Sintesi in fase solida

Solid Phase Synthesis

JoVE Science Education
Organic Chemistry II

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JoVE Science Education Organic Chemistry II

Solid Phase Synthesis

5.2: Nucleophilic Substitution

5.15: Polarimeter

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09:42 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Vy M. Dong e Diane Le, Dipartimento di Chimica, Università della California, Irvine, CA

La sintesi in fase solida di Merrifield è un’invenzione vincitrice del premio Nobel in cui una molecola reagente è legata su un supporto solido e subisce successive reazioni chimiche per formare un composto desiderato. Quando le molecole sono legate a un supporto solido, i reagenti e i sottoprodotti in eccesso possono essere rimossi lavando via le impurità, mentre il composto bersaglio rimane legato alla resina. In particolare, mostreremo un esempio di sintesi peptidica in fase solida (SPPS) per dimostrare questo concetto.

Principles

La sintesi in fase solida è un metodo utilizzato per semplificare la sintesi delle molecole. Viene spesso utilizzato in chimica combinatoria (una tecnica utilizzata per preparare un gran numero di molecole in un breve periodo di tempo), per generare librerie di composti a causa della facilità di purificazione e sintesi chimica complessiva. La sintesi in fase solida comporta tipicamente l’uso di una resina; un materiale non solubile a base di polimeri, che è pre-funzionalizzato in modo che il blocco di costruzione di partenza può facilmente legarsi. I blocchi di costruzione sono generalmente protetti una volta aggiunti alla resina e possono essere facilmente deprotetti e trattati con il successivo blocco desiderato in soluzione (Figura 1). Una volta che la molecola desiderata è stata sintetizzata, può essere facilmente scissa dalla resina.

Poiché è robusta, la sintesi in fase solida è stata utilizzata per sintetizzare acidi nucleici, oligosaccaridi e, più comunemente, peptidi. Scoperto e riportato da Robert Bruce Merrifield nel 1963, SPPS è diventato il metodo più utilizzato per generare librerie di peptidi. Merrifield ha vinto il premio Nobel 1984 per l’invenzione di SPPS. SPPS può facilmente sfruttare i gruppi di protezioneNFmoc (sensibile alla base) o Boc (sensibile agli acidi) sugli amminoacidi per costruire librerie di peptidi in un breve lasso di tempo. HBTU (agente di accoppiamento) e i-Pr₂EtN (base) attivano il C-terminusdell’amminoacido per l’accoppiamento con un altro amminoacido. I gruppi protettivi fmoc possono essere rimossi dalla 4-metilpiperidina, mentre i gruppi protettivi Boc possono essere rimossi da acidi forti come l’acido trifluoroacetico. In questo esperimento, dimostreremo SPPS attraverso la sintesi di un dipeptide. Useremo il Kaiser test, un metodo qualitativo per testare la presenza di ammine primarie, per monitorare l’andamento della reazione.

Figura 1. Concetto alla base della sintesi peptidica in fase solida (SPPS).

Procedure

1. Caricamento della resina

In un recipiente di sintesi peptidica da 100 ml, aggiungere resina di cloruro di 2-clorotrityl (CTC) (1,1 mmol / g, 0,360 g, 0,400 mmol). Aggiungere 20 mL DMF e lasciarli gonfiare per 30 minuti sotto N_2.
Scolare le perle sotto vuoto e aggiungere 10 mL di DMF.
Aggiungere 500 mg di Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) e 2,5 mL i-Pr₂EtN e mescolare sotto N₂ per 15 minuti.
Scaricare il solvente sotto vuoto e ripetere il caricamento con Fmoc-Ala-OH per 15 min.
Scaricare il solvente sotto vuoto e lavare le perle con 10 ml DMFunder N₂e scaricare sotto vuoto 3x.

2. Deprotezione del Gruppo Fmoc

Aggiungere 10 mL 20% 4-metilpiperidina in DMF e mescolare le perle sotto N₂ per 15 min.
Scaricare il solvente sotto vuoto e ripetere la deprotezione.
Lavare le perle con 10 mL DMF sotto N₂ e scolare sotto vuoto 3x.

3. Esecuzione del Kaiser Test

Eseguire il test Kaiser aggiungendo 1-2 gocce di soluzione A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL piridina), soluzione B (1 g ninidrina, 20 mL n-butanolo) e soluzione C (20 g fenolo, 10 ml n-butanolo)ciascuna in due provette. Una provetta sarà il controllo mentre l’altra monitorerà la reazione.
Aggiungere alcune pere di resina dal recipiente di reazione alla provetta di reazione e riscaldare le due provette a 110 °C.
Se la deprotezione è completa, il contenuto della provetta diventerà di un colore blu scuro/viola. Se la deprotezione è incompleta o non riuscita, la soluzione rimarrà gialla. Confrontare la provetta di reazione con la provetta di controllo.

4. Accoppiamento dei prossimi elementi costitutivi

Scaricare il solvente sotto vuoto.
Lavare le perle con 10 ml di N-metil-2-pirrolidone sotto N₂ e scaricare il solvente sotto vuoto.
Per iniziare l’accoppiamento successivo, aggiungere 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) e 2,5 mLi-Pr₂EtN e lasciare bollire la resina sotto N₂ per 30 minuti.
Scaricare il solvente sotto vuoto.
Lavare le perle con 10 mL DMF sotto N₂ e scolare sotto vuoto 3x.
Eseguire il test Kaiser (vedere i passaggi 3.1-3.3) per cercare il completamento dell’accoppiamento. Le pere e la soluzione nella provetta devono essere gialle.

5. Scindere il peptide dalla resina

Scindere il gruppo Fmoc rimanente utilizzando i passaggi 2.1-2.3.
Dopo che il solvente è stato drenato sotto vuoto, aggiungere 40 mL di soluzione di scissione (95% TFA, 2,5% H₂O, 2,5% TIPS) alla resina e bolle sotto N₂ per 3 ore.
Posizionare un nuovo pallone ricevente sul sintetizzatore peptidico e scolare la soluzione di FIA contenente il peptide desiderato sotto vuoto nel nuovo matraccio.

6. Precipitazione e I solazione del peptide

Separare la soluzione di TFA in 4 flaconcini conici e aggiungere 25 mL di etere freddo (-20 °C) a ciascun flaconcino per precipitare il peptide.
Centrifugare i flaconcini (3.000 giri/min, 0-4 °C) per 20 min. Decantare il TFA rimanente e la soluzione di etere dalle fiale coniche e concentrare il precipitato peptidico per consentire il dipeptide desiderato come solido bianco.

La sintesi in fase solida è un metodo in cui il prodotto viene sintetizzato mentre è legato a un materiale insolubile.

La sintesi in fase solida viene spesso utilizzata per produrre oligomeri biologici e polimeri come peptidi, acidi nucleici e oligosaccaridi. Queste molecole sono composte da catene di subunità molecolari più piccole, chiamate monomeri. Sintetizzare un oligomero o un polimero richiede molti passaggi, poiché i monomeri devono essere aggiunti nell’ordine corretto.

Un problema con le sintesi a più fasi è che la purificazione e l’isolamento dei prodotti stabili di ogni fase, chiamati prodotti intermedi,diminuisce la resa complessiva. Nella sintesi in fase solida, il prodotto intermedio rimane legato al supporto solido durante tutta la sintesi. Ciò consente di lavare via reagenti, solventi e sottoprodotti in fase soluzione, eliminando la necessità di purificare e isolare ogni prodotto intermedio tra una fase e l’altro.

Questo video illustrerà la procedura per la sintesi peptidica in fase solida e introdurrà alcune applicazioni della sintesi in fase solida in chimica.

Nella sintesi in fase solida, una molecola viene sintetizzata su un supporto solido in una sequenza di reazioni. Ad esempio, un oligomero o un polimero verrà sintetizzato un monomero alla volta per formare il prodotto finale. L’oligomero o polimero in crescita rimane fortemente legato al supporto solido fino a quando non viene separato, o scisso,dal supporto con reagenti.

Ogni monomero deve avere almeno due siti di legame per far parte della catena polimerica, ma solo un sito di legame può essere disponibile alla volta per garantire che il monomero si leghi all’atomo corretto. Ciò si ottiene con gruppi protettivi, che sono gruppi funzionali che non sono reattivi durante una o più fasi della sintesi. Il sito di legame viene ripristinato, o deprotetto,trattando la molecola con reagenti specifici per convertire il gruppo protettivo in un gruppo funzionale reattivo.

Per iniziare la sintesi in fase solida, il materiale di partenza è legato a una resina appositamente progettata o a un polimero insolubile nel suo unico sito di legame disponibile. Quindi, il materiale di partenza legato viene deprotetto per consentire il legame del secondo monomero nella catena. Successivamente, viene aggiunta una soluzione del secondo monomero nella catena, insieme a un agente di accoppiamento per facilitare il legame tra i monomeri.

Una volta che il secondo monomero si lega al materiale di partenza, il prodotto intermedio dimerico risultante viene deprotetto. Questo processo viene ripetuto fino a quando non si è formato l’oligomero o il polimero bersaglio. Il prodotto viene scisso dal supporto solido in soluzione, da cui può essere purificato, isolato e analizzato.

La sintesi in fase solida viene spesso utilizzata per la sintesi di peptidi, che sono catene di amminoacidi. Gli amminoacidi hanno un gruppo amminico, un gruppo carbossilico e un sostituente, o “catena laterale”. L’ammina è inizialmente protetta. Una volta deprotetta, l’ammina forma un legame peptidico con il gruppo carbossilico dell’amminoacido successivo.

Ora che hai capito i principi della sintesi in fase solida, passiamo attraverso una procedura per la sintesi peptidica in fase solida, in cui dimostreremo l’aggiunta dei primi due amminoacidi.

Per iniziare la procedura, collegare un pallone ricevente per i rifiuti a un recipiente di sintesi peptidica manuale da 100 ml. Quindi posizionare 0,360 g di resina cloruro di 2-clorotrityl nel recipiente. Collegare una linea di azoto gassoso al braccio laterale del recipiente e una linea di vuoto all’adattatore del tubo seghettato.

Aggiungere 20 ml di dimetilformammide alla resina e lasciare che le perle di resina si gonfino per 30 minuti sotto un flusso di azoto gassoso. Quindi, applicare il vuoto per drenare il solvente.

Aggiungere 10 mL di DMF, 1,6 mmol di un amminoacido protetto da Fmoc e 2,5 mL di N,N-diisopropiletilammina al vaso. Bolle sotto il gas azoto, che mescola la soluzione, per 15 minuti per caricare l’amminoacido protetto sulla resina.

Rimuovere il solvente sotto vuoto ed eseguire un secondo caricamento. Dopo aver rimosso il solvente, agitare le perle di resina caricate tre volte in porzioni da 10 ml di DMF, drenando ogni lavaggio nel pallone ricevente.

Quindi, aggiungere alle perle caricate 10 ml di una soluzione al 20% di 4-metilpiperidina in DMF. Bolle la miscela per 15 minuti per rimuovere il gruppo Fmoc.

Scaricare il solvente e ripetere la procedura di deprotezione. Lavare e scaricare la resina caricata tre volte, come prima. Conservare le pere sotto solvente fino a quando non sono pronte per il passaggio successivo.

Per verificare che il composto caricato fosse completamente deprotetto, posizionare da 1 a 2 gocce di ciascuna soluzione di prova Kaiser in due provette.

Posizionare alcune perle caricate in una provetta e riscaldare entrambi i tubi a 110 gradi in un bagno d’olio. La deprotezione è completa se la miscela di resina diventa blu scuro in viola, indicando la presenza di gruppi amminici nella miscela.

Per iniziare la fase di accoppiamento, lavare prima le perle con 10 ml di NMP sotto un flusso di gas N2.

Quindi, aggiungere 10 mL di NMP, 1,6 mmol del successivo amminoacido protetto da Fmoc, 1,6 mmol dell’agente di accoppiamento HBTU e 2,5 mL di DIPEA alla resina caricata.

Bolle il gas N2 attraverso la miscela di resina per 30 minuti, quindi scaricare il solvente. Lavare e scolare le perle con porzioni da 10 ml di DMF tre volte, come prima.

Ripeti il test Kaiser. L’accoppiamento si è verificato con successo se le perle e la soluzione ingialliscono, indicando che non sono presenti gruppi amminici.

Successivamente, scindere il nuovo gruppo Fmoc con il 20% di 4-metilpiperidina in DMF e lavare le perle con porzioni da 10 ml di DMF. Ripetere l’accoppiamento e la deprotezione per ogni amminoacido rimanente nel peptide bersaglio.

Dopo che l’ultimo amminoacido è stato deprotetto e le perle di resina sono state lavate, aggiungere 40 ml di soluzione di scissione peptidica per separare il prodotto peptidico dalla resina.

Bolle di azoto gassoso attraverso la miscela di resina per 3 ore, quindi sostituire il pallone ricevente. Trasferire la soluzione dalla miscela di resine al nuovo pallone ricevente sotto vuoto.

Per generare il prodotto finale, rimuovere il solvente con un evaporatore rotante.

La sintesi in fase solida è ampiamente utilizzata in biologia e chimica. Diamo un’occhiata ad alcuni esempi.

La sintesi in fase solida ha aperto molte nuove vie sintetiche agli oligosaccaridi, che sono catene corte di monomeri di zucchero semplici con importanti ruoli biologici, come l’accumulo di energia. A differenza dei legami peptidici, ogni legame tra gli zuccheri contiene uno stereocentro. Per sintetizzare un oligosaccaride, non solo i monomeri devono essere nell’ordine corretto, ma i legami devono anche avere la corretta stereochimica. Sono state sviluppate tecniche di sintesi in fase solida per accoppiare ogni monomero con un processo altamente stereoselettivo, che oggi è sufficientemente raffinato per essere automatizzato.

La sintesi in fase solida è un approccio comune alla chimica combinatoria, che è la pratica di sintetizzare molte varianti di un composto in un singolo processo sintetico. La resina caricata può essere facilmente divisa in porzioni per reagire con diversi monomeri o molecole. Dopo ogni reazione, le porzioni vengono lavate e ricombinate. Questo viene ripetuto fino a quando non è stato generato il numero desiderato di prodotti. Questa tecnica è particolarmente utile nella ricerca farmaceutica, in quanto può essere utilizzata per generare nuovi composti o per valutare la reattività di un composto con una vasta gamma di molecole.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla sintesi in fase solida. Ora dovresti capire i principi alla base della sintesi in fase solida, la procedura per la sintesi di peptidi in fase solida e alcuni esempi di come la sintesi in fase solida viene utilizzata in chimica organica. Grazie per l’attenzione!

Results

Risultati rappresentativi per la sintesi di peptidi in fase solida per la procedura 3.

Fase della procedura	Colore della soluzione
3.1	Controllo – Chiaro, giallo chiaro Reazione – Chiaro, giallo chiaro
3.2	Controllo – Chiaro, giallo chiaro Reazione – Blu scuro
3.3	Soluzione blu scuro, perle blu – completa deprotezione o accoppiamento fallito Incolore, perle gialle – deprotezione non riuscita o completamento completo Soluzione incolore, perle rosse – accoppiamento incompleto o deprotezione incompleta

Tabella 1. Risultati rappresentativi per Procedure 3.

Applications and Summary

In questo esperimento, abbiamo dimostrato un esempio di sintesi in fase solida tramite SPPS attraverso la sintesi di un dipeptide.

La sintesi in fase solida è ampiamente utilizzata nella chimica combinatoria per costruire librerie di composti per lo screening rapido. È stato comunemente usato per sintetizzare peptidi, oligosaccaridi e acidi nucleici. Inoltre, questo concetto è stato implementato nella sintesi chimica. Poiché è eterogeneo, questi reagenti supportati da solidi possono spesso essere riciclati e riutilizzati nelle reazioni successive.

Transcript

Solid phase synthesis is a method in which the product is synthesized while bound to an insoluble material.

Solid phase synthesis is often used to produce biological oligomers and polymers such as peptides, nucleic acids, and oligosaccharides. These molecules are composed of chains of smaller molecular subunits, called monomers. Synthesizing an oligomer or polymer takes many steps, as the monomers must be added in the correct order.

An issue with multi-step syntheses is that purification and isolation of the stable products of each step, called intermediate products, decreases the overall yield. In solid phase synthesis, the intermediate product remains bound to the solid support throughout synthesis. This allows solution-phase reagents, solvents, and byproducts to be washed away, eliminating the need to purify and isolate each intermediate product between steps.

This video will illustrate the procedure for solid phase peptide synthesis and introduce a few applications of solid phase synthesis in chemistry.

In solid-phase synthesis, a molecule is synthesized on a solid support in a sequence of reactions. For instance, an oligomer or polymer will be synthesized one monomer at a time to form the final product. The growing oligomer or polymer remains strongly bound to the solid support until it is separated, or cleaved, from the support with reagents.

Each monomer must have at least two binding sites to be part of the polymer chain, but only one binding site can be available at a time to ensure that the monomer binds to the correct atom. This is achieved with protecting groups, which are functional groups that are not reactive during one or more steps of the synthesis. The binding site is restored, or deprotected, by treating the molecule with specific reagents to convert the protecting group to a reactive functional group.

To begin solid-phase synthesis, the starting material is bound to a specially designed resin or insoluble polymer at its only available binding site. Then, the bound starting material is deprotected to allow binding of the second monomer in the chain. Next, a solution of the second monomer in the chain is added, along with a coupling agent to facilitate bonding between the monomers.

Once the second monomer binds to the starting material, the resulting dimeric intermediate product is deprotected. This process is repeated until the target oligomer or polymer has formed. The product is cleaved from the solid support into solution, from which it can be purified, isolated, and analyzed.

Solid phase synthesis is often used for the synthesis of peptides, which are chains of amino acids. Amino acids have an amine group, a carboxyl group, and a substituent, or ‘side chain’. The amine is initially protected. Once deprotected, the amine forms a peptide bond with the carboxyl group of the next amino acid.

Now that you understand the principles of solid phase synthesis, let’s go through a procedure for solid phase peptide synthesis, in which we will demonstrate the addition of the first two amino acids.

To begin the procedure, connect a receiving flask for waste to a 100-mL manual peptide synthesis vessel. Then place 0.360 g of 2-chlorotrityl chloride resin into the vessel. Connect a nitrogen gas line to the vessel sidearm and a vacuum line to the serrated hose adapter.

Add 20 mL of dimethylformamide to the resin and allow the resin beads to swell for 30 min under a flow of nitrogen gas. Then, apply vacuum to drain the solvent.

Add 10 mL of DMF, 1.6 mmol of an Fmoc-protected amino acid, and 2.5 mL of N,N-diisopropylethylamine to the vessel. Bubble under the nitrogen gas, which mixes the solution, for 15 min to load the protected amino acid onto the resin.

Remove the solvent under vacuum and perform a second loading. After removing the solvent, agitate the loaded resin beads three times in 10-mL portions of DMF, draining each wash into the receiving flask.

Next, add to the loaded beads 10 mL of a 20% solution of 4-methylpiperidine in DMF. Bubble the mixture for 15 min to remove the Fmoc group.

Drain the solvent and repeat the deprotection procedure. Wash and drain the loaded resin three times, as before. Store the beads under solvent until they are ready for the next step.

To verify that the loaded compound was completely deprotected, first place 1 to 2 drops of each Kaiser test solution in two test tubes.

Place a few loaded beads in a test tube and heat both tubes to 110 degrees in an oil bath. Deprotection is complete if the resin mixture turns dark blue to purple, indicating the presence of amine groups in the mixture.

To begin the coupling step, first wash the beads with 10 mL of NMP under a flow of N2 gas.

Then, add 10 mL of NMP, 1.6 mmol of the next Fmoc-protected amino acid, 1.6 mmol of the coupling agent HBTU, and 2.5 mL of DIPEA to the loaded resin.

Bubble N2 gas through the resin mixture for 30 minutes, and then drain the solvent. Wash and drain the beads with 10-mL portions of DMF three times, as before.

Repeat the Kaiser test. Coupling has occurred successfully if the beads and solution turn yellow, indicating that no amine groups are present.

Next, cleave the new Fmoc group with 20% 4-methylpiperidine in DMF and wash the beads with 10-mL portions of DMF. Repeat the coupling and deprotection for each remaining amino acid in the target peptide.

After the last amino acid has been deprotected and the resin beads have been washed, add 40 mL of peptide cleavage solution to separate the peptide product from the resin.

Bubble nitrogen gas through the resin mixture for 3 h, and then replace the receiving flask. Transfer the solution from the resin mixture to the new receiving flask under vacuum.

To generate the final product, remove the solvent with a rotary evaporator.

Solid phase synthesis is widely used in biology and chemistry. Let’s look at a few examples.

Solid-phase synthesis opened many new synthetic pathways to oligosaccharides, which are short chains of simple sugar monomers with important biological roles, such as energy storage. Unlike peptide bonds, each bond between sugars contains a stereocenter. To synthesize an oligosaccharide, not only must the monomers be in the correct order, but the bonds must also have the correct stereochemistry. Solid-phase synthesis techniques were developed to couple each monomer by a highly stereoselective process, which today is sufficiently refined to be automated.

Solid-phase synthesis is a common approach to combinatorial chemistry, which is the practice of synthesizing many variants of a compound in a single synthetic process. The loaded resin can easily be split into portions to react with different monomers or molecules. After each reaction, the portions are washed and recombined. This is repeated until the desired number of products has been generated. This technique is particularly useful in pharmaceutical research, as it can be used to generate new compounds or to evaluate the reactivity of a compound with a wide array of molecules.

You’ve just watched JoVE’s introduction to solid phase synthesis. You should now understand the underlying principles of solid phase synthesis, the procedure for solid phase peptide synthesis, and a few examples of how solid phase synthesis is used in organic chemistry. Thanks for watching!

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