Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

Questa procedura inizia rimuovendo eventuali detriti dall'influenza. Una soluzione virale per centrifugazione. La membrana virale viene quindi disgregata con il detergente e il rilascio in VR nps viene separato su un gradiente di glicerolo.

Le frazioni di centrifugazione dal gradiente vengono raccolte e viene eseguita un'aliquota di ciascuna frazione. Su una pagina SDS, i gel colorati con blu kumasi per determinare le frazioni di picco contenenti le frazioni V nps contenenti V NPS vengono quindi concentrati mediante centrifugazione e i VRP purificati vengono applicati a una griglia di campioni TEM in rame, che viene quindi colorata negativamente per la visualizzazione dei VRP mediante microscopia elettronica a trasmissione. Ciao, sono WinCo Wu nel laboratorio della dottoressa Nellie Pane nel Dipartimento di Zoologia dell'Università della British Columbia.

Sono Lindsay Weaver, ex Pane Lab. Oggi vi mostreremo una procedura per la purificazione dell'influenza, un complesso proteico nucleo virale della costola. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'importazione nucleare del virus dell'influenza A nelle cellule di coltura tissutale.

Quindi iniziamo. Per iniziare l'esperimento, 750 microlitri di tampone MNT in una provetta da centrifuga in policarbonato Beckman da 11 millimetri per 34 millimetri. Quindi, aggiungere 500 microlitri di una soluzione di due milligrammi per millilitro di virus influenza, A nella pipetta della provetta su e giù più volte per mescolare il virus con il tampone MNT.

Dopo la miscelazione, posizionare la provetta nel rotore A TLA one 20.2 e centrifugare in una centrifuga Beckman Optima max E per 10 minuti a 109.000 volte G a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifuga, rimuovere il surnatante, quindi risus, sospendere il pellet in un vortice tampone di rottura da 500 microlitri. Il pellet risospeso energicamente e poi agitare a 31 gradi Celsius per 20 minuti in un termo miscelatore einor.

Al termine dell'agitazione, procedere con la centrifugazione a velocità di sedimento in gradiente di glicerolo. Per preparare il gradiente di glicerolo, inserire il seguente di glicerolo in una provetta da centrifuga Beckman UltraClear da 13 millimetri per 51 millimetri, un millilitro 70% di volume in volume, GLICEROLO 0,75 millilitri, 50% glicerolo 0,375 millilitri, 40% glicerolo e 1,8 millilitri, 33% di glicerolo. Queste soluzioni di glicerolo sono prodotte mescolando glicerolo puro con tampone NM.

Preparare anche una provetta contenente sia glicerolo che tampone. Quindi agitare nuovamente il campione virale interrotto e caricarlo sul gradiente di glicerolo. Posizionare la provetta in un rotore a secchiello oscillante Beckman MLS 50 e centrifugare il gradiente per tre ore e 45 minuti a 217.000 volte G a quattro gradi Celsius.

Al termine della centrifugazione, prelevare manualmente 250 aliquote da microlitro del gradiente partendo dalla parte superiore della provetta. Mantieni le frazioni sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius. Una volta raccolte le frazioni, siamo pronti per analizzarle utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS.

Per iniziare l'analisi della pagina SDS, rimuovere 20 microlitri da ciascuna frazione in una provetta nuova. Quindi aggiungere cinque microlitri di tampone campione per pagina SDS cinque volte e riscaldare il campione a 95 gradi Celsius per cinque minuti Dopo il riscaldamento, centrifugare brevemente i campioni e caricarli su un gel di poliacrilammide al 10% che include marcatori di peso molecolare in uno dei pozzetti. Quindi, far scorrere i campioni attraverso il gel fino a quando il colorante di caricamento blu di fenolo di brom raggiunge il fondo del gel.

Rimuovere il gel dall'apparecchio della pagina SDS e colorare il gel con il blu kumasi. Sulla base dei risultati della colorazione, identificare le frazioni che contengono principalmente l'influenza. Una proteina nucleo.

L'influenza A NP ha una dimensione di circa 56 kilodalton ed è la principale proteina presente nei complessi ribonucleoproteici virali. Quindi la banda NP è generalmente la banda più forte nelle frazioni contenenti il VRN ps. Nella parte successiva, concentreremo queste frazioni VRNP.

Combinare le frazioni di glicerolo contenenti principalmente NP e distribuirle in due provette da centrifuga in policarbonato Beckman da 11 millimetri per 34 millimetri riempire ogni provetta con pirocarbonato di etile o acqua ultrapura trattata con DEPC. Quindi pipettare su e giù più volte per mescolare. Posizionare le provette in un rotore Beckman TLA one 20.2 e centrifugare per quattro ore e mezza a 157.000 volte G a quattro gradi Celsius.

Al termine della centrifuga, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet. In 50 microlitri di aliquota di acqua trattata con DEPC, il V NPS purificato mette da parte un'aliquota e conserva le altre a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Ora siamo pronti per procedere con la colorazione negativa dei VRP.

Diluire un microlitro di VRNP purificato in nove microlitri di bagliore tampone PBS appena fatto e filtrato due volte, scaricare una griglia di campioni TEM di rame per 30 secondi. Questa griglia è stata precedentemente rivestita con un Parlow Dion e una pellicola di carbonio. Usando una pinzetta per tenere la griglia del campione appena illuminata, applicare una goccia di cinque microlitri di VRNP diluito sulla griglia del campione.

Lascia che la goccia si assorba sulla griglia per otto minuti durante l'attesa. Metti una piccola striscia di profumo in un vassoio, quindi eroga sul profumo due gocce contenenti 10 microlitri ciascuna di tampone PBS, oltre a una goccia da 80 microlitri della soluzione colorante appena preparata, composta dall'1% di dattero meli di ammonio. Lavare ora la griglia del campione calandola con cura nelle due gocce di PBS per un tempo totale di un minuto.

Quindi utilizzare un pezzo di carta da filtro per rimuovere parte della soluzione del campione dalla griglia del campione senza lasciare asciugare la griglia del campione. Immediatamente dopo aver rimosso l'ultima goccia di tampone dalla griglia del campione, immergere completamente la griglia del campione all'interno della gocciolina di colorazione. E aspetta un minuto.

Dopo un minuto, utilizzare un nuovo pezzo di carta da filtro per rimuovere completamente la soluzione colorante dalla griglia del campione. Lasciare asciugare la griglia del campione all'aria per diversi minuti prima dell'osservazione. Sotto un microscopio elettronico a trasmissione ecco immagini rappresentative al microscopio elettronico a trasmissione di V nps colorate negativamente.

Come puoi vedere qui, le V NPS assomigliano a particelle a forma di bastoncino con lunghezza variabile che vanno da circa 30 nanometri a 120 nanometri di lunghezza. La NP oligomerica è organizzata come una catena di molecole di NP che viene ulteriormente ripiegata in una struttura ripetuta a doppia elica. Quindi a volte si possono vedere anelli su entrambe le estremità di queste particelle a forma di bastoncino.

Ti abbiamo appena mostrato come purificare e visualizzare l'influenza. Un complesso nucleoproteico virale della costola Quando si esegue questa procedura. È importante non utilizzare PBS quando si diluisce il VR mps se si utilizza l'acetato di orinatoio per la colorazione negativa.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.