Name: Cellule embrionali staminali endoteliali derivati dalle cellule per il trattamento di ischemia degli arti posteriori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Scopri come trapiantare cellule endoteliali derivate da staminali embrionali nell'arto ischemico per trattare la malattia arteriosa periferica. Questo metodo utilizza l'imaging bioluminescente per tracciare non invasivamente le cellule in vivo.

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Gli autori ringraziano Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, e lo Small Animal Imaging Stanford Nucleo per l&#39;assistenza tecnica. Gli autori hanno anche ringraziare AM Bickford, Inc. per il supporto di attrezzature veterinarie. Questa ricerca è stata sostenuta da borse di ricerca dal National Institutes of Health (R01 HL-75774, CA098303 R01, R21 HL085743, 1K12 HL087746), il tabacco California sul programma di ricerca sulle malattie della University of California (15IT-0257 e 1514RT-0169) , e l&#39;Istituto di Medicina Rigenerativa della California (RS1-00183). NH è sostenuto da una borsa di studio della American Heart Association. può Heart Association.

1. Differenziazione dei CES murino in cellule endoteliali <ol><li> Il protocollo per la differenziazione in cellule endoteliali CES è descritto altrove e non è il focus di questo protocollo 2,3. In breve, le cellule possono differenziarsi, e le cellule che sono positivi per i marcatori endoteliali come CD31 o caderina vascolare endoteliale (VE-caderina) sono poi purificata mediante fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS). </li></ol> 2. La costruzione del gene doppia Reporter fusione e trasduzione lentivirali <ol><li> Bioluminescenza può essere utilizzato per monitorare le cellule che vengono modificate per esprimere geni reporter come la lucciola luciferasi (fluttuazioni). Per questa applicazione, le nostre cellule contengono sia fluttuazioni e migliorato proteina verde fluorescente (eGFP) del gene di fusione sotto il controllo di un promotore interno ubiquitina. Al fine di modificare le cellule, il vettore transgene lentivirale contenente elementi chiave ottimizzate genetica per soddisfare i criteri di bio-sicurezza e una maggiore efficienza di trasduzione, PFU-FG vettore sviluppate nel nostro laboratorio portando la fluttua-eGFP gene reporter di fusione può essere utilizzata per stabilmente trasdurre le cellule dopo la differenziazione. Questo costrutto fusione permette sia bioluminescenza e il monitoraggio fluorescenza delle cellule trapiantate. La procedura per la generazione di particelle virali, la trasduzione e la produzione di cellule marcate che i geni reporter di esprimere è descritto altrove 4. </li></ol> 3. Il trapianto di ESC-derivato cellule endoteliali alle arti posteriori ischemico <ol><li> Avviare la procedura di preparazione di un topo che ha subito l&#39;ischemia degli arti posteriori per il trapianto di cellule. Per fare questo, posizionare il mouse nella camera di induzione dell&#39;anestesia contenente 1-3% isoflurano in ossigeno al 100% con un flusso di 1L/min. </li><li> Lascia il mouse nella camera di induzione fino a che non non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l&#39;animale dalla camera di induzione. </li><li> Poi, posto l&#39;animale in posizione supina sul tavolo operatorio e collegarlo a un flusso continuo di 1-3% isoflurano in ossigeno al 100% con un flusso di 1L/min. </li><li> Pulire la pelle del arti posteriori con tre scrub alternati Betadine e alcol. </li><li> Una volta che la pelle è pulita, ottenere milione ESC-derivato cellule endoteliali in 30 ml di tampone fosfato (PBS). Carico di queste cellule in un ago calibro 28. </li><li> Quando le cellule sono pronte, sollevare delicatamente ed estendere le arti posteriori per visualizzare meglio la posizione del muscolo gastrocnemio. Mentre la gamba si apre, inserire l&#39;ago attraverso la pelle nel muscolo sottostante. Fare attenzione a non avvicinarsi alle ossa. Delicatamente e iniettare lentamente il composto 30 microlitri di cellule nel gastrocnemio. Per iniezione intramuscolare, 30 microlitri è vicino al limite di volume che può essere iniettato. Pertanto, 28-indicatore di siringhe da insulina sono preferiti perché, nella nostra esperienza, eliminano il volume di perdita di aghi di siringa. </li><li> Dopo l&#39;iniezione è completa, ritorno il mouse per la gabbia di recupero e monitorare continuamente fino a quando sveglio. Permettere agli animali di recuperare per diverse ore e poi procedere con l&#39;imaging bioluminescenza in vivo delle cellule trapiantate. </li></ol> 4. L&#39;imaging bioluminescenza CES derivate cellule endoteliali in vivo <ol><li> Il trapiantato ESC cellule derivate endothelials sono stati modificati per esprimere sia l&#39;fluttuazioni e il gene di fusione eGFP sotto il controllo di un promotore interno ubiquitina. Pertanto, la bioluminescenza può essere utilizzato per tenere traccia delle celle all&#39;interno degli arti posteriori ischemico. </li><li> Per iniziare questo passaggio, attivare il sistema di imaging bioluminescenza e Immagine Living software di acquisizione. Poi inizializzare il sistema di acquisizione e specificare le dimensioni del campo visivo. </li><li> Successivamente, la carta nera opaca posto sulla scatola di imaging per assorbire le emissioni di fondo. </li><li> Una volta che la casella di imaging è pronto, posizionare il mouse nella camera di induzione dell&#39;anestesia contenente 1-3% isoflurano in ossigeno in uscita di 1L/min. Lascia il mouse nella camera di induzione fino a che non non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l&#39;animale dalla camera di induzione. </li><li> Rimuovere i capelli da entrambi zampe posteriori con un rasoio elettrico, se necessario. </li><li> Iniettare 10 ml di D-luciferina per grammo di peso corporeo nel peritoneo. Il D-luciferina è preparato in anticipo in soluzioni stock filtrato di 15 mg / ml in PBS. </li><li> Una volta che la luciferina viene iniettato, posto l&#39;animale nella casella di immagine sulla carta nera in posizione supina, collegato ad un flusso continuo di isoflurano. </li><li> Posizionamento animali nella casella di imaging e il collegamento a isoflurano. </li><li> Avvio di acquisire le immagini per 10-60 secondi al fine di determinare un momento ottimale di esposizione per cui l&#39;immagine non è saturo. Se l&#39;immagine si satura, ridurre il tempo di esposizione. Se il segnale di bioluminescenza è molto debole, aumentare il tempo di esposizione. </li><li> Using il tempo di esposizione ottimale, continuare l&#39;acquisizione di immagini ogni 1-3 minuti fino a quando il segnale raggiunge il massimo e poi svanisce. Quando l&#39;acquisizione è stata completata, salvare il file. </li><li> Per analizzare i dati, selezionare le regioni di interesse (ROI) che coprono il sito di iniezione. Come controllo negativo, un ROI simile può essere selezionato per il non-operato gamba. Utilizzando il software, misurare la luminosità totale, che è espressa in unità di fotoni / secondo / cm 2 / steradiante (p / s / cm 2 / sr), per il ROI per ogni timepoint. Il valore massimo deve essere utilizzato nei dati finali. I dati possono anche essere esportati in Excel per un uso futuro. </li><li> Una volta che tutti i dati sono acquisiti, rispedire l&#39;animale verso la gabbia di recupero e monitorare continuamente fino a quando il risveglio degli animali. </li><li> Ripetere questa procedura per monitorare le cellule nel tempo. </li><li> Ad un certo punto di tempo desiderato, l&#39;animale può essere eutanasia per la valutazione della funzione dei tessuti. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/old/1034_2009_1_22_4/figure 1.png" alt="Figura 1" width="600" height="600" /> Un&#39;immagine bioluminescenza rappresentante delle cellule trapiantate nella sinistra ischemica degli arti posteriori è mostrata in Figura 1. Durante l&#39;acquisizione di bioluminescenza, l&#39;intensità aumenta con il tempo, e il valore massimo ottenuto durante il periodo di tempo devono essere segnalati come il valore finale.

<ol><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> JoVE. , (2008).</li>
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<li>Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+bioluminescence+reporter+gene+imaging+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

CES sono una fonte di cellule promettente per il trattamento di ischemia del tessuto a causa della loro plasticità di differenziazione e la loro capacità di dare origine a linee cellulari che comprende tutti e tre i foglietti embrionali, comprese le cellule endoteliali. Per superare le questioni etiche associate con i CES, cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) può essere un&#39;alternativa fonte di staminali pluripotenti cella che supera i problemi etici. Oltre a CES, le cellule staminali adulte, come le cellule progenitrici endote...

<table><tbody><tr><td>Strumenti chirurgici</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Si preferisce una siringa da insulina da 28G</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone al fosfato</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Reagente</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td>Preparare la D-luciferina in anticipo in soluzioni stock filtrate da 15 mg/mL in PBS</td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione di immagini a bioluminescenza IVIS 200 e software di acquisizione</td><td>Attrezzatura</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Xenogen Corporation</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cellule embrionali staminali endoteliali derivati ​​dalle cellule per il trattamento di ischemia degli arti posteriori

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Malattia arteriosa periferica (PAD) è il risultato restringimento delle arterie periferiche che forniscono sangue ossigenato e sostanze nutritive alle gambe e ai piedi, questa patologia provoca sintomi come la claudicatio intermittente (dolore con piedi), dolorose ulcerazioni ischemiche o addirittura pericolose per la gangrena degli arti. Si ritiene generalmente che l&#39;endotelio vascolare, un monostrato di cellule endoteliali che investe la superficie luminale di tutti i vasi sanguigni e linfatici, gioca un ruolo dominante nell&#39;omeostasi vascolare e la rigenerazione vascolare. Di conseguenza, a base di cellule staminali rigenerazione dell&#39;endotelio può essere un approccio promettente per il trattamento PAD. In questo video, dimostriamo il trapianto di cellule staminali embrionali (ESC)-derivate cellule endoteliali per il trattamento di ischemia unilaterale hindimb come modello di PAD, seguita da monitoraggio non invasivo di homing delle cellule e della sopravvivenza attraverso l&#39;immagine bioluminescenza. I materiali e procedure specifiche per la consegna delle cellule e di imaging verranno descritte. Questo protocollo segue un&#39;altra pubblicazione che descrive l&#39;induzione di ischemia degli arti posteriori da Niiyama et al 1.

La procedura chirurgica per la consegna delle cellule staminali embrionali derivate le cellule endoteliali alle arti posteriori ischemico è dimostrato, con il monitoraggio non invasivo per l&#39;imaging bioluminescenza.

Cellule embrionali staminali endoteliali derivati ​​dalle cellule per il trattamento di ischemia degli arti posteriori

La malattia arteriosa periferica (PAD) è causata dal restringimento delle arterie periferiche che forniscono sangue ossigenato e nutrienti alle gambe e ai piedi. Questo...

Malattia arteriosa periferica. La MAP deriva da un restringimento delle arterie periferiche che forniscono sangue e ossigeno alle gambe e ai piedi, portando a una disfunzione vascolare. Per determinare se le cellule staminali possono essere utilizzate per trattare la MAP, iniettiamo cellule endoteliali derivate da cellule staminali embrionali nell'arto posteriore dopo l'induzione di ischemia.Poiché queste cellule sono state modificate per esprimere la luciferasi della lucciola, possono essere monitorate mediante imaging bioluminescente per determinare se si dirigono verso il sito della lesione e se hanno un effetto terapeutico. Ciao, sono John Cook. Sono professore di medicina nella divisione di medicina cardiovascolare presso la Stanford University.Il nostro laboratorio si interessa di angiogenesi e rigenerazione vascolare. In questo video, due dei miei ricercatori postdottorandi, la dottoressa Nan Wong e Hir Niyama, vi illustreranno le procedure per il trapianto terapeutico di cellule nell'ischemia degli arti e per l'imaging non invasivo della sopravvivenza cellulare. Queste procedure comprendono i seguenti passaggi: la somministrazione di cellule staminali embrionali direttamente in cellule stereo per il trattamento dell'ischemia unilaterale dell'arto posteriore e il monitoraggio non invasivo del danno e della sopravvivenza cellulare mediante imaging bioluminescente.Iniziamo. Iniziare la procedura preparando un topo di otto mesi della ceppa SV 1 29 sottoposto a ischemia dell'arto posteriore per il trapianto cellulare. A tale scopo, posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia contenente da 1 a 3% di ISO fluoruro in ossigeno al 100% con un flusso di un litro al minuto.Lasciare il topo nella camera di induzione fino a quando non risponde a stimoli esterni. Successivamente, rimuovere l'animale dalla camera di induzione. Quindi posizionare l'animale in posizione supina sul tavolo operatorio e collegarlo a un flusso continuo di 1-3% di ISO in ossigeno al 100% a una portata di un litro al minuto.Pulire la cute dell'arto posteriore con tre passaggi alternati di Betadina e alcol. Una volta pulita la cute, ottenere 1 milione di cellule endoteliali derivate da cellule staminali embrionali murine in 30 microlitri di soluzione salina tamponata al fosfato. Caricare queste cellule in un ago da 28 gauge utilizzando il PBS.Quando le cellule sono pronte, sollevare delicatamente ed estendere l'arto posteriore per visualizzare meglio la posizione del muscolo gastrocnemio. Mentre l'arto è esteso, inserire l'ago attraverso la cute nel muscolo sottostante. Prestare attenzione a non avvicinarsi all'osso e iniettare lentamente la miscela cellulare di 30 microlitri nel gastrocnemio.Per un'iniezione intramuscolare, 30 microlitri è vicino al limite del volume iniettabile. Pertanto, si preferiscono siringhe per insulina da 28 gauge perché, per la nostra esperienza, eliminano il volume perso nei cannelli delle siringhe. Al termine dell'iniezione, riportare il topo nella gabbia di recupero.Lasciare l'animale in recupero per diverse ore, quindi procedere con l'immagine bioluminescente in vivo delle cellule trapiantate. Le cellule endoteliali derivate da ESC trapiantate sono state modificate per esprimere sia il gene della luciferasi della lucciola sia il gene di fusione della proteina verde fluorescente migliorata sotto il controllo di un promotore ubiquitario interno. Pertanto, la bioluminescenza può essere utilizzata per tracciare le cellule all'interno dell'arto posteriore ischemico.Per iniziare questo passaggio, accendere il sistema di imaging bioluminescente e il software di acquisizione delle immagini in tempo reale. Quindi inizializzare il sistema di acquisizione. Successivamente, specificare le dimensioni del campo visivo.Successivamente, posizionare un foglio di carta nera opaca all'interno della scatola di imaging per assorbire l'emissione di fondo. Una volta pronta la scatola di imaging, inserire il topo nella camera di induzione dell'anestesia contenente da 1 a 3% di isoflurano in ossigeno con un flusso di un litro al minuto. Lasciare il topo nella camera di induzione fino a quando non risponde a stimoli esterni.Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione. Iniettare 10 microlitri di Lucifer per grammo di peso corporeo nel peritoneo. Il luciferina è stato preparato in anticipo in soluzioni stock filtrate da 15 milligrammi per millilitro in PBS.Dopo l'iniezione della luciferina, posizionare l'animale nella scatola per imaging sopra un foglio di carta nera in posizione supina, collegandolo a un flusso continuo di fluoruro di iso (ISO). Acquisire immagini per 10-60 secondi al fine di determinare il tempo di esposizione ottimale per il quale l'immagine non risulta saturata. Se l'immagine dovesse saturarsi, ridurre il tempo di esposizione.Se il segnale di bioluminescenza è molto debole, aumentare il tempo di esposizione. Utilizzando il tempo di esposizione ottimale, continuare ad acquisire immagini ogni uno-tre minuti fino a quando il segnale raggiunge il massimo e poi si attenua. Al termine di ogni acquisizione, salvare il file per analizzare i dati, selezionando regioni di interesse o ROI che coprano il sito di iniezione come controllo negativo.È possibile selezionare un'area di interesse simile per la gamba non operata. Utilizzando il software, misurare la radianza totale per le stesse aree di interesse in ciascun file.Il valore massimo deve essere utilizzato nei dati finali. I dati possono anche essere esportati in un foglio di calcolo Excel per un uso futuro. Una volta acquisiti tutti i dati, restituire l'animale alla gabbia di recupero e monitorare fino a quando l'animale si sveglia; ripetere questa procedura per tracciare le cellule.Nel tempo, in un momento prestabilito, l'animale può essere soppresso per la valutazione della funzione tissutale. Di seguito è riportato un andamento rappresentativo dell'imaging della bioluminescenza delle cellule trapiantate nell'arto posteriore ischemico sinistro, rilevato un giorno dopo l'iniezione delle cellule; la regione di interesse (ROI), indicata con un cerchio rosso, corrisponde alla zona in cui le cellule sono state somministrate. La scala cromatica corrisponde al numero di cellule trapiantate, dove i colori rosso e giallo indicano un'intensità di bioluminescenza maggiore rispetto ai colori blu e verde.Come si può osservare, l'arto di controllo non presenta bioluminescenza, mentre l'arto iniettato con le cellule mostra una forte bioluminescenza durante l'acquisizione del segnale. Nel tempo, il segnale di bioluminescenza nella regione di interesse (ROI) aumenta fino a raggiungere un valore massimo, per poi diminuire in questo grafico. Il valore massimo di bioluminescenza, misurato come massima radianza, viene raggiunto a 27 minuti dall'inizio dell'acquisizione.Questo valore massimo deve essere riportato per l'analisi dei dati. Abbiamo appena mostrato come somministrare e monitorare cellule staminali embrionali differenziate in cellule seriali per il trattamento dell'ischemia dell'arto inferiore. Questa procedura può essere preceduta dall'induzione di ischemia dell'arto inferiore, che è illustrata in un altro video di JoVE di ER et al.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di limitare il volume di cellule iniettate in PBS a un massimo di 30 microlitri, al fine di prevenire la fuoriuscita sottocutanea delle cellule. Inoltre, durante l'acquisizione di immagini di bioluminescenza, evitare la saturazione dell'intensità dell'immagine utilizzando intervalli di esposizione troppo lunghi. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Modello murino di ischemia degli arti posteriori

Un metodo per il titanio semina sangue a contatto con le cellule autologhe biomateriali e biocompatibilità test è descritta. Questo metodo utilizza cellule progenitrici endoteliali e tubi in titanio, teste di serie in pochi minuti di impianto chirurgico nelle cave cavae suina. Questa tecnica è adattabile a molti altri dispositivi biomedici impiantabili.

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Le cellule endoteliali che formano colonie (ECFCs) sono cellule endoteliali circolanti con una robusta potenziale proliferativo clonale che mostrano...

Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali Colony Forming derivato dal sangue del cordone ombelicale umano

Descriviamo il metodo di cellule staminali programmazione di iperespressione fattori terapeutici per angiogenesi utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Processi descritti includono sintesi dei polimeri, trasfezione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo in vitro, e convalida l'efficacia delle cellule staminali programmato per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

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Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

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Modello preclinico di ischemia degli arti posteriori nei conigli diabetici

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