, al fine di prevenire la fuoriuscita sottocutanea delle cellule. Inoltre, durante l'acquisizione di immagini di bioluminescenza, evitare la saturazione dell'intensità dell'immagine utilizzando intervalli di esposizione troppo lunghi. Questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
In questo articolo viene illustrata una procedura chirurgica per somministrare cellule endoteliali derivate da cellule staminali embrionali all'arto posteriore ischemico. Le cellule vengono monitorate in modo non invasivo mediante imaging della bioluminescenza per valutarne gli effetti terapeutici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sulle cellule staminali
- Medicina cardiovascolare
Sfondo
- La malattia arteriosa periferica (PAD) provoca il restringimento delle arterie periferiche.
- La PAD porta a una riduzione del flusso sanguigno e dell'apporto di ossigeno alle gambe e ai piedi.
- Le cellule staminali hanno potenziali effetti terapeutici nel trattamento della PAD.
- L'imaging mediante bioluminescenza consente il tracciamento delle cellule staminali in vivo.
Scopo dello studio
- Studiare l'uso di cellule endoteliali derivate da cellule staminali embrionali nel trattamento della malattia arteriosa periferica (PAD).
- Determinare la capacità di queste cellule di migrare verso il sito di ischemia.
- Valutare gli effetti terapeutici delle cellule iniettate.
Metodi Utilizzati
- Induzione dell'ischemia nell'arto posteriore.
- Iniezione di cellule endoteliali derivate da cellule staminali embrionali.
- Modifica delle cellule per esprimere la luciferasi della lucciola per il tracciamento.
- Imaging bioluminescente non invasivo per monitorare il comportamento delle cellule.
Risultati principali
- Consegna con successo di cellule staminali all'arto posteriore ischemico.
- Le cellule sono state tracciate efficacemente mediante imaging bioluminescente.
- Evidenza di reclutamento delle cellule verso il sito di lesione.
- Effetti terapeutici potenziali osservati nell'area trattata.
Conclusioni
- Le cellule endoteliali derivate da cellule staminali embrionali possono essere efficacemente somministrate a tessuti ischemici.
- L'imaging bioluminescente è uno strumento prezioso per il tracciamento delle terapie con cellule staminali.
- Questo approccio potrebbe offrire nuove possibilità per il trattamento della malattia arteriosa periferica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo protocollo illustra un modello preclinico per la valutazione di terapie a base di cellule staminali mirate alla rigenerazione vascolare nella malattia arteriosa periferica. Permettendo il monitoraggio non invasivo delle cellule endoteliali trapiantate mediante imaging della bioluminescenza, l'approccio consente una riduzione meccanicistica dei rischi associati alle ipotesi riguardanti l'omming e la sopravvivenza cellulare. Il modello fornisce un sistema rilevante per la patologia, utile per valutare il potenziale terapeutico prima dell'ottimizzazione del composto leader nei programmi di medicina rigenerativa cardiovascolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'innesto delle cellule endoteliali e del segnale paracrino nei tessuti ischemici.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative di bioluminescenza per convalidare l'interazione funzionale con la destinazione da parte delle cellule somministrate.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Stabilisce una piattaforma riproducibile per lo screening di varianti di cellule staminali in base all'efficienza di homing e alla persistenza.
- Valore operativo: Standardizza il volume di somministrazione cellulare (30 µL) e i parametri di imaging per garantire la coerenza del saggio tra esperimenti diversi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Utilizza l'ischemia unilaterale dell'arto posteriore come modello rilevante per la malattia al fine di valutare gli esiti di rigenerazione vascolare.
- Valore operativo: Consente il monitoraggio longitudinale della sopravvivenza cellulare, permettendo decisioni adattate al rischio per l'avanzamento preclinico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta fornendo una validazione precoce dei meccanismi delle terapie cellulari prima di passare agli studi di efficacia nelle fasi di identificazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Verifica l'ipotesi secondo cui le cellule endoteliali derivate da cellule staminali embrionali si dirigono verso siti ischemici e contribuiscono al riparo vascolare.
- Screening: Permette un confronto quantitativo tra preparazioni cellulari in base all'intensità del segnale di bioluminescenza nel tempo.
- Analisi: Produce misurazioni della radianza che consentono di definire le relazioni dose-risposta e le finestre ottimali di imaging.
- Ricerca traslazionale: Si allinea alla continuità preclinica modellando la fisiopatologia umana della malattia arteriosa periferica in un sistema murino.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato di imaging applicabile a diversi candidati terapeutici cellulari nei programmi cardiovascolari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei meccanismi della terapia cellulare attraverso la visualizzazione diretta della dinamica di attecchimento.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità mediante protocolli standardizzati di anestesia, iniezione e imaging.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione fornendo evidenze precoci dell'omming e della sopravvivenza cellulare.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati alle cellule staminali basata sul potenziale di attecchimento, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle procedure chirurgiche su modelli murini e nell'induzione del modello di ischemia.
- Dipende da sistemi di imaging bioluminescente e da linee cellulari esprimenti luciferasi.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi per la preparazione delle cellule, il volume di iniezione e la selezione delle aree di interesse (ROI).
- Deve tenere conto della variabilità biologica nella gravità dell'ischemia durante l'interpretazione dei dati di attecchimento.
- Limitato alla validazione preclinica; non valuta il recupero funzionale né gli esiti terapeutici a lungo termine.
