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La microscopia elettronica a scansione, o SEM, viene spesso utilizzata per visualizzare materiali biologici su scala nanometrica. I microscopi ottici, che utilizzano la luce per visualizzare un campione, sono ampiamente utilizzati per visualizzare in modo non distruttivo campioni biologici, tuttavia, la loro risoluzione e profondità di campo è limitata, quindi il SEM viene utilizzato per ottenere una risoluzione più elevata fino a un nanometro.
Nel SEM, un fascio di elettroni viene focalizzato attraverso una serie di lenti a condensatore, che poi colpisce il campione. Quando il raggio colpisce il campione, gli elettroni sulla superficie vengono dispersi e misurati dal rivelatore.
In questo video, discuteremo come funziona il SEM, dimostreremo come visualizzare un campione biologico in laboratorio e, infine, introdurremo alcune tecniche utilizzate per visualizzare campioni sensibili.
Un microscopio elettronico a scansione utilizza un fascio di elettroni ad alta energia, generato da un cannone elettronico dotato di un catodo a filamento. Gli elettroni generati vengono spinti verso l'anodo e quindi focalizzati utilizzando lenti a condensatore prima di entrare nella lente dell'obiettivo. La lente dell'obiettivo è calibrata per focalizzare il raggio sul campione, dove viene scansionato raster su tutta la superficie. Le interazioni degli elettroni con gli atomi nel campione vengono utilizzate per studiare la topografia, la composizione elementare e la cristallinità del campione. Quando il fascio di elettroni incidente colpisce la superficie, emette elettroni secondari e retrodiffusi. Gli elettroni secondari sono elettroni a bassa energia che vengono emessi dal campione vicino alla superficie e forniscono informazioni topografiche.
Gli elettroni retrodiffusi, d'altra parte, vengono riflessi nella direzione opposta al raggio incidente. L'intensità dell'interazione aumenta con l'aumentare del peso atomico, consentendo all'utente di distinguere le differenze composizionali. È necessaria un'attenzione particolare per l'imaging dei campioni biologici con il SEM, poiché il SEM utilizza un alto vuoto, quindi i campioni biologici, che in genere hanno un alto contenuto di acqua, devono essere prima essiccati. Ciò può causare il collasso della struttura dei campioni sensibili, in particolare delle cellule. Pertanto, le cellule vengono trattate con un fissativo, risciacquate e quindi disidratate lentamente lavandole con quantità crescenti di etanolo.
Per i materiali biologici rigidi, come l'impalcatura tissutale di collagene-idrossiapatite utilizzata in questa dimostrazione, il campione viene essiccato per un periodo di diversi giorni sotto vuoto spinto.
Infine, poiché l'imaging SEM tipico richiede una superficie conduttiva, i campioni biologici vengono spesso rivestiti con un sottile strato di metallo prima dell'imaging. Ora che abbiamo discusso di come funziona il SEM e di come preparare un campione biologico per l'imaging, diamo un'occhiata a come preparare e visualizzare un'impalcatura tissutale di collagene-idrossiapatite.
Innanzitutto, montare il campione di biomateriale su uno stub SEM utilizzando nastro di carbonio conduttivo e assicurarsi che il campione sia asciutto e non presenti contaminazioni sulla superficie.
Quindi, posizionare il campione montato nella camera di un rivestimento sputter, pompare la camera e rivestire il campione per circa 40 secondi per ottenere un rivestimento sottile, spesso da quattro a sei nanometri, di metallo, in questo caso oro, con una copertura adeguata. Una volta rivestito, rimuovere il campione e utilizzare del nastro conduttivo per collegare il tronchetto alla parte superiore del campione, che ora è rivestito di metallo conduttivo.
Infine, montare il tronchetto sul tavolino SEM e serrare la vite sul lato. Ora il campione è pronto per l'immagine con SEM. Per prima cosa, caricare lo stadio nella camera SEM e sigillare la porta, quindi premere il pulsante di trasferimento per aprire il passaggio dalla camera di carico al vuoto. Una volta aperta la porta interna, avvitare l'asta di metallo nel tavolino e spingere il campione nella camera a vuoto, quindi svitare l'asta di metallo e ritrarla completamente nella camera di carico, quindi premere store per chiudere la camera a vuoto.
Ora immaginiamo il campione usando SEM.
Per prima cosa, muovi il tavolino usando il controller e guida il campione nel campo visivo, quindi muovi il campione verticalmente fino a quando la distanza di lavoro è compresa tra cinque e 10 millimetri. Accendere il fascio di elettroni e selezionare il rivelatore per gli elettroni secondari, impostare inizialmente il fascio a cinque kiloelettronvolt, quindi aumentare fino a 20-30 kiloelettronvolt secondo necessità. Se l'immagine non è nitida, ruotare le manopole di messa a fuoco, luminosità e contrasto finché non viene visualizzata un'immagine nitida.
Utilizzare la navigazione del tavolino e le direzioni X e Y per individuare un nuovo punto sul campione, quindi aumentare l'ingrandimento fino a quando le caratteristiche desiderate non sono visibili. Regolare la messa a fuoco, il contrasto e la luminosità secondo necessità per migliorare la qualità dell'immagine. Potrebbe essere necessario ridurre la velocità di scansione e attivare la media lineare per acquisire un'immagine migliore, quindi salvare l'immagine.
Le immagini SEM rivelano una struttura altamente tridimensionale e porosa con caratteristiche fibrose inferiori a 25 micron. Queste caratteristiche sarebbero difficili da visualizzare utilizzando la microscopia ottica, poiché la microscopia ottica ha una profondità di campo molto più bassa.
Ci sono molte sfide associate all'imaging di strutture biologiche con SEM, tra cui il collasso della struttura o il danneggiamento del fascio di elettroni ad alta energia. Diamo ora un'occhiata a come la tecnica generale del SEM viene applicata a questi tipi di campioni sensibili. Le strutture biologiche delicate, come questi giovani tessuti vegetali, o quelle con un alto contenuto di acqua, devono essere trattate attraverso un processo di fissazione prima dell'imaging.
Questi meristemi floreali sono stati immediatamente trattati con una soluzione fissativa di formalina/acido acetico appena preparata. Il tessuto fissato è stato sezionato in etanolo, posto in un contenitore a rete e disidratato attraverso una serie di etanolo al 70%, 80%, 90% e 100% di etanolo. Infine, i tessuti vegetali sono stati essiccati utilizzando un essiccatore a punto critico, montati e rivestiti per polverizzazione catodica con un sottile rivestimento metallico.
Dopo l'imaging SEM, è chiaro che le strutture non trattate sono state pesantemente danneggiate dal processo di essiccazione e hanno mostrato un notevole collasso della struttura, mentre quelle che sono state fissate hanno mantenuto la loro struttura nativa. In alternativa, le cellule e altri campioni ad alto contenuto d'acqua possono essere riprodotti utilizzando il SEM ambientale o ESEM. L'ESEM utilizza un fascio di elettroni ad alta energia che viene scansionato raster sul campione, come con il SEM convenzionale, tuttavia, consente l'imaging di campioni umidi o non rivestiti mantenendo un ambiente gassoso all'interno della camera.
Questo viene fatto separando la camera ad alto vuoto contenente il cannone elettronico dalla camera del campione utilizzando due aperture. Il fascio di elettroni subisce perdite significative a causa della dispersione da parte delle molecole di gas, ma è in genere un'energia sufficientemente alta per l'imaging. Qui, le cellule sono state coltivate su un chip di silicio, funzionalizzate con punti quantici e fissate utilizzando un protocollo di fissazione della glutaraldeide. Le cellule sono state riprodotte in acqua e mostrano la struttura non collassata della cellula con singoli punti quantici visibili sulla superficie cellulare.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla visualizzazione dei biomateriali utilizzando il SEM. A questo punto dovreste capire come funziona il SEM, come vengono preparati e visualizzati i campioni biologici, nonché alcune applicazioni della tecnica per le strutture sensibili.
Grazie per l'attenzione!
