Micro-drive array per la cronica In vivo: Drive Fabrication

Questo video illustrerà il montaggio di un array di microdrive leggero composto da 21 microdrive indipendenti regolabili mediante vite. Ogni microdrive controlla la posizione di registrazione di un singolo elettrodo. I microdrive sono montati su una base in plastica progettata al computer che li stabilizza rispetto al cranio dell'animale in movimento e raccoglie gli elettrodi in un pattern densamente compatto, in grado di passare attraverso una piccola craniotomia ed entrare nel cervello.

La base supporta inoltre una scheda interfaccia per gli elettrodi, che consente di collegare e scollegare facilmente l'animale dagli strumenti di registrazione all'inizio e alla fine di un esperimento. Un cono di plastica fissato alla base protegge le micromotrici e gli elettrodi dagli agenti presenti nella gabbia del ratto. Ciao, sono Faia Postman del laboratorio di Matt Wilson presso l'Istituto PIKA per l'Apprendimento e la Memoria del Massachusetts Institute of Technology.

Oggi vi mostreremo un protocollo per la fabbricazione di una di quelle matrici micro dive. Nel nostro laboratorio, utilizziamo queste matrici micro dive per registrare l'attività di una vasta popolazione di neuroni nel cervello di ratti, ad esempio dalla corteccia o dall'ippocampo. Prima di tutto, vi mostreremo come abbiamo progettato la nostra matrice micro dive.

Quindi ci recheremo nel laboratorio, dove Steve e Stewart ci mostreranno come lavorare le materie prime e come assemblarle in un dispositivo completamente funzionale. Cominciamo subito. La base in plastica è progettata utilizzando un software di progettazione assistita da computer ed è realizzata mediante un processo di stampa 3D economico.

Modelliamo anche tutti gli altri componenti dell'array del microdrive. Ciò ci consente di controllare con precisione le dimensioni e il peso del microdrive finito. Nella parte superiore della base in plastica sono presenti due anelli di fori che accoglieranno i singoli microdrive.

Il modello 3D viene inviato a un centro di servizio che realizza il progetto utilizzando resina indurente al laser mediante stereolitografia. Ciò richiede solo pochi giorni e il pezzo risultante è leggero e riutilizzabile. Una volta ricevuto il pezzo dal centro di servizio, dobbiamo prepararlo per l'uso.

Andiamo ora al laboratorio. Il processo di stampa 3D non consente di produrre fori piccoli in modo affidabile, quindi specifichiamo fori di diametro ridotto nei nostri modelli. Successivamente, si procede a forare e a filettare i fori alle dimensioni richieste nel laboratorio.

Per preparare la base di plastica, si utilizzano tre punte di trapano di dimensioni diverse: una punta numero 61, una punta numero 65 e una punta da 1,55 millimetri nell'anello esterno della base. Utilizzare un trapano manuale con una punta numero 61 a velocità molto basse per preparare i fori guida dove successivamente verranno inserite le viti del microdrive. Successivamente, preparare i fori per i tubi di supporto del microdrive che entrano nella base, allargando questi fori con una punta numero 65.

Utilizzando la punta più grande da 1,55 millimetri, eseguire la foratura dei fori che serviranno ad attaccare la base alla scheda dell'interfaccia degli elettrodi e al cono protettivo. Per garantire un movimento regolare nel microdrive, inserire un manicotto in acciaio inossidabile nell'anello interno dei fori. Ogni manicotto deve essere inserito a pressione con una pinza fino a quando risulti perfettamente a filo con la parte superiore della base.

Ora è necessario filettare i fori pilota per le viti. Utilizzare una pinza morsetto per tenere lo scarpello e applicare un lubrificante secco prima della filettatura. Allineare lo scarpello assicurandosi che sia parallelo a un tubo da 23 gauge inserito temporaneamente nel manicotto adiacente.

I fori che alloggiano la scheda di interfaccia e il cono protettivo devono essere filettati. Filettare manualmente questi fori nello stesso modo. La progettazione in plastica presenta un avviatore di filettatura per ciascun foro guida della vite, per garantire che i filetti iniziali non vengano danneggiati durante il processo di filettatura.

Dopo che tutti i fori pilota sono stati filettati, questi avviatori del maschio possono essere facilmente rimossi con una lametta. Le elettrodi sono indirizzati verso un singolo sito nella parte inferiore del dispositivo da un certo numero di tubi guida elettrici.

Per prima cosa, è necessario realizzare la cannula di raccolta che dovrà contenere tutti i tubi guida elettrici. La cannula di raccolta è costituita da un pezzo lungo 1,5 centimetri di tubo in acciaio inossidabile. La cannula di raccolta verrà fissata con cemento dentale.

Per migliorare l'adesione, scalfire attentamente il tubo utilizzando una mola Dremel, quindi inserire questa cannula nella parte inferiore della base di plastica. Posizionarla in modo che rimangano fuori dall'array del microdrive cinque o sette millimetri della cannula. Per facilitare l'implantazione chirurgica, fissare la cannula raccoglitrice alla base inferiore della base di plastica.

Con l'acrilico dentale, lasciarlo polimerizzare per almeno 15 minuti. Preparare ora i tubicini guida tagliando 21 pezzi di poliammide con una lametta. Iniziare questo passaggio inserendo tutti e 21 i tubicini guida nella cannula raccoglitrice situata nella parte inferiore della base del drive.

Questo garantirà che i tubi siano tutti paralleli tra loro. Se i tubi nel fascio sono troppo lenti o troppo stretti, è possibile iniziare con un numero minore di tubi o aggiungere tubi aggiuntivi secondo necessità. Ora, rimuovere ogni tubo guida uno alla volta e inserirlo in una delle maniche nella parte superiore dell'unità di trascinamento.

Fare passare il tubo attraverso l'apertura lasciata libera nel fascio di tubi. Controllare i tubi guida per verificare la presenza di pieghe o curve strette e sostituirli se necessario. Regolare la posizione di ciascun tubo guida in modo che sporga di uno o due millimetri rispetto alla sommità della guaina.

Ora aggiungere una piccola goccia di colla sano acro lake sottile alla base della cannula di raccolta. Fare molta attenzione a non far penetrare la colla nei tubi guida. Successivamente, utilizzare una lametta nuova per tagliare il fascio di tubicini in eccesso alla base della cannula di raccolta.

Verificare al microscopio stereoscopico che i tubi siano tagliati in modo preciso e siano a filo con la cannula. Ogni elettrodo viene avanzato tramite un microdrive indipendente, pertanto dobbiamo realizzare 21 microdrive e quindi inserirli nella base di plastica. Ciascun microdrive è composto da una vite personalizzata e da un tubo di supporto cavo, che sono fissati l'uno all'altro.

Con l'acrilico dentale, l'elettrodo passerà attraverso il tubo di supporto. La vite presenta una parte non filettata con un piccolo risalto che viene incorporato nell'acrilico dentale e permette alla vite di ruotare liberamente in questo modo. Ruotando la vite nella base di plastica, si fa avanzare o ritrarre l'elettrodo.

La testa della vite ha la forma di un semicilindro. Prima di poter realizzare i microdispositivi, dobbiamo costruire un cacciavite per ruotare le nostre viti personalizzate. Il nostro cacciavite provvisorio viene realizzato prendendo una vite personalizzata e limando completamente il bordo che circonda la testa a semicilindro.

Inserire la testa della vite all'esterno di un tubo lungo cinque centimetri e di calibro 15 fino a quando non sia completamente incapsulata. Ora, schiacciare il tubo attorno alle filettature della vite, fissandola saldamente all'interno del tubo e impedendole di ruotare. Fissare una pinza miniatura per agire da manico ed ecco pronto un cacciavite.

Il microdrive viene realizzato modellando acrilico dentale intorno alla vite e al tubo di supporto. Gli stampi che utilizziamo sono in plastica stampata in 3D, proprio come la base di plastica, e presentano dei fori nella parte inferiore che mantengono allineati la vite e il perno di supporto mentre versiamo l'acrilico nello stampo. Per prima cosa, dobbiamo preparare lo stampo: pulire il foro del tubo di supporto utilizzando un ago da 23 gauge, pulire il foro della vite e creare filettature utilizzando un maschio filettatore.

Questa è la stessa procedura che abbiamo appena utilizzato sulla base di plastica. Ora lo stampo è pronto per essere utilizzato nella fabbricazione di microdrive. Rivestire lo stampo con un lubrificante a base di teflon per impedire che l'acrilico dentale aderisca allo stampo.

Carteggiare i due-tre millimetri superiori di un supporto in acciaio inossidibile lungo 14 millimetri e di calibro 23 con una mola in modo che possa essere saldamente fissato in profondità nell'acrilico. Inserire il supporto nel foro più piccolo dello stampo in modo che la parte superiore del supporto si trovi al di sopra della parte superiore del pozzetto. Applicare un sottile strato di lubrificante a base di Teflon su una vite e inserirla nel foro filettato fino a quando i filetti si trovino appena al di sotto del fondo del pozzetto.

Ora mescolare un po' di acrilico dentale e versarlo nello stampo. Assicurarsi che penetri in tutti gli anfratti. Un ago può aiutare a rimuovere le bolle d'aria una volta che l'acrilico si è indurito.

È possibile rimuovere il microdrive svitando la vite. Eseguire un controllo rigoroso della qualità. L'acrilico non deve presentare crepe o bolle.

Il perno e le viti devono essere paralleli e non devono poter scorrere lateralmente. Le viti devono ruotare in modo uniforme, senza gioco; tutti i microdischi difettosi devono essere smontati e le parti riutilizzate. Ripetere questo processo fino a ottenere 21 microdischi funzionanti.

Se lo stampo presenta più pozzetti, è possibile realizzare le micropompe e i lotti contemporaneamente per risparmiare tempo. Allineare con attenzione ciascuna micropompa con una coppia di fori nella base di plastica. Inserire il tubo di supporto della micropompa sopra il tubo guida in polimero e all'interno della guaina metallica, utilizzando il cacciavite per avanzare la vite della micropompa.

Questo passaggio può essere delicato. Tenere d'occhio il centro della base per assicurarsi che il tubo guida non si incastrì in una piega mentre il microdrive viene abbassato. Una volta che tutti i microdrive sono al loro posto e completamente abbassati, una piccola quantità di acrilico viene depositata al centro del drive per fissare il mazzo di tubi guida in posizione.

Lasciare polimerizzare l'acrilico per 15 minuti. Una volta che l'acrilico è asciutto, ritrarre ciascun microdrive di circa tre millimetri, creare uno schema della vista dall'alto dei microdrive e assegnare a ciascun microdrive un nome o un numero univoco. Ora, osservando al microscopio stereoscopico, capovolgere il microdrive e scattare una fotografia della parte inferiore della cannula raccoglitrice e dei tubi guida.

Stampare una copia dell'immagine che potrà essere utilizzata come riferimento nei passaggi successivi. Successivamente, con l'unità di avanzamento rivolta verso il basso, inserire un tubo guida in poliammide stretto in ciascun tubo guida fino a farlo uscire dalla parte superiore di un microdrive. Indicare sulla fotografia a quale tubo guida corrisponde ciascun microdrive.

Il tubo portante in seguito proteggerà e sosterrà i delicati fili dell'elettrodo. Esso passa attraverso la micromotrice. Estendere ciascun tubo portante fino a quando si trova un centimetro al di sopra della sommità del tubo di sostegno della micromotrice, quindi incollare il tubo portante al tubo di sostegno con colla epossidica a presa rapida (cinque minuti) o con colla acrilica spessa Sano Acro Lake.

Siate molto attenti in questo passaggio. Se la colla cola lungo l'interno del tubo di supporto, può incollare il tubo di supporto al tubo guida fisso, rovinando quel microdrive. Questa è la ragione per cui solleviamo i microdrive prima di inserire i tubi portanti.

Dopo aver incollato tutti i tubi portanti al loro posto, abbassare completamente i microdrive e recidere tutti i tubi portanti in modo uniforme al livello inferiore del drive utilizzando una lama di rasoio nuova. Successivamente, tagliare i tubi portanti da uno a due millimetri sopra la parte superiore del microdrive usando forbici affilate. Infine, posizionare la scheda di interfaccia degli elettrodi sulla base del drive e fissarla con due viti.

A questo punto, l'array di drive è pronto per essere caricato con gli elettrodi e i nostri esperimenti. Utilizziamo tipicamente elettrodi a microwire a quattro canali chiamati tetroidi, ma può essere usato qualsiasi tipo di elettrodo. La fabbricazione dei tetroidi, il modo in cui vanno inseriti nei microdrive e la preparazione dell'array di drive per l'implantazione chirurgica sono trattate in altri video di JoVE.

Questo protocollo può essere seguito così com'è o modificato in base alle proprie esigenze. Ad esempio, alcuni ricercatori potrebbero aver bisogno di viti più lunghe per registrare da strutture cerebrali più profonde. Altri potrebbero voler progettare un dispositivo in grado di bersagliare più di una localizzazione cerebrale.

Il design può anche essere miniaturizzato per l'uso in animali più piccoli come i topi, con modifiche leggermente più complesse; in tal caso possono essere utilizzati microdrive motorizzati, che consentono la regolazione a distanza delle posizioni degli elettrodi. Abbiamo appena mostrato come progettare e realizzare un array di microdrive che può essere impiantato sulla testa di un ratto e che permette di registrare da ampie popolazioni di neuroni mentre l'animale si muove effettivamente. Durante questa procedura, è importante ricordare di filettare con attenzione i fori nella base di plastica in modo che le viti del microdrive non slittino.

Eseguire un controllo rigoroso della qualità dei microdispositivi realizzati. Assicurarsi che la vite e il tubo di supporto siano paralleli e che la vite ruoti agevolmente senza giochi. Prestare attenzione durante l'uso di colla o acrilico dentale per non ostruire accidentalmente nessuno dei tubi.

Infine, ricordate che per completare l'array MyDrive e prima di eseguire l'intervento chirurgico, dovrete fabbricare i tetri e la bassa dose all'interno del drive. Questo argomento è trattato in un altro articolo video di JoVE. Ecco tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.