Un sistema magnetico Tether per Indagare visivo e olfattivo di controllo mediata Volo in Drosophila

Il campo in crescita dell'olfatto di Joof ha motivato saggi comportamentali sempre più sofisticati, come l'apparato di collegamento magnetico olfattivo o OMT. Questa procedura prevede l'incollaggio del torace dorsale della mosca a un perno mnuchin. La mosca è sospesa a un angolo di 30 gradi con il perno a un passo corretto, quindi allineata tra due magneti in terre rare.

Se fatto correttamente, questo si tradurrà in una libertà di movimento. Una porta per gli odori viene quindi allineata per produrre un pennacchio che passa dolcemente dall'ugello di erogazione sopra la testa della mosca nella camera a vuoto. La capacità della mosca di localizzare l'odorante viene poi testata in presenza di stimoli visivi.

Ciao, sono Brian DeMars del laboratorio del Dr.Mark Fry nel Dipartimento di Scienze Fisiologiche dell'Università della California di Los Angeles. Oggi vi mostreremo come legare le mosche per l'uso in un apparecchio di collegamento magnetico olfattivo. Vi mostreremo anche come allineare i magneti e le porte degli odori e impostare le portate massiche per il sistema di erogazione degli odori.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il controllo di volo mediato visivo e olfattivo e i moscerini della frutta. Quindi iniziamo. Per iniziare a legare le mosche da quattro a sei giorni dopo gli ELO, farle morire di fame per quattro o sei ore.

In una fiala di elenco degli alimenti contenente una salvietta umida per prevenire l'essiccazione Trasferimento successivo. Un lotto di mosche stellate su una piccola fiala inserita in un blocco di ottone su uno stadio di raffreddamento Peltier impostato a quattro gradi Celsius. A questa temperatura, le mosche si anestetizzano entro circa 30 secondi.

Metti una salvietta Kim sopra il tavolino di raffreddamento per assorbire l'umidità. Quindi posiziona le mosche anestetizzate in cima al palco per lo smistamento, seleziona le femmine più grandi per il legame. Usando un pennello sottile, spingi una singola mosca in posizione nel sarcofago costruito su misura a forma di ospitare una singola mosca della frutta femmina di tipo selvatico.

Ora usa il microscopio per assicurarti che la mosca sia posizionata correttamente con il lato dorsale. In alto, la parte anteriore della mosca dovrebbe essere rivolta verso di te e la parte posteriore lontana da te. Successivamente posizionare uno spillo da minuchin con un'asta magnetica montata su un manipolatore microm.

Il perno deve essere allineato con l'estremità smussata rivolta verso il torace dorsale della mosca. Questo è appena dietro la testa tra le due ali. La mosca deve essere posizionata correttamente sul perno lungo tre assi.

Il beccheggio, il rollio e il birillo dovrebbero essere perfettamente verticali quando vengono osservati, la testa verso gli occhi, anche una piccola quantità di rollio tra la mosca e il perno non può essere tollerata. L'angolo di visione laterale tra il perno e l'asse lungo del corpo o del beccheggio dovrebbe essere a un angolo di 30 gradi rispetto all'orizzonte. Tieni presente che potrebbe essere necessario tagliare il perno per un funzionamento ottimale del cavo.

Questo dipenderà dalla distanza tra i magneti delle sospensioni. Una volta allineato il perno mnuchin, utilizzare un filo d'acciaio sottile per applicare una piccola goccia di colla attivata dai raggi UV sull'estremità smussata del perno mnuchin. Ora manipola il perno in modo che la goccia di colla tocchi il torace delle mosche appena sopra la testa.

Fare attenzione a non usare troppa colla. Con la corretta dimensione della goccia, la colla dovrebbe inginocchiarsi e fluire dal perno sul torace. Quindi, polimerizza la colla con due raffiche di luce UV 22.

Una volta che il legatura è completo a mano, un piccolo quadrato Kim passa a ogni mosca usando il forcipe a causa di un riflesso di atterraggio istintivo. Le mosche afferreranno le salviette di Kim. Dopo un'ora di recupero, le mosche legate sono pronte per gli esperimenti.

Per ottenere un raggio di movimento fluido a 360 gradi, è fondamentale allineare correttamente i magneti. A tale scopo, tenere gli anelli magnetici inferiori in posizione orizzontale con un manicotto di plastica e posizionarli direttamente sopra una camera a vuoto trasparente. Il magnete dell'asta superiore è fissato verticalmente a circa tre quarti di pollice sopra i magneti inferiori, un doppio cuscinetto a V è fissato con resina epossidica alla superficie inferiore del magnete superiore.

Ciò standardizzerà il posizionamento delle mosche e ridurrà al minimo l'attrito rotazionale. Tieni presente che questi magneti possono essere pericolosi e l'uso improprio può causare danni alle apparecchiature o lievi lesioni personali. Quindi, allinea approssimativamente visivamente i magneti superiore e inferiore.

Posizionando l'asta magnetica superiore direttamente sopra il punto centrale dell'anello magnetico inferiore, sarà utile collegare il magnete superiore a un micro manipolatore per la regolazione fine della scala. Ora, posiziona una mosca nell'arena e regola la posizione orizzontale e verticale del magnete superiore fino a quando la mosca può ruotare dolcemente e costantemente di 360 gradi all'inizio di ogni esperimento, ogni mosca dovrebbe essere controllata per una rotazione regolare per garantire che i magneti siano allineati correttamente e che i perni mnuchin non siano danneggiati. Se l'impostazione non è corretta, la mosca potrebbe non girare affatto.

Può avere un raggio di movimento limitato o può ruotare a velocità incoerenti. Questo potrebbe essere un problema con l'incollaggio, che può essere testato ruotando una griglia a strisce davanti alla mosca per suscitare una risposta omo. Se la mosca non gira o gira in modo incoerente, sostituiscila con un'altra mosca.

Se questa mosca non gira correttamente e questi problemi esistono per ogni mosca, è probabile che il problema sia dovuto all'allineamento dei magneti e saranno necessarie ulteriori regolazioni per ottenere un odore stabile. Il monitoraggio della configurazione iniziale del sistema di odori richiederà l'esecuzione di tubi in teflon di calibro ridotto dal multiplexer di gas alle fiale di odore d'acqua costruite su misura. L'uscita di queste fiale deve essere collegata direttamente ai tubi della porta ipodermica utilizzando lo stesso tubo in teflon.

Successivamente, una camera a vuoto in acrilico trasparente viene posizionata sotto l'arena per sostenere i magneti. Utilizzare un tubo di vetro da quattro millimetri montato sotto la mosca e collegato alla camera del vuoto per avvicinare l'apertura del vuoto alla mosca e ridurre il diametro dell'apertura. Ora posiziona una mosca legata nell'arena usando il forcipe.

Una volta che la mosca è in posizione, accendi un odore attraente. È possibile verificare visivamente se la mosca si dirige verso la posizione della porta dell'odore quando l'odore è acceso. Se la mosca sembra non avere preferenze per l'odore, usa tentativi ed errori per ottimizzare l'OMT.

Per fare ciò, per prima cosa, regola la posizione della porta dell'odore fino a quando la mosca non appare per tracciare l'odore. Qui le porte degli odori sono montate su manipolatori microm e posizionate quattro millimetri dorsalmente e tre millimetri anteriormente alla testa della mosca. Se la modifica della posizione della porta dell'odore non migliora il tracciamento dell'odore, regolare la portata di massa fino a quando la mosca non sembra tracciare l'odore.

Le impostazioni sono di sette millilitri al minuto. Se la regolazione della portata massica non migliora l'inseguimento degli odori, regolare la portata del vuoto fino a quando la mosca non sembra seguire l'odore. Impostiamo la portata del vuoto a 13 litri al minuto utilizzando un regolatore di flusso.

Una volta impostate la posizione della porta e le portate, passare periodicamente dall'erogazione del vapore acqueo a quella del vapore odoroso utilizzando un multiplexer di gas commutabile. Se hai impostato correttamente il tuo apparecchio, dovresti osservare due cose. In primo luogo, sotto stimoli visivi rotanti costanti, una mosca legata posizionata nell'OMT dovrebbe ruotare dolcemente di 360 gradi nell'asse verticale o le curve a scatti chiamate kos sono caratteristiche del comportamento di virata spontanea in assenza di stimoli visivi costanti.

Se le mosche non possono ruotare senza intoppi, la colpa potrebbe essere di un incollaggio improprio e di magneti disallineati. In secondo luogo, dovresti anche vedere che quando l'odore è acceso, la mosca dovrebbe dirigersi in direzione della porta dell'odore. Quando l'odore è spento, la mosca dovrebbe scoppiare spontaneamente senza preferenza per nessuna posizione nell'arena.

Se le mosche non tracciano attivamente il pennacchio di odore, ciò potrebbe significare che è necessario regolare la posizione della porta dell'odore, la portata d'aria e/o la portata del vuoto. Ti abbiamo appena mostrato come legare una mosca per l'uso in un apparecchio magnetico olfattivo. Ti abbiamo anche mostrato come allineare correttamente i magneti e le porte degli odori e come impostare le portate massiche per il sistema di erogazione degli odori.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.