Visivamente monitoraggio Odore mediata durante il volo in Drosophila

Gli insetti volanti utilizzano indizi visivi per stabilizzare la loro direzione di volo in una corrente d'aria. Pertanto, la stabilizzazione visiva del percorso controvento contribuisce direttamente al seguire una traccia odorosa. Utilizzando un apparato olfattivo con vincolo magnetico, o OMT, possiamo esaminare se gli indizi visivi influenzino direttamente il comportamento di seguire una traccia odorosa, indipendentemente dagli indizi anemotattici.

La procedura inizia ottimizzando l'illuminazione della mosca regolando l'intensità di un LED a infrarossi per ottenere un'immagine chiara della mosca. Una luminosità insufficiente produrrà un'immagine scarsamente visibile, mentre un'eccessiva luminosità porterà a un'immagine sovrasatura una volta che la mosca viene correttamente ripresa. Un software di analisi misura in tempo reale l'angolo del corpo; spostando visivamente la mosca all'interno di una nube di odore di cibo, si ottiene un orientamento costante verso la posizione spaziale della nube.

Mais solo quando il panorama visivo contiene forti indizi visivi. Sottoponendo la stessa mosca a un test in un'arena visiva con luminanza media uguale, ma priva di bordi visivi, si ottiene un scarso inseguimento della scia, poiché la mosca perde l'orientamento spaziale. Ciao, sono Brian DeMars del laboratorio del Dott. Mark Fry del Dipartimento di Scienze Fisiologiche dell'Università della California di Los Angeles.

Oggi vi mostreremo come acquisire e ottimizzare immagini video per analizzare l'angolo del corpo in un apparato magnetico vincolato olfattivo. Descriveremo inoltre due esperimenti per esaminare l'influenza dei segnali visivi sul seguire l'odore. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il controllo del volo mediato da stimoli visivi e olfattivi nei moscerini della frutta.

Iniziamo. Ottimizzare l'immagine video è fondamentale per la qualità dei dati acquisiti, al fine di ottenere immagini più pulite. Posizionare innanzitutto una mosca appena fissata nell'arena utilizzando una pinzetta.

Successivamente, posizionare la videocamera con scheda firewire sotto la camera a vuoto in acrilico trasparente in modo che la telecamera sia rivolta direttamente verso l'alto attraverso la camera e il tubo di vetro a vuoto, fino all'aspetto ventrale della mosca fissata. Assicurarsi che non vi sia alcun filtro infrarosso sulla lente del sistema video. Per illuminare la mosca, utilizzare un array circolare di LED infrarossi, posizionati appena al di sotto dei pannelli LED.

Concentrare ogni LED singolarmente sul corpo della mosca per ottenere un'illuminazione uniforme, riducendo così l'abbagliamento proveniente dal sistema di pannelli e minimizzando gli stimoli visivi percepiti dalla mosca. È utile ricoprire tutte le superfici riflettenti entro il campo visivo della telecamera con vernice nera opaca; le luci della stanza devono essere spente per ridurre l'abbagliamento e le modulazioni di luminosità rilevabili dall'occhio della mosca. Successivamente, ispezionare visivamente la telecamera.

Il moscerino dovrebbe apparire bianco brillante su uno sfondo nero. Se l'immagine è sfocata, potrebbe essere necessario mettere a fuoco l'obiettivo. Se il moscerino appare scuro, l'array di LED potrebbe non essere a fuoco o non ricevere alimentazione sufficiente per una corretta illuminazione.

Infine, acquisire il video utilizzando subroutine personalizzate scritte in MATLAB con il toolbox di acquisizione immagini. Un esperimento semplice nell'OMT consiste nell'osservare una mosca a digiuno mentre localizza e segue attivamente un pennacchio di odore attraente di cibo. Questi esperimenti vengono tipicamente eseguiti in un formato a blocchi casuali per minimizzare eventuali bias nell'ordine sperimentale.

Modificando l'ambiente visivo, è possibile influenzare la capacità della mosca di seguire un odore. Per eseguire questo esperimento, posizionare una mosca appena fissata nell'arena utilizzando una pinzetta prima di ogni esperimento; utilizzando il display visivo, ruotare la mosca per diverse rivoluzioni per assicurare un movimento uniforme lungo tutto l'asse YA di 360 gradi. Scartare la mosca se non ruota in modo uniforme.

Se il problema persiste, i magneti potrebbero essere disallineati. Successivamente, presentare alla mosca le seguenti condizioni sperimentali. In ordine casuale, un modello a strisce ad alto contrasto con vapore acqueo proveniente dalla porta dell'odore.

Un modello a strisce con alto contrasto e vapore di odore attraente. Una singola striscia verticale sfalsata di 90 gradi rispetto al porto dell'odore, con vapore acqueo, e una singola striscia sfalsata di 90 gradi con vapore odoroso a intervalli di 32° funzionano bene per esperimenti in cui i moscerini devono individuare autonomamente la fonte dell'odore. Acquisire video a 30 hertz per tutta la durata di ogni condizione sperimentale e utilizzare MATLAB per analizzare le immagini in modalità offline. Quando si utilizzano concentrazioni elevate di odore, potrebbe essere rilasciato odore residuo dal porto dell'odore dopo lo spegnimento dell'erogazione; tale effetto va minimizzato.

Questo può far ruotare la mosca per alcuni secondi con un panorama rotante, permettendo al sistema di eliminare qualsiasi odore residuo. Aiuta inoltre a ruotare visivamente la mosca tra i diversi trattamenti sperimentali. Questo mantiene le mosche attivamente coinvolte nell'esperimento e impedisce loro di rimanere ferme in un unico punto.

Un secondo esperimento fondamentale nell'OMT consiste nel trascinare visivamente una mosca all'interno di una scia di odore, cambiare istantaneamente le condizioni visive e quindi misurare la sua capacità di rimanere nella scia. Gli esperimenti vengono eseguiti in un formato a blocchi casuali per minimizzare eventuali bias nell'ordine sperimentale. Utilizzando pinzette, posizionare una mosca appena fissata nell'arena.

Successivamente, come controllo diagnostico, ruotare visivamente la mosca più volte all'interno dell'arena. Questo garantisce che l'animale abbia la capacità di orientarsi in ogni direzione. Prima di ogni condizione, attivare l'odore sperimentale, acqua o aceto, e trascinare visivamente la mosca all'interno del pennacchio oscillando una piccola striscia verticale nella posizione del pennacchio.

Ora che la mosca è orientata verso la nube, rimuovere la striscia oscillante. Quindi presentare le seguenti condizioni visive: strisce panoramiche ad alto contrasto con vapore acqueo, sfondo uniforme con vapore acqueo, strisce panoramiche ad alto contrasto con vapore di odore e sfondo uniforme con vapore di odore.

Acquisire video a 30 hertz per tutta la durata di ciascuna condizione sperimentale. Successivamente, utilizzare routine software personalizzate scritte in MATLAB per analizzare le immagini in modalità offline. Quando si ottimizza l'immagine video del TOM, ricordare che deve mostrare chiaramente la mosca illuminata su uno sfondo nero scuro.

Le immagini eccessivamente luminose possono essere migliorate riducendo l'interferenza di fondo, diminuendo l'intensità dei LED a infrarossi o spegnendo le luci della stanza. Se la mosca è correttamente illuminata, regolando il fuoco dei LED a infrarossi o modulandone l'intensità si potrebbe risolvere il problema.

Quando si mette alla prova una mosca chiedendole di individuare da sola un pennacchio odoroso, non dovrebbe mai localizzare in misura significativa un pennacchio di vapore acqueo, ma dovrebbe sempre localizzare un pennacchio odoroso in presenza di ricchi indizi visivi panoramici. Un secondo test consiste nel trascinare visivamente la mosca direttamente all'interno di un pennacchio odoroso e verificarne la capacità di mantenere la direzione all'interno del pennacchio contro una varietà di sfondi visivi fissi. Se la mosca viene trascinata in un pennacchio di vapore acqueo, dovrebbe girarsi rapidamente verso l'esterno.

Se la mosca viene trascinata all'interno di una scia di odore e sono presenti stimoli visivi sufficienti a garantire un inseguimento efficace, la mosca rimarrà all'interno della scia. Vi abbiamo appena mostrato come ottimizzare l'immagine video acquisita per un apparato olfattivo con treno magnetico. Abbiamo inoltre descritto due protocolli sperimentali per esaminare l'influenza degli stimoli visivi sull'inseguimento dell'odore.

Quando si eseguono questi esperimenti, è importante ricordare che l'ottimizzazione dell'immagine video è fondamentale per la qualità dei dati acquisiti. Inoltre, indipendentemente dal protocollo sperimentale, è essenziale mantenere le mosche in buone condizioni e attivamente coinvolte. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.