Fabbricazione di elettrodi amperometrici

Questo protocollo descrive come generare elettrodi in fibra di carbonio. Per prima cosa, riempiremo le capillari di vetro con fibre di carbonio da cui è stato rimosso il sizing. Successivamente, trarremo l'insieme capillare in fibre in due elettrodi e taglieremo la fibra.

Successivamente disporremo gli elettrodi in modo che siano immersi nell'epossidico. Per sigillare la fibra nell'elettrodo, conserveremo gli elettrodi a fibra su un supporto in un forno caldo. Questi elettrodi vengono successivamente utilizzati per rilevare il rilascio di catecolammine dalle vescicole in singole cellule mediante fibra di carbonio e barometria.

Le registrazioni di successo mostrano un rumore ridotto e picchi ascendenti ben distinti sul tracciato registrato. Salve, sono Carrie Pike del laboratorio della dottoressa Amy Harkins del Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Fisiologiche presso la Scuola di Medicina dell'Università di St. Louis. Vi mostrerò una procedura per la produzione di elettrodi in fibra di carbonio a basso rumore, da utilizzare in pirometria per misurare il rilascio di catecolammine da singole cellule.

Iniziamo preparando le fibre di carbonio per la realizzazione degli elettrodi. Per prima cosa, tagliare un fascio di fibre di carbonio a una lunghezza pari a circa 1,25 volte la lunghezza della pipetta capillare nella cappa chimica. Rimuovere il trattamento superficiale facendo bollire circa 100 millilitri di acetone in un contenitore e aggiungendo le fibre nell'acetone bollente per 30 minuti o più.

Dopo l'ebollizione, rimuovere le fibre dall'acetone riscaldato e trasferirle in un becher pulito contenente da 50 a cento millilitri di acetone fresco. Trasferire nuovamente le fibre sulla carta d'alluminio, che può essere portata fuori dalla cappa. Far asciugare le fibre posizionando il fascio su una piastra di Petri aperta da 150 millimetri e lasciandole asciugare all'aria tutta la notte.

Ora che le fibre di carbonio sono pronte, procedere alla preparazione dei tubi capillari di vetro per lucidarli a fiamma. Utilizzare tubi capillari di vetro microematocrito, lunghi 7,5 centimetri con un diametro esterno di 1,5 millimetri e un diametro interno di 1,3 millimetri. Tenere il tubo al centro ed esporne un'estremità alla fiamma.

Ruotare il tubo circa tre volte mentre si trova nella fiamma. Capovolgere il tubo e inserire l'estremità opposta nella fiamma, quindi ruotare nuovamente per tre volte. Entrambe le estremità del tubo capillare sono ora state lucidate con la fiamma.

Posizionare i tubi a fuoco lucidato in una capsula di vetro e trasferirli in forno fino al momento in cui dovranno essere riempiti con le fibre di carbonio. Prima di iniziare a infilare una fibra di carbonio in un tubo capillare, assicurarsi di indossare una maschera protettiva per il viso. Quindi utilizzare un tubo di plastica collegato a un vuoto con filtro per aspirare la fibra all'interno del tubo di vetro.

Successivamente, tagliare la fibra utilizzando un bisturi. Assicurarsi di lasciare un quarto di pollice di fibra sporgente da entrambe le estremità del tubo. La fibra di carbonio filettata è ora pronta per essere tirata al fine di formare l'elettrodo in fibra per pipetta.

Inserire il tubo capillare nell'elettrodo polare e stringere le manopole per fissare il tubo capillare in posizione. Successivamente, impostare il polarizzatore alle condizioni ottimali e azionare gli interruttori per eseguire due poli. Una volta che la pipetta è stata tirata a metà, separare le due metà tagliando la fibra nuda al centro.

Utilizzando delle forbici, rimuovere ciascuna metà dell'elettrodo e tirare sulla fibra sporgente per rompere il sigillo di vetro. Tagliare la fibra con le forbici in modo che rimanga fuori dal tubo solo un ottavo di pollice di fibra.

Ripetere questi passaggi fino a ottenere circa 16 elettrodi. Gli elettrodi in fibra vengono tirati prima di procedere a sigillarli per creare il sigillo in vetro epossidico. Prima, riscaldare un'aliquote preconfezionata di resina epossidica su un piastra riscaldante impostata a 55 gradi Celsius per sei minuti in una cappa da laboratorio; mentre l'epossidico si riscalda, avvolgere circa 16 degli elettrodi tirati in un fascio.

Dopo aver riscaldato l'epossidico per sei minuti, aggiungere 0,7 grammi di indurente all'epossidico caldo utilizzando del nastro. Mescolare agitando il vial. Immergere il fascio di elettrodi nella soluzione di epossidico caldo più indurente.

Inserire il fascio due volte, per circa cinque secondi ogni volta, in modo che una quantità sufficiente di epossidica penetri nelle punte di vetro per azione capillare. Separare il fascio e posizionare gli elettrodi su un supporto di cartone dotato di fessure. Collocare questo vassoio in un forno impostato a 100 gradi Fahrenheit.

Dopo almeno 48 ore, esaminare ogni elettrodo al microscopio stereoscopico. Scartare gli elettrodi che non si sono riempiti di resina epossidica. Avere una punta schiacciata.

Hanno più di una fibra o non possono essere utilizzati per altri motivi. Dopo aver ispezionato ciascun elettrodo, riposizionarli sul supporto di cartone e riportarli nel forno. Gli elettrodi sono generalmente utilizzabili per circa un mese dopo la fabbricazione e richiedono il taglio della fibra di carbonio prima dell'uso nella pirometria su una cella.

Per tagliare la fibra di carbonio, posizionare con attenzione l'elettrodo in fibra di carbonio su un vetrino coperto con nastro in teflon. Osservare la punta al microscopio stereoscopico. Successivamente, utilizzare una lama pulita di bisturi per effettuare un taglio perpendicolare alla fibra di carbonio, in modo da ottenere una superficie piatta e pulita, necessaria per appoggiare la fibra di carbonio contro una cellula.

Immediatamente prima delle registrazioni, riempire la capillare con cloruro di potassio 3 M utilizzando una siringa di riempimento e assicurarsi di asciugare l'estremità opposta alla fibra per rimuovere l'eccesso di sale.

Posizionare l'elettrodo sul pellet di argento, cloruro d'argento del supporto dell'elettrodo. Collegare elettricamente alla piattaforma del capo della pirorometria. Stringere il supporto dell'elettrodo per mantenere stabile l'elettrodo.

Posizionare l'elettrodo adiacente alla cellula e procedere alla registrazione degli eventi metrici RO. Questo protocollo descrive come generare e tagliare gli elettrodi tric. Durante le registrazioni tric, un elettrodo in fibra di carbonio viene appoggiato sulla superficie di una cellula secretoria.

L'attività esocitotica viene osservata come picchi tric, che indicano la corrente elettrochimica causata dal trasferimento di elettroni dopo l'ossidazione delle catecolamine. Con la pratica nella realizzazione e nel taglio degli elettrodi EmPro metrici, i livelli di rumore possono essere notevolmente migliorati rispetto a molti degli elettrodi disponibili in commercio. Vi ho appena mostrato come fabbricare elettrodi in fibra di carbonio parametrici durante l'esecuzione di questa procedura.

È importante prestare molta attenzione ai dettagli del protocollo per ottenere elettrodi consistenti e a basso rumore. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.