Micro-drive array per la cronica In vivo: tetrodo Assemblea

In questo protocollo, descriviamo la fabbricazione e l'installazione di fasci Tetro composti da quattro elettrodi per la registrazione cronica in vivo nel roditore sveglio, per iniziare la fabbricazione dei tetro. Un filo di microelettrodi viene piegato due volte su se stesso per formare un fascio di quattro fili paralleli. Questi fili vengono quindi attorcigliati insieme e infusi con una pistola ad aria calda.

Ogni tero finito viene collocato in una scatola di conservazione. Mentre vengono prodotti ulteriori teros, ciascun tero viene inserito lungo un percorso dedicato che entra attraverso un'apertura in un attuatore lineare ed esce attraverso la base dell'array di microdrive. Ciascuno dei quattro fili del tero è collegato a pin separati su una scheda connettore di uscita fissata alla sommità dell'array di microdrive.

L'impedenza di ogni canale del tero viene ridotta mediante un processo di elettrodeposizione dell'oro. Una volta che tutti i tero sono stati installati ed elettrodepositati, due cavi di massa vengono collegati ai rispettivi pin sulla scheda del connettore e un cono protettivo viene fissato al telaio dell'array di microdrive per proteggerlo dopo che il cono è stato messo a massa. Array di microdrive Tero funzionanti pronti per l'innesto. Ciao, sono Dave Nian del laboratorio di Nat Wilson presso l'Istituto Pickout per l'Apprendimento e la Memoria.

Oggi al MIT, vi mostreremo un procedimento per la fabbricazione dei teros, il caricamento dei teros e il completamento delle fasi finali della ricostruzione del microdrive. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'attività neurale coordinata tra grandi popolazioni di neuroni in preparazioni di animali svegli e in attività. Cominciamo dunque.

Per costruire il tero per il nostro array standard di microdrive, iniziamo con un tratto di filo micrometrico isolato di 50 centimetri e 12 micron di diametro. Piegate il filo a metà e passate le dita lungo la coppia di fili per farli aderire. Assicuratevi che la coppia di fili abbia un buon contatto per tutta la loro lunghezza.

Piegare nuovamente la coppia tenendo insieme le due estremità. Assicurarsi che il cappio formato a un'estremità non presenti pieghe. Tagliare i quattro fili all'estremità senza cappio in modo che le quattro punte siano allineate.

Per il passaggio successivo, sarà necessaria una pinza a coccodrillo modificata, un dispositivo motorizzato per la rotazione e una barra orizzontale posizionata sopra il dispositivo di rotazione. La pinza a coccodrillo viene modificata incollando una barretta di plastica alla base della pinza. Quando le punte sono esposte, fissare insieme i quattro fili utilizzando la pinza a coccodrillo modificata.

Appendere il cappio di filo metallico alla barra orizzontale. Inserire la pinza a coccodrillo nel supporto motorizzato. Applicare 80 torsioni in senso orario seguite da 40 torsioni in senso antiorario al fascio di fili nell'arco di circa tre minuti.

Questi parametri possono essere modificati in base alle proprie esigenze. Al termine della torsione, unire i fili riscaldandoli da tre angolazioni diverse con una pistola termica, utilizzando un flusso medio-basso per ciascun angolo, partendo da uno a due centimetri al di sotto del punto in cui il fascio di fili si divide. Successivamente, passare la pistola termica su e giù a una distanza di due centimetri dai fili per circa cinque secondi.

Procedere con cautela poiché alte temperature possono sciogliere completamente l'isolamento e causare cortocircuiti. Ora che i fili sono stati saldati insieme, rimuovere il tero dall'apparato di torsione sollevando delicatamente la pinza a coccodrillo per alleviare la tensione sul tero e tagliare il tero in prossimità della pinza a coccodrillo. All'altra estremità, tagliare il cappio in modo da ottenere quattro filamenti di filo non marchiati di uguale lunghezza. Successivamente, separare i singoli filamenti nella parte superiore piegando delicatamente i fili con una pinzetta dalla punta morbida.

Il tero è ora pronto per essere caricato nell'array di microdrive. Realizzare da 21 a 25 Tet roads aggiuntivi e conservarli in una scatola priva di polvere fino al momento del caricamento del tero. Sarà necessario un array completo di microdrive, qualora non ne siate ancora in possesso.

Fare riferimento al video relativo alla matrice di microelettrodi con sistema di avanzamento per la fabbricazione della matrice di microavanzamento per registrazioni croniche in vivo nel nostro progetto di design. Il tero verrà fissato a un'estremità all'hardware del connettore e passerà attraverso il tubo portante in polimide presente nel microavanzamento, in modo che le punte degli elettrodi sporgano al di sotto della base della matrice di microavanzamento. Illustreremo ora questo processo di caricamento per un singolo tero.

Prima di iniziare, costruire il supporto per il drive che può essere fissato alla scheda connettore a un'estremità e all'altra estremità può essere bloccato da un contenitore di ghiaccio. In questo esempio, il supporto del drive è un connettore milax incollato a un'estremità dell'impugnatura di un coltello X-acto che tiene il tetro con pinzette a punta morbida; utilizzando uno stereomicroscopio, spingere la punta del tetro all'interno del tubo portante in polimero di uno dei microdrive. Inserire il tetro nel tubo finché i singoli fili elettrodi si trovino vicini alla scheda connettore nella parte superiore dell'array del drive; fare attenzione a non piegare i fili, poiché ciò causerebbe l'inserimento del tetro nel cervello con un angolo invece che perpendicolarmente e comprometterebbe l'integrità del tetro.

Ora inserire delicatamente l'altra estremità dei quattro fili nei rispettivi fori della scheda di interfaccia dell'elettrodo utilizzando pinzette con punta morbida. Ancora una volta, evitare di piegare o danneggiare i fili. Con tutti e quattro i fili posizionati, inserire i perni dorati nei loro fori utilizzando una pinza con mascella inferiore accorciata.

Quando i perni vengono inseriti nei fori, rimuoveranno l'isolamento dei fili e creeranno una connessione elettrica per riferimenti successivi. Tenere traccia della corrispondenza tra microdrive e posizione dei perni sulla scheda di interfaccia dell'elettrodo. Continuare a caricare un totale di 18 tetroidi.

I tre microdrive rimanenti sull'array verranno utilizzati per alloggiare gli elettrodi di riferimento. Ogni elettrodo di riferimento è costituito da un tero che utilizza soltanto uno dei quattro yns non legati. Per fissare gli elettrodi di riferimento, seguire la procedura di caricamento, ma collegare soltanto uno dei quattro elettrodi al rispettivo piedino dell'elettrodo di riferimento sulla scheda del connettore.

Se si prevede di effettuare registrazioni in più sedi, potrebbe essere utile pianificare in anticipo le connessioni dai teros alla scheda connettore. Ad esempio, raggruppare i tetri destinati a una stessa regione anatomica sulla scheda di interfaccia degli elettrodi. Questo accorgimento dovrebbe ridurre al minimo la possibilità di regolare il tetro sbagliato durante gli esperimenti.

Una volta completato il caricamento del tero, preparare due cavi di massa, uno per l'animale e uno per il cono di protezione. Tagliare un filo d'acciaio isolato lungo sei pollici e rimuovere tre millimetri di isolamento da ciascuna estremità del filo utilizzando pinzette metalliche. Quindi tagliare un filo d'acciaio isolato lungo quattro pollici.

Rimuovere tre millimetri di isolamento da un'estremità e un centimetro dall'altra estremità. Far passare il cavo di massa di sei pollici attraverso il foro sul lato dell'array del microdrive e verso l'alto in direzione della scheda di interfaccia. Collegare il filo scoperto alla scheda di interfaccia dell'elettrodo mediante un perno d'oro nel foro di massa designato.

Questo filo sarà collegato al cranio dell'animale. Posizionare il filo di massa da quattro pollici in parallelo al filo di massa precedentemente installato. Collegare l'estremità sguainata di tre millimetri alla scheda di interfaccia dell'elettrodo utilizzando un perno d'oro in un altro foro di massa designato.

Questo filo verrà successivamente collegato a un cono protettivo, che fungerà da piccola gabbia di Faraday per ridurre il rumore indotto. Abbiamo ora terminato il collegamento dei fili e possiamo procedere con l'affinamento dei nostri teros. Il nostro obiettivo in questo processo è tagliare tutti i teros in modo che siano leggermente più lunghi della profondità della struttura cerebrale bersaglio e del nostro esempio.

I microdrive sono progettati per un movimento massimo di cinque-sei millimetri, sufficiente per raggiungere numerose aree della neocorteccia e l'ippocampo dorsale di un ratto adulto. Innanzitutto, abbassare tutti i microdrive in modo che i tetrodi siano completamente esposti contemporaneamente. Tagliare tutti i tetrodi a una lunghezza di circa cinque millimetri superiore alla lunghezza finale desiderata, utilizzando un paio di forbici fini e affilate per il taglio finale.

Preparare un paio di forbici seghettate in un contenitore di ghiaccio, fissare un manico con un leggero angolo verso il basso e con le seghettature rivolte verso l'alto, lasciando l'altro manico libero. Ora completamente sospeso, ritirare completamente tutti i Tet roads all'interno delle loro cannule guida ruotando i microdrive verso l'alto. Utilizzando uno stereomicroscopio, estendere completamente un tero fuori dalla sua cannula.

Utilizzando un righello, posizionare le forbici seghettate alla distanza desiderata dalla guida verso la cannula. Tagliare lentamente e delicatamente il tero con un unico movimento fluido. Dopo aver tagliato questo tero, ritirare il microdrive verso l'alto di tre o quattro millimetri.

Ripetere questo processo per ogni tero fino a quando non sono stati tutti tagliati. A questo punto, si è pronti per la placcatura in oro. Placcatura in oro.

Il ro teros è fondamentale per registrazioni stabili a lungo termine. Impedisce la corrosione e migliora la biocompatibilità. Configurare l'impedenzimetro in modalità esterna nel generatore di corrente e in modalità controllo DC con uscita audio.

Toccare i due puntali del generatore di corrente alle sei coppie possibili di canali all'interno di ogni tero e utilizzare il feedback audio per determinare se esistono cortocircuiti tra le coppie. Un cortocircuito tra coppie di canali produce un suono di questo tipo. Se è presente un cortocircuito, ritagliare nuovamente il tero con forbici seghettate e ripetere il test.

Se il problema persiste, scartare il Tet road e sostituirlo. Spostare tutti i microdrive verso il basso, estendendo tutti i Tet road il più possibile verso l'esterno. Modificare la configurazione dell'equipaggiamento per verificare l'impedenza dell'elettrodo.

Ora immergere le punte di tutti i teros in un bagno di soluzione standard per la placcatura in oro. Il bagno di oro è collegato elettricamente al morsetto negativo del misuratore di impedenza. Verificare l'impedenza dell'elettrodo toccando il morsetto positivo del misuratore di impedenza con il relativo pin sulla scheda di connessione.

Misurare e registrare l'impedenza di ogni filo nell'array del microdrive. I valori normali variano da uno a tre megaohm sul generatore di corrente. Impostare la corrente tra uno e tre microampere.

Successivamente, collegare saldamente il cavo positivo del misuratore di impedenza al piedino sulla scheda del connettore. Sul misuratore di impedenza.

Passare rapidamente dalla modalità normale alla modalità di bypass e viceversa mentre ci si trova in modalità di bypass. La corrente passerà attraverso il percorso in tet e la soluzione d'oro, e l'oro verrà depositato sulla punta dell'elettrodo. L'impedenza dopo ogni ciclo di deposizione dovrebbe essere inferiore rispetto a prima.

Ripetere l'impulso di corrente. Se l'impedenza non è scesa al di sotto di un megaohm. Un intervallo conservativo di impedenze accettabili è compreso tra 250 chiloom e 350 chiloom.

Se l'impedenza scende al di sotto di 200 chiloohm, ciò potrebbe indicare un cortocircuito. Se dopo ripetuti impulsi l'impedenza non diminuisce sufficientemente, la punta dell'elettrodo potrebbe essere ostruita. Ricutare il tero, verificare la presenza di cortocircuiti e ripetere il processo di placcatura in oro.

Se il ritaglio non aiuta, sostituire il tero e ricominciare. Dopo aver piastrato tutti i tero, immergerli nell'etanolo e lasciarli asciugare per tre-cinque minuti. Verificare la presenza di cortocircuiti all'interno dei tero utilizzando il generatore di corrente con le punte dei tero esposte all'aria.

Se esiste una connessione in corrente continua tra due o più elettrodi di un tero, ritagliare il tero e rivestirlo nuovamente con oro. Una volta completato il rivestimento in oro di tutti i tero, trasferire tutti i tero all'interno del drive. Come passaggio finale nella parte superiore di ciascun microdrive, aggiungere una goccia di colla cianoacrilica di spessore medio all'interfaccia tra ogni tero e il suo tubo in polimero.

Questo fissa il tero al suo microdrive. Lo scopo del contenitore protettivo è quello di proteggere i microdrive e il filo del tero esposto dall'ambiente. Fornisce inoltre un supporto per la manipolazione durante un esperimento e riduce il rumore elettrico.

Utilizziamo un cono in plastica stampato in 3D. Tuttavia, è possibile realizzare il cono con altri materiali, come un pezzo di lattina piegato. Si può prendere il cono di plastica e fissare del nastro in foglio di alluminio sulla superficie interna o esterna.

Inserire e ruotare parzialmente 3 viti di dimensione 72, lunghe tre sedicesimi di pollice, nei lati del cono con l'array di trasduttori sospeso. Inserire il cono sopra il trasduttore. Assicurarsi che entrambi i cavi di massa fuoriescano dalla parte inferiore dell'array di trasduttori.

Avvolgere la parte esposta del cavo di massa da quattro pollici intorno a una delle due viti da 1,72 per diverse volte e stringere saldamente la vite. Fissare saldamente il cono alla base del motore serrando le altre due viti del cono. La produzione dell'array microdrive è ora completata. Il vostro array microdrive è caricato con 18 teros in tre riferimenti.

È racchiuso in un cono e un cappuccio protettivi per garantire durata. L'unità finita pesa di solito da 20 a 25 grammi, in media.

L'array di elettrodi viene impiantato utilizzando una procedura chirurgica standard. Come si può vedere, l'array è collegato a un chip preamplificatore e a un fascio di fili che trasmettono il segnale all'hardware e al software di acquisizione dati. Abbiamo appena mostrato come realizzare i teros e completare la procedura di costruzione dell'array di microelettrodi.

In questo video, ti abbiamo mostrato come fabbricare i teros, caricarli e condizionarli per la registrazione in vivo. Inoltre, ti abbiamo illustrato come aggiungere un cono all'array del microdriver per renderlo più resistente nel tempo. La costruzione dell'array del microdriver prevede molti passaggi, quindi sii paziente, maneggia con delicatezza gli elettrodi e assicurati che tutti i passaggi intermedi siano completati correttamente.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.