Un sistema magnetico Tether per Indagare visivo e olfattivo di controllo mediata Volo in Drosophila

Il campo in espansione dell'olfatto di Joof ha stimolato test comportamentali sempre più sofisticati, come l'apparato olfattivo con perno magnetico o OMT. Questa procedura prevede l'incollaggio del torace dorsale della mosca a un perno mnuchin. La mosca viene sospesa a un angolo di 30 gradi con il perno a un'inclinazione adeguata, quindi allineata tra due magneti di terre rare.

Se eseguito correttamente, ciò consentirà un'ampia libertà di movimento. Un'apertura per l'odore viene quindi allineata per produrre una corrente che passa in modo uniforme dall'ugello di erogazione sopra la testa della mosca e penetra nella camera a vuoto. Viene quindi testata la capacità della mosca di localizzare l'odore in presenza di stimoli visivi.

Ciao, sono Brian DeMars del laboratorio del Dottor Mark Fry del Dipartimento di Scienze Fisiologiche presso l'Università della California di Los Angeles. Oggi vi mostreremo come fissare i moscerini per utilizzarli in un apparato magnetico con vincolo olfattivo. Vi mostreremo inoltre come allineare i magneti e le aperture per l'odore e come impostare le portate massiche per il sistema di somministrazione degli odori.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il controllo del volo mediato dalla vista e dall'olfatto nei moscerini della frutta. Cominciamo dunque. Per iniziare il fissaggio, raccogliere i moscerini quattro-sei giorni dopo l'emergenza dagli adulti (ELOs) e privarli del cibo per quattro-sei ore.

In un vial contenente un dischetto di carta kim umido per prevenire la disidratazione, trasferire successivamente un lotto di moscerini marcati in un piccolo vial inserito in un blocco di ottone su un piano di raffreddamento Peltier impostato a quattro gradi Celsius. A questa temperatura, i moscerini si anestetizzeranno entro circa 30 secondi.

Posizionare un fazzoletto di carta Kim sullo stadio di raffreddamento per assorbire l'umidità. Successivamente, posizionare le mosche anestetizzate sopra lo stadio per la selezione, scegliendo le femmine più grandi da fissare. Utilizzando un pennello sottile, spingere una singola mosca nella posizione corretta all'interno del sarcofago su misura, modellato per ospitare una singola mosca della frutta femmina di tipo selvatico.

Ora utilizzare il microscopio per assicurarsi che la mosca sia posizionata correttamente con il lato dorsale verso l'alto. L'estremità anteriore della mosca deve essere rivolta verso di voi e quella posteriore lontana da voi. Successivamente, posizionare un ago minuchin con una bacchetta magnetica montata su un micromanipolatore.

Il perno deve essere allineato con l'estremità smussata rivolta verso il torace dorsale della mosca. Questa posizione si trova appena dietro la testa, tra le due ali. La mosca deve essere posizionata correttamente sul perno lungo tre assi.

L'inclinazione, il beccheggio e l'imbardata del perno devono essere perfettamente verticali quando si osserva frontalmente verso gli occhi; anche un piccolo grado di beccheggio tra la mosca e il perno non è tollerabile. L'angolo di vista laterale tra il perno e l'asse longitudinale del corpo, ovvero l'inclinazione, deve formare un angolo di 30 gradi con il muso rivolto verso l'alto rispetto all'orizzonte. Si tenga presente che potrebbe essere necessario accorciare il perno per un funzionamento ottimale del collegamento.

Questo dipenderà dalla distanza tra i magneti di sospensione. Una volta allineato il perno mnuchin, utilizzare un sottile filo di acciaio per applicare una piccola goccia di colla attivata da UV all'estremità smussata del perno mnuchin. Ora manipolare il perno in modo che la goccia di colla tocchi il torace delle mosche appena sopra la testa.

Attenzione a non usare troppa colla. Con la giusta dimensione della goccia, la colla dovrebbe formare un menisco e scorrere dal perno sul torace. Successivamente, polimerizzare la colla con due impulsi di luce UV della durata di 22 secondi ciascuno.

Una volta completato l'ancoraggio, posizionare manualmente un piccolo quadrato di salvietta Kim a ciascuna mosca utilizzando pinzette, sfruttando il riflesso istintivo di atterraggio. Le mosche afferreranno le salviette Kim. Dopo un'ora di recupero, le mosche ancorate sono pronte per gli esperimenti.

Per ottenere un movimento rotazionale uniforme di 360 gradi, è fondamentale allineare correttamente i magneti. A tale scopo, tenere i magneti ad anello inferiori in posizione orizzontale con una guaina di plastica e posizionarli direttamente sopra una camera a vuoto trasparente. Il magnete a barra superiore è fissato verticalmente a circa tre quarti di pollice sopra i magneti inferiori; un cuscinetto doppio a V è attaccato con resina epossidica alla superficie inferiore del magnete superiore.

Questo standardizzerà la posizione delle mosche e minimizzerà l'attrito rotazionale. Tieni presente che questi magneti possono essere pericolosi e un loro uso improprio può causare danni all'attrezzatura o lievi infortuni. Successivamente, allinea approssimativamente i magneti superiore e inferiore a vista.

Posizionando il magnete a barra superiore direttamente sopra il punto centrale dei magneti ad anello inferiori, sarà utile fissare il magnete superiore a un micro manipolatore per regolazioni fini. Ora, posizionare un moscerino nell'arena e regolare la posizione orizzontale e verticale del magnete superiore finché il moscerino riesce a ruotare in modo uniforme e stabile di 360 gradi all'inizio di ogni esperimento; ogni moscerino deve essere controllato per verificare una rotazione regolare, assicurando così che i magneti siano correttamente allineati e che i perni mnuchin non siano danneggiati. Se il montaggio non è corretto, il moscerino potrebbe non ruotare affatto.

Potrebbe avere un'ampiezza di movimento limitata o ruotare a velocità non costanti. Ciò potrebbe essere dovuto a un problema con l'incollaggio, che può essere verificato ruotando una griglia a strisce davanti alla mosca per indurre una risposta omo. Se la mosca non ruota o ruota in modo non costante, sostituirla con un'altra mosca.

Se questa mosca non ruota correttamente e questi problemi si verificano per ogni mosca, allora il problema è probabilmente dovuto all'allineamento dei magneti ed è necessario un ulteriore aggiustamento per ottenere un'odorizzazione stabile. Per configurare inizialmente il sistema degli odori, sarà necessario collegare un tubo in teflon di piccolo diametro dal multiplexer gassoso ai flaconcini per odori contenenti acqua realizzati su misura. L'uscita di questi flaconcini deve essere collegata direttamente ai tubi dei porti ipodermici utilizzando lo stesso tubo in teflon.

Successivamente, posizionare una camera per vuoto in acrilico trasparente sotto l'arena per sostenere i magneti. Utilizzare un tubo di vetro di quattro millimetri montato al di sotto della mosca e collegato alla camera per vuoto per avvicinare l'apertura del vuoto alla mosca e ridurre il diametro dell'apertura. Ora posizionare una mosca legata nell'arena utilizzando pinzette.

Una volta posizionata la mosca, attivare un odore attraente. È possibile verificare visivamente se la mosca si dirige verso la posizione del porto odoroso quando l'odore viene attivato. Se la mosca sembra non avere preferenza per l'odore, utilizzare il metodo dei tentativi ed errori per ottimizzare l'OMT.

Per fare ciò, regolare innanzitutto la posizione del porto dell'odore finché la mosca non sembra seguire l'odore. In questo caso, i porti dell'odore sono montati su micromanipolatori e posizionati a quattro millimetri in direzione dorsale e a tre millimetri in direzione anteriore rispetto alla testa della mosca. Se la modifica della posizione del porto dell'odore non migliora il seguito dell'odore, regolare la portata massica finché la mosca non sembra seguire l'odore.

Utilizziamo un valore di sette millilitri al minuto. Se la regolazione della portata massica non migliora il seguito dell'odore, regolare la portata del vuoto finché la mosca non sembra seguire l'odore. Impostiamo la portata del vuoto a 13 litri al minuto utilizzando un regolatore di flusso.

Una volta impostata la posizione della porta e le portate, commutare periodicamente tra la somministrazione di vapore acqueo e vapore odoroso utilizzando un multiplexer gassoso commutabile. Se l'apparato è stato configurato correttamente, si dovrebbero osservare due fenomeni. In primo luogo, sotto stimoli visivi rotanti costanti, una mosca fissata posta nell'OMT dovrebbe ruotare in modo regolare di 360 gradi lungo l'asse verticale o asse ya; movimenti a scatti chiamati kos sono caratteristici del comportamento di rotazione spontanea in assenza di stimoli visivi costanti.

Se le mosche non riescono a ruotare in modo uniforme, potrebbero essere colpa un'incollatura non corretta e magneti non allineati. In secondo luogo, si dovrebbe osservare che quando l'odore viene attivato, la mosca dovrebbe dirigersi verso la direzione del porto dell'odore. Quando l'odore viene disattivato, la mosca dovrebbe ruotare spontaneamente senza mostrare preferenza per alcuna posizione nell'arena.

Se i moscerini non seguono attivamente la scia odorosa, ciò potrebbe indicare la necessità di regolare la posizione del porto dell'odore, la velocità del flusso d'aria e/o la velocità del flusso di vuoto. Vi abbiamo appena mostrato come fissare un moscerino per utilizzarlo in un apparato con trattenuta magnetica olfattiva. Vi abbiamo inoltre mostrato come allineare correttamente i magneti e i porti dell'odore e come impostare le portate massiche per il sistema di somministrazione degli odori.

Ecco tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.