Modello murino di ischemia degli arti posteriori

Negli Stati Uniti l'arteriopatia periferica colpisce in particolare circa 10 milioni di individui, fumatori, diabetici e persone di età superiore ai 70 anni. L'obiettivo generale di questo intervento chirurgico è indurre l'ischemia degli arti posteriori legando i segmenti prossimale e distale dell'arteria femorale. La procedura inizia con l'anestetizzazione, la rasatura e il posizionamento del mouse sul tavolo operatorio in posizione supina.

Quindi viene praticata un'incisione della pelle dal ginocchio verso la coscia mediale, esponendo l'arteria femorale sottostante. Successivamente, l'arteria femorale viene accuratamente separata dalla vena femorale. I doppi nodi vengono eseguiti sia nel sito di legatura distale che nel sito di legatura prossimale.

Il segmento dell'arteria femorale viene quindi asportato. Il sito di incisione viene chiuso da punti di sutura e l'animale può riprendersi dall'anestesia. Per confermare l'induzione dell'ischemia degli arti posteriori, il topo anestetizzato viene posto in posizione supina.

Quindi entrambi gli arti posteriori vengono scansionati dal laser doppler. L'immagine viene quindi salvata e valutata per la perfusione. Ciao, sono John Cook.

Sono professore di medicina qui nella divisione di medicina cardiovascolare dell'Università di Stanford. Il nostro laboratorio si interessa di angiogenesi e rigenerazione vascolare. In questo video, due dei miei borsisti post-dottorato, il Dr.Nan Wong e Hir Niyama, vi presenteranno il preparato per l'ischemia degli arti posteriori di Muren, che è un modello importante per l'arteriopatia periferica e frequentemente utilizzato nel nostro laboratorio per valutare gli effetti dei fattori di crescita e della terapia cellulare sull'angiogenesi.

Utilizziamo queste procedure nel nostro laboratorio per studiare l'effetto delle cellule endoteliali derivate da cellule staminali per la riparazione vascolare. Quindi iniziamo. Gli strumenti chirurgici necessari per questa operazione includono pinze a punta fine, pinze a punta, forbici a molla, forbici chirurgiche, portaaghi e divaricatore.

Realizziamo il nostro divaricatore utilizzando una graffetta perché è più piccola di quella disponibile in commercio. Per questo intervento saranno necessari anche divaricatori che sterilizzano questi strumenti prima dell'intervento chirurgico con uno sterilizzatore a cordone caldo, uno strumento di cauterizzazione e tamponi di cotone sterili a punta fine. Quando gli strumenti sono pronti, posizionare il mouse nella camera di induzione dell'anestesia contenente dall'uno al 3% di isofluoro in cento per cento di ossigeno a una velocità di flusso di un litro al minuto.

Lasciare il mouse nella camera di induzione fino a quando non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione. Quindi posizionare l'animale in posizione supina sul tavolo preoperatorio e collegarlo a un flusso continuo di isoflurano.

Utilizzando un rasoio elettrico, rimuovere i peli dall'arto posteriore. Applicare la crema depilatoria per rimuovere completamente i peli. Dopo aver rasato il topo, estendere e fissare l'arto posteriore con un pezzo di nastro adesivo.

Una volta che l'arto posteriore è sicuro, pulire la pelle con tre scrub alternati a Betadine e alcol. Utilizzando una pinza sottile e forbici chirurgiche, praticare un'incisione della pelle lunga circa un centimetro dal ginocchio verso la coscia mediale utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato. PBS tamponi di cotone a punta umidi e definiti.

Spazzolare delicatamente il tessuto adiposo sottocutaneo che circonda il muscolo della coscia. Successivamente, applicare il cautere trasversalmente alle dimensioni e sezionare il tessuto adiposo sottocutaneo per rivelare l'arteria femorale sottostante. Successivamente, utilizzare un divaricatore per aprire la ferita e ottenere una visione migliore del sistema vascolare degli arti inferiori.

Usando una pinza fine in un batuffolo di cotone appuntito fine, perforato delicatamente attraverso la guaina femorale membranosa per esporre il fascio neurovascolare. Quindi, utilizzando una pinza fine e un batuffolo di cotone, sezionare e separare l'arteria femorale dalla vena femorale e dal nervo nella posizione prossimale vicino all'inguine. Dopo la dissezione, passare un filo di sutura di seta a sette oh sotto l'estremità prossimale dell'arteria femorale.

Occludere l'arteria femorale prossimale utilizzando doppi nodi. Posizionare la cravatta sul vaso il più prossimale possibile nella ferita in modo da lasciare la lunghezza per la seconda legatura e un segmento intermedio che verrà sezionato. Separare l'arteria femorale dalla vena femorale nella posizione distale vicino al ginocchio.

Passare un filamento di sette oh sutura sotto l'estremità distale dell'arteria femorale prossimale all'arteria poplitea. Occludi il vaso usando doppi nodi. Occludere l'arteria femorale distale con una seconda serie di doppi nodi appena prossimali alla prima serie di nodi.

Questa seconda serie di suture verrà utilizzata per afferrare l'arteria durante la procedura di transazione. Allo stesso modo, per scopi di presa, occludere l'arteria fale prossimale con la seconda serie di doppi nodi appena distalmente alla prima serie di nodi. Sezionare il segmento dell'arteria femorale tra i nodi distale e prossimale con un batuffolo di cotone a punta fine e un paio di forbici a molla.

Prestare attenzione a non perforare la parete della vena femorale. Rimuovere il divaricatore e chiudere l'incisione utilizzando cinque suture oh chili. Una volta chiusa l'incisione, rimettere l'animale nella gabbia di recupero e monitorare fino al risveglio Dopo che l'animale si è ripreso per un'ora, procedere con la perfusione sanguigna laser doppler.

Passaggio per confermare l'induzione dell'ischemia. Per iniziare la fase di perfusione laser doppler, posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia contenente dall'uno al 3% di isofluoro in cento percento di ossigeno a una velocità di flusso di un litro al minuto. Lasciare il mouse nella camera di induzione fino a quando non risponde agli stimoli esterni.

Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione e posizionarlo sul tavolo preoperatorio collegato a un flusso continuo di fluoro. Quindi rimuovere i peli dall'arto posteriore utilizzando un rasoio elettrico seguito da una crema depilatoria se necessario. Dopo aver rimosso i peli, posizionare l'animale su una superficie riscaldata a 37 gradi Celsius per cinque minuti sotto un flusso continuo di isofluoro.

Dopo cinque minuti, posizionare l'animale in posizione supina su una superficie che assorba la luce non riflettente, come un panno di colore verde collegato a un flusso continuo di isofluoro. Estendi gli arti posteriori. Quindi, accendi l'imager laser doppler e il software di acquisizione e inizializza il software.

Specificare le dimensioni del campo visivo e la risoluzione. È meglio mantenere il campo visivo e la densità dei pixel coerenti tra gli animali. Per semplificare l'analisi futura, aprire un nuovo file.

Premere start per iniziare ad acquisire i dati dell'immagine. Quando richiesto, specificare la distanza dell'animale dalla termocamera. Il laser mostrerà i bordi del campo visivo e quindi inizierà ad acquisire i dati.

Al termine dell'acquisizione, l'immagine inizierà a mostrare una gamma di colori indicativi del livello di profusione sanguigna alle gambe. I colori possono essere impostati su un intervallo di profusione specifico. Per confrontare meglio i dati tra gli animali al termine dell'acquisizione dei dati, salvare il file, quindi riportare l'animale nella gabbia di recupero e monitorare continuamente l'animale fino al risveglio.

Per analizzare i dati, utilizzare la regolazione della soglia nel software di analisi per sottrarre eventuali rumori di fondo. Una soglia di 0,2 è solitamente un valore ragionevole. Seleziona due regioni di interesse o ROI che coprono ciascuna area degli arti posteriori.

Una varietà di punti di riferimento può essere utilizzata per standardizzare il ROI tra arti e animali, quindi determinare la perfusione media e la variabilità del ROI. La differenza di perfusione e il rapporto di perfusione tra l'arto ischemico e l'arto di controllo possono quindi essere facilmente determinati. Questa procedura può essere ripetuta per seguire i cambiamenti nella perfusione degli arti posteriori.

Nel tempo, in un momento desiderato, l'animale può essere soppresso per la valutazione della funzione dei tessuti. Rispetto ai dati dell'immagine di perfusione, qui viene mostrato un diagramma rappresentativo dell'arto posteriore dopo la spiegazione dell'arteria femorale. Le suture segnano le posizioni dei siti di legatura prossimale e distale.

Quando l'intervento viene eseguito con attenzione, il sanguinamento è minimo e l'intervento può essere completato in meno di un'ora. Ed ecco i risultati dell'analisi delle immagini di perfusione laser doppler. L'immagine a sinistra mostra la profusione di entrambi gli arti prima dell'induzione ischemica.

Mentre l'immagine a destra mostra la profusione di entrambi gli arti. Dopo che l'arto sinistro ha subito l'induzione ischemica. L'intensità del colore nell'immagine indica la quantità di flusso sanguigno.

Rispetto all'arto di controllo, l'arto ischemico mostra pochissimo colore, il che suggerisce una drastica riduzione del flusso sanguigno. Utilizzando questi dati, il software è in grado di quantificare la perfusione media nell'arto ischemico e di controllo per determinare la differenza di perfusione e il rapporto di perfusione. Pertanto, questi risultati confermano l'induzione dell'ischemia all'arto posteriore.

Vi abbiamo appena mostrato come indurre l'ischemia unilaterale degli arti posteriori nel modello murino e confermare l'induzione dell'ischemia mediante profusione di sangue laser Doppler. Il modello di ischemia dell'arto posteriore con analisi di imaging laser doppler è un ottimo sistema per lo studio delle patologie vascolari e per la valutazione dei candidati terapeutici. Questa procedura può essere seguita dal trapianto e dal tracciamento non invasivo delle cellule, come dimostrato in un altro video jve di Huang et al.

Quando si eseguono queste procedure, è importante ricordare di prestare attenzione a non perforare la parete della vena femorale quando si asporta l'arteria femorale con le forbici da distorsione. Utilizzare anche un sito di legatura simile per tutti gli animali nell'esperimento per coerenza del modello ad alta ischemia. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.