5.10: Sintesi in fase solida

1. Caricamento della resina

1. In un recipiente di sintesi peptidica da 100 ml, aggiungere resina di cloruro di 2-clorotrityl (CTC) (1,1 mmol / g, 0,360 g, 0,400 mmol). Aggiungere 20 mL DMF e lasciarli gonfiare per 30 minuti sotto N_2.
2. Scolare le perle sotto vuoto e aggiungere 10 mL di DMF.
3. Aggiungere 500 mg di Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) e 2,5 mL i-Pr₂EtN e mescolare sotto N₂ per 15 minuti.
4. Scaricare il solvente sotto vuoto e ripetere il caricamento con Fmoc-Ala-OH per 15 min.
5. Scaricare il solvente sotto vuoto e lavare le perle con 10 ml DMFunder N₂e scaricare sotto vuoto 3x.

2. Deprotezione del Gruppo Fmoc

1. Aggiungere 10 mL 20% 4-metilpiperidina in DMF e mescolare le perle sotto N₂ per 15 min.
2. Scaricare il solvente sotto vuoto e ripetere la deprotezione.
3. Lavare le perle con 10 mL DMF sotto N₂ e scolare sotto vuoto 3x.

3. Esecuzione del Kaiser Test

1. Eseguire il test Kaiser aggiungendo 1-2 gocce di soluzione A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL piridina), soluzione B (1 g ninidrina, 20 mL n-butanolo) e soluzione C (20 g fenolo, 10 ml n-butanolo)ciascuna in due provette. Una provetta sarà il controllo mentre l'altra monitorerà la reazione.
2. Aggiungere alcune pere di resina dal recipiente di reazione alla provetta di reazione e riscaldare le due provette a 110 °C.
3. Se la deprotezione è completa, il contenuto della provetta diventerà di un colore blu scuro/viola. Se la deprotezione è incompleta o non riuscita, la soluzione rimarrà gialla. Confrontare la provetta di reazione con la provetta di controllo.

4. Accoppiamento dei prossimi elementi costitutivi

1. Scaricare il solvente sotto vuoto.
2. Lavare le perle con 10 ml di N-metil-2-pirrolidone sotto N₂ e scaricare il solvente sotto vuoto.
3. Per iniziare l'accoppiamento successivo, aggiungere 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) e 2,5 mLi-Pr₂EtN e lasciare bollire la resina sotto N₂ per 30 minuti.
4. Scaricare il solvente sotto vuoto.
5. Lavare le perle con 10 mL DMF sotto N₂ e scolare sotto vuoto 3x.
6. Eseguire il test Kaiser (vedere i passaggi 3.1-3.3) per cercare il completamento dell'accoppiamento. Le pere e la soluzione nella provetta devono essere gialle.

5. Scindere il peptide dalla resina

1. Scindere il gruppo Fmoc rimanente utilizzando i passaggi 2.1-2.3.
2. Dopo che il solvente è stato drenato sotto vuoto, aggiungere 40 mL di soluzione di scissione (95% TFA, 2,5% H₂O, 2,5% TIPS) alla resina e bolle sotto N₂ per 3 ore.
3. Posizionare un nuovo pallone ricevente sul sintetizzatore peptidico e scolare la soluzione di FIA contenente il peptide desiderato sotto vuoto nel nuovo matraccio.

6. Precipitazione e I solazione del peptide

1. Separare la soluzione di TFA in 4 flaconcini conici e aggiungere 25 mL di etere freddo (-20 °C) a ciascun flaconcino per precipitare il peptide.
2. Centrifugare i flaconcini (3.000 giri/min, 0-4 °C) per 20 min. Decantare il TFA rimanente e la soluzione di etere dalle fiale coniche e concentrare il precipitato peptidico per consentire il dipeptide desiderato come solido bianco.

La sintesi in fase solida è un metodo in cui il prodotto viene sintetizzato mentre è legato a un materiale insolubile.

La sintesi in fase solida viene spesso utilizzata per produrre oligomeri biologici e polimeri come peptidi, acidi nucleici e oligosaccaridi. Queste molecole sono composte da catene di subunità molecolari più piccole, chiamate monomeri. La sintesi di un oligomero o di un polimero richiede molti passaggi, poiché i monomeri devono essere aggiunti nell'ordine corretto.

Un problema con le sintesi multi-step è che la purificazione e l'isolamento dei prodotti stabili di ogni fase, chiamati prodotti intermedi, diminuisce la resa complessiva. Nella sintesi in fase solida, il prodotto intermedio rimane legato al supporto solido per tutta la durata della sintesi. Ciò consente di lavare via i reagenti in fase di soluzione, i solventi e i sottoprodotti, eliminando la necessità di purificare e isolare ogni prodotto intermedio tra le fasi.

Questo video illustrerà la procedura per la sintesi di peptidi in fase solida e introdurrà alcune applicazioni della sintesi in fase solida in chimica.

Nella sintesi in fase solida, una molecola viene sintetizzata su un supporto solido in una sequenza di reazioni. Ad esempio, un oligomero o un polimero verrà sintetizzato un monomero alla volta per formare il prodotto finale. L'oligomero o il polimero in crescita rimane fortemente legato al supporto solido fino a quando non viene separato, o scisso, dal supporto con i reagenti.

Ogni monomero deve avere almeno due siti di legame per far parte della catena polimerica, ma può essere disponibile un solo sito di legame alla volta per garantire che il monomero si leghi all'atomo corretto. Ciò si ottiene con i gruppi protettivi, che sono gruppi funzionali che non sono reattivi durante una o più fasi della sintesi. Il sito di legame viene ripristinato, o deprotetto, trattando la molecola con reagenti specifici per convertire il gruppo protettivo in un gruppo funzionale reattivo.

Per iniziare la sintesi in fase solida, il materiale di partenza è legato a una resina appositamente progettata o a un polimero insolubile nell'unico sito di legame disponibile. Quindi, il materiale di partenza legato viene deprotetto per consentire il legame del secondo monomero nella catena. Successivamente, viene aggiunta una soluzione del secondo monomero nella catena, insieme a un agente di accoppiamento per facilitare il legame tra i monomeri.

Una volta che il secondo monomero si lega al materiale di partenza, il prodotto intermedio dimerico risultante viene deprotetto. Questo processo viene ripetuto fino a quando non si è formato l'oligomero o il polimero bersaglio. Il prodotto viene scisso dal supporto solido in una soluzione, da cui può essere purificato, isolato e analizzato.

La sintesi in fase solida viene spesso utilizzata per la sintesi di peptidi, che sono catene di amminoacidi. Gli amminoacidi hanno un gruppo amminico, un gruppo carbossilico e un sostituente, o "catena laterale". L'ammina è inizialmente protetta. Una volta deprotetta, l'ammina forma un legame peptidico con il gruppo carbossilico dell'amminoacido successivo.

Ora che hai compreso i principi della sintesi in fase solida, esaminiamo una procedura per la sintesi di peptidi in fase solida, in cui dimostreremo l'aggiunta dei primi due amminoacidi.

Per iniziare la procedura, collegare un pallone di ricezione dei rifiuti a un recipiente manuale di sintesi peptidica da 100 ml. Quindi inserire 0,360 g di resina di cloruro di 2-clorotritile nel recipiente. Collegare una linea del gas di azoto al braccio laterale del serbatoio e una linea del vuoto all'adattatore del tubo seghettato.

Aggiungere 20 mL di dimetilformammide alla resina e lasciare che le perle di resina si gonfino per 30 minuti sotto un flusso di azoto gassoso. Quindi, applicare il vuoto per drenare il solvente.

Aggiungere 10 mL di DMF, 1,6 mmol di un amminoacido protetto da Fmoc e 2,5 mL di N,N-diisopropiletilamina al recipiente. Far bollire sotto l'azoto gassoso, che mescola la soluzione, per 15 minuti per caricare l'amminoacido protetto sulla resina.

Rimuovere il solvente sotto vuoto ed eseguire un secondo caricamento. Dopo aver rimosso il solvente, agitare tre volte le perle di resina caricate in porzioni da 10 ml di DMF, drenando ogni lavaggio nel pallone di ricezione.

Quindi, aggiungere alle perle caricate 10 mL di una soluzione al 20% di 4-metilpiperidina in DMF. Fate bollire il composto per 15 min per eliminare il gruppo Fmoc.

Scolare il solvente e ripetere la procedura di deprotezione. Lavare e scolare la resina caricata tre volte, come prima. Conservare le perle sotto solvente fino a quando non sono pronte per il passaggio successivo.

Per verificare che il composto caricato fosse completamente deprotetto, posizionare prima da 1 a 2 gocce di ciascuna soluzione di test Kaiser in due provette.

Metti alcune perle cariche in una provetta e riscalda entrambe le provette a 110 gradi in un bagno d'olio. La deprotezione è completa se la miscela di resina diventa da blu scuro a viola, indicando la presenza di gruppi amminici nella miscela.

Per iniziare la fase di accoppiamento, lavare prima le perle con 10 mL di NMP sotto un flusso di gas N2.

Quindi, aggiungere 10 mL di NMP, 1,6 mmol del successivo amminoacido protetto da Fmoc, 1,6 mmol dell'agente di accoppiamento HBTU e 2,5 mL di DIPEA alla resina caricata.

Far bollire il gas N2 attraverso la miscela di resina per 30 minuti, quindi scaricare il solvente. Lavare e scolare le perle con porzioni da 10 ml di DMF tre volte, come prima.

Ripeti il test di Kaiser. L'accoppiamento è avvenuto con successo se le perle e la soluzione diventano gialle, indicando che non sono presenti gruppi amminici.

Successivamente, scindere il nuovo gruppo Fmoc con il 20% di 4-metilpiperidina in DMF e lavare le perle con porzioni da 10 ml di DMF. Ripetere l'accoppiamento e la deprotezione per ogni amminoacido rimanente nel peptide bersaglio.

Dopo che l'ultimo amminoacido è stato deprotetto e le perle di resina sono state lavate, aggiungere 40 ml di soluzione di scissione peptidica per separare il prodotto peptidico dalla resina.

Far bollire l'azoto gassoso attraverso la miscela di resina per 3 ore, quindi sostituire il pallone di ricezione. Trasferire la soluzione dalla miscela di resina al nuovo pallone ricevente sotto vuoto.

Per generare il prodotto finale, rimuovere il solvente con un evaporatore rotante.

La sintesi in fase solida è ampiamente utilizzata in biologia e chimica. Diamo un'occhiata ad alcuni esempi.

La sintesi in fase solida ha aperto molte nuove vie sintetiche per gli oligosaccaridi, che sono catene corte di monomeri di zucchero semplici con importanti ruoli biologici, come l'accumulo di energia. A differenza dei legami peptidici, ogni legame tra gli zuccheri contiene uno stereocentro. Per sintetizzare un oligosaccaride, non solo i monomeri devono essere nell'ordine corretto, ma anche i legami devono avere la stereochimica corretta. Sono state sviluppate tecniche di sintesi in fase solida per accoppiare ciascun monomero mediante un processo altamente stereoselettivo, che oggi è sufficientemente raffinato per essere automatizzato.

La sintesi in fase solida è un approccio comune alla chimica combinatoria, che consiste nella pratica di sintetizzare molte varianti di un composto in un unico processo sintetico. La resina caricata può essere facilmente divisa in porzioni per reagire con diversi monomeri o molecole. Dopo ogni reazione, le porzioni vengono lavate e ricombinate. Questa operazione viene ripetuta fino a quando non viene generato il numero di prodotti desiderato. Questa tecnica è particolarmente utile nella ricerca farmaceutica, in quanto può essere utilizzata per generare nuovi composti o per valutare la reattività di un composto con un'ampia gamma di molecole.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla sintesi in fase solida. A questo punto dovresti comprendere i principi alla base della sintesi in fase solida, la procedura per la sintesi di peptidi in fase solida e alcuni esempi di come la sintesi in fase solida viene utilizzata in chimica organica. Grazie per l'attenzione!