Name: Misura Vicino membrana plasmatica e Global Dynamics calcio intracellulare negli astrociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Scopri come misurare la dinamica del calcio globale e vicino alla membrana plasmatica negli astrociti utilizzando la microscopia a fluorescenza e a riflessione totale interna. Questo metodo permette di osservare simultaneamente i segnali calcici in colture miste astrociti-neuroni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Memorial Uehara del Giappone (ES) e la Fondazione Whitehall, del National Institute of Neurological Disorder and Stroke e un Stein-Oppenheimer Premio Endowment (a BSK).

Procedure sperimentali La procedura sperimentale consiste di due parti principali che sono descritti in maniera saggia passo sotto. Parte 1: PREPARAZIONE CULTURE astrociti dell&#39;ippocampo In breve, misto astrociti-neuroni dell&#39;ippocampo culture sono state preparate utilizzando un protocollo ben definito 1,2,3. Abbiamo ottimizzato il procedimento per produrre sano astrociti in coltura. Tutte le procedure di seguito elencati deve essere effettuata in un ambiente sterile come una cappa a flusso laminare. Coprioggetto preparazione <ul><li> Coprioggetto 22 mm (VWR, 48380-068) </li><li> Poli-D-lisina (PDL, Sigma P0899), aliquote (1 mg / ml) </li><li> Laminina aliquote (20 mg / ml): aggiungere 49 ml di acqua sterile a 1 mg / ml soluzione laminina (Sigma L2020), fanno aliquote da 1,2 ml e conservare a -20 ° C </li></ul><ol><li> Sciogliere PDL in acqua sterile (50 mg / ml) </li><li> Autoclave i coprioggetti, sciacquare con acqua sterile e posto in PDL (20 ml per 100 lamelle). Lasciare a temperatura ambiente per una notte. </li><li> Sostituire il PDL con acqua sterile (3 lavaggi estensiva). Poi asciugare i coprioggetti e conservare a 4 ° C. </li><li> Il giorno prima della placcatura astrociti, coprioggetto posto individuale in un pozzo sterile su un 6-pozzetti (pozzetti a fondo piatto Piatti con coperchio, sterile da BD Bioscience). Mettere 400 ml di laminina su ogni coprioggetto e incubare una notte, in incubatrice per evitare l&#39;evaporazione. </li></ol> Dissezione Dissezione dei media: <ul><li> 500 ml di Earle soluzione salina bilanciata (EBSS) (1X), liquido (Invitrogen, 14155-063) </li><li> HEPES 5 ml di soluzione (Sigma, H0887) </li></ul> Mezzi di comunicazione dell&#39;ippocampo: <ul><li> 412,5 ml di media minima essenziale (MEM) (1X), liquido Contiene sali di Earle, ma non rosso L-glutammina o fenolo (Invitrogen, 51200-038) </li><li> 10 ml di glucosio (Sigma, D-(+)-glucosio anidro SIGMA ULTRA G7528) 1 M a MEM </li><li> 5 ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 5 ml di soluzione di sodio piruvato (Sigma, S8636) </li><li> 12,5 ml HEPES soluzione 1 M (Sigma, H0887) </li><li> 5 ml N-2 Supplement (100X), liquido (Invitrogen, 17502-048) </li><li> 50 ml di siero di cavallo, inattivato per calore (Invitrogen, 26050-088) </li></ul> Papaina soluzione: <ul><li> Aggiungere 5 ml di dissezione dei media in Worthington papaina-022 flaconcino (LK003178; concentrazione finale, 20 U / ml) e incubare a 37 ° C per 60 min. </li></ul><ol><li> Decapitare ratti di età compresa tra P1 (in genere 2 cuccioli) le linee guida controllati e approvati dalla normativa nazionale e Cura il tuo locale degli animali e del Comitato Istituzionale Usa. </li><li> Togliere la pelle e il cranio e il cervello posto nella piastra di Petri riempite con i media dissezione a freddo. </li><li> Rimosso meningi, sezionare entrambi gli emisferi e sezionare dell&#39;ippocampo. </li><li> Tritate la dell&#39;ippocampo in ~ 1X1 pezzi mm e digerire in soluzione papaina a 37 ° C per 11-13 minuti. </li><li> Una volta che i pezzi di tessuto sono insediati, rimuovere la papaina con cura e aggiungere 5 ml di terreno dell&#39;ippocampo a rimuovere tutte le tracce di un enzima. Ripetere questo passaggio e risospendere in media dell&#39;ippocampo (2 ml). </li><li> Triturare le cellule ~ 5 volte fino a quando non ci sono grumi sinistra, con tre fiamma lucido pipette di fori progressivamente più piccoli (1000 micron, ~ 500 micron e ~ 300 micron). </li><li> Una volta triturato, le cellule passano attraverso un filtro cella (dimensione dei pori, 70 micron, BD Bioscience). Contare le cellule in 10 ml di sospensione. Regolare il volume di terreno dell&#39;ippocampo in modo da avere 400000 cellule / ml. </li><li> Aspirare il laminina fuori i coprioggetti, e prima che le coperture possono asciutto, piatto 200 microlitri della sospensione cellulare per coprioggetto. </li><li> Lasciateli per attaccare per 60 minuti in incubatrice, e poi aggiungere 2 ml di terreno dell&#39;ippocampo per bene. </li><li> Il giorno successivo, aspirare vecchi media dell&#39;ippocampo per rimuovere le cellule morte e detriti e aggiungere 2 ml di pre-riscaldato terreno fresco dell&#39;ippocampo. </li></ol> Manutenzione Mezzi di comunicazione Neurobasal: <ul><li> 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017) </li><li> 10 ml di siero B27 supplemento gratuito (Invitrogen, 17504-044) </li><li> 5 ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 1,25 ml L-glutamina (Invitrogen, 25030-149) </li></ul> Feed the culture astrociti-neuroni due volte alla settimana con il mezzo neurobasal, a partire da quattro giorni dopo la placcatura. Preincubare i media di circa 30 minuti in incubatrice in un pallone ventilato per equilibrare la temperatura e CO 2. Parte 2: IMAGING DI CALCIO Registrazione dell&#39;ippocampo tampone: 110 mM NaCl, 5.4 mMKCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl 2, 10 mM D-glucosio, 10 mM HEPES (Tutti i prodotti chimici da Sigma), pH 7.4 (corretto con NaOH). Caricamento indicatore colorante calcio in astrociti <ol><li> Posizionare la cultura in un bene su un 6-pozzetti riempiti con 2 ml di buffer di registrazione dell&#39;ippocampo contenente 2,5 mM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) e 0,05% Pluronic soluzione ® F-127, il 20% in DMSO (Invitrogen, P-3000MP) e incubare a temperatura ambiente per 10-30 min. </li><li> Rimuovere Fluo-4 soluzione e lavare coprioggetto 3 volte con buffer di registrazione dell&#39;ippocampo e incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Posizionare il coprioggetto sulla camera, e pulire il lato del vetrino con il liquido per pulire le lenti. </li><li> Metti una piccola goccia di olio da immersione (olio DF immersione TIPO da Cargille) l&#39;obiettivo e mettere da camera (camera aperta per 25 coprioggetto tondo mm dalla Warner Instruments) sul palco del microscopio (Olympus IX71). </li><li> Guarda le cellule usando la luce di trasmissione per vedere come le cellule aspetto, e portarli a fuoco. Poi illuminare le cellule con 488 nm da un monocromatore (policroma V da TILL Vision) e determinare se il segnale di fluorescenza di Fluo-4 è uniforme e rilevabile negli astrociti. </li><li> Usa EPI e TIRF illuminazione per misurare il calcio negli astrociti. </li></ol> Microscopia TIRF In breve, usiamo un microscopio Olympus IX71 dotato di una fotocamera IXON Andor DV887DCS EMCCD. Il controllo di eccitazione e di acquisizione delle immagini è ottenuta utilizzando un software TILLVision. Le travi di 454/488/515 nm Argon (100 mW) e 442 nm allo stato solido (45 mW) i laser sono combinati e controllati con una FINO Polilinea laser combinatore, TIRF porta a condensatore a doppio e acoustoptical filtro sintonizzabile e controller (AOTF; tutto da FINO Photonics) e inseriti in una fibra Kineflex a banda larga per l&#39;ingresso nel condensatore TIRF. Usiamo un Olympus 60X 1,45 lente NA per raggiungere TIRF. Il guadagno della telecamera è adeguato, per ogni astrociti per fornire il miglior segnale al rumore delle immagini. Lo sfondo ed i principi della microscopia TIRF sono state recentemente recensione 4, 5. La maggior parte dei componenti ottici che utilizziamo sono stati acquistati da TILL Photonics, che ora fa parte di Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). La profondità di penetrazione TIR può essere calcolato dalle equazioni di seguito. <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="Equazione" /> d = profondità di penetrazione n1 = indice di rifrazione del vetro n2 = indice di rifrazione di cellule un angolo di incidenza = NAi = apertura numerica di incidenza Al fine di garantire il laser è allineato in modo ottimale per TIRF riteniamo utile osservare 100 nm perline fluorescenti (Invitrogen, F8803). Vi presentiamo fotogrammi e video di perline con EPI e microscopia TIRF. Quando nel TIRF, si osserva un aumento drammatico nel rapporto segnale-rumore e le perline visualizzazione diffusione browniano. Per noi è utile osservare il comportamento di 100 nm con perline microscopia TIRF su base regolare (~ una volta a settimana) per essere sicuri che TIRF ottimale si verifica, piuttosto che l&#39;illuminazione compromessa obliqua che si verificherebbe se l&#39;angolo critici non sono stati pari a α (vedi Fig. 1). Applicazione di agonisti accoppiata G-proteina recettore Astrociti esprimono una varietà di Gq recettori accoppiati 6, 7 tra cui i recettori metabotropici del glutammato e recettori P2Y (agonista, ATP, ADP). L&#39;attivazione di questi recettori porta ad un aumento significativo dei livelli intracellulari di calcio in astrociti. Per esempio, si può facilmente osservare prospetti del calcio intracellulare durante l&#39;applicazione di ATP (30 mM) a 8-10 astrociti. Usiamo una soluzione rapida switcher da Warner Instruments chiamato VC-77SP Fast-Passo del sistema di perfusione (http://www.warneronline.com/index.cfm). Con questo metodo le soluzioni possono essere applicate in meno di ~ 10 ms. <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="Figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> Cartoon FIGURA 1. Fotografie e immagini del set up. A. mostra una fotografia del microscopio montato su un airtable, mentre (B) mostra una fotografia del gruppo laser, controllori e scatole fascio. C. Mostra una fotografia della scena microscopio con la camera montata per l&#39;imaging. A sinistra il dispositivo di perfusione veloce può essere visto (insieme con il motore passo-passo e tubi theta). Sulla destra il headstage di un amplificatore Axopatch 200A è visto. Il fumetto schematizza il percorso della luce nel set up e come TIRF è raggiunto. Il laser viene focalizzato sul piano focale posteriore della lente dell&#39;obiettivo 60X 1,45 NA e la sua posizione viene regolata fuori centro in modo che emerge in olio da immersione al α angolo critico. A questo punto il fascio soffre di riflessione interna totale e decade con una distanza λ (vedi equazione nel testo principale) nel mezzo di indice di rifrazione più basso. In questo caso, questo è il buffer di registrazione che circonda la astrociti e gli astrociti stessi. Il risultato è eccitazione ottica (e quindi immagini) di molecole all&#39;interno di ~ 100 nm della membrana plasmatica. Nel cartone animato della cellula, viene visualizzato come verde &quot;eccitato&quot; recettori di membrana, mentre quelli all&#39;interno della cellula o sulla superficie superiore della cella non sono entusiasti. Un resoconto completo di microscopia TIRF è stata fornita da Steyer e Almers 4. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="Figura 2" /> FIGURA 2. Immagini di 100 nm perline fluorescenti acquisito con EPI e microscopia TIRF. A. mostra le immagini EPI di un campo di vista con diverse decine di 100 nm perline fluorescenti. Il punto rosso frecce per perline che si sono insediati sul vetrino di vetro, mentre le frecce blu indicano che sono perle di diffusione in acqua. B. mostra un&#39;immagine TIRF dello stesso campo di vista, come mostrato in A. In questa visione solo le perle aderente mostrato dalle frecce rosse sono visibili. Questo perché questi si erano stabiliti sulla coverlsip vetro e sono stati pertanto nel campo 100 nm ~ evanescente. Le perle mostrato in A con frecce blu non sono in questa regione e sono quindi invisibili nelle immagini TIRF. I grafici mostrano inferiore rendering 3D delle immagini. E &#39;chiaro che un forte aumento del rapporto segnale-rumore si verifica per perline all&#39;interno del campo evanescente quando osservate al microscopio TIRF. Infatti per queste immagini il rapporto segnale-rumore per EPI è stato 7,1 ± 0,6, mentre per TIRF era 20 ± 0,7. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="Figura 3" /> FIGURA 3. Immagini di astrociti caricato con Fluo-4 colorante indicatore di calcio acquisito con EPI e microscopia TIRF. A. EPI immagini di un campo di vista con cinque astrociti. B. Una immagine TIRF dello stesso campo di vista mostrato in B. Nota che le immagini in A e B sono significativamente differenti. Questo perché con TIRF illuminazione solo le regioni membrana plasmatica in apposizione vicino al coprioggetto di vetro sono ripreso. I pannelli inferiori mostrano ATP-evocate transienti di calcio intracellulare ripreso con EPI e microscopia TIRF.

<ol><li>Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+image+activation+of+transmitter-gated+P2X+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 5, 87-93 (2008).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+hippocampal+neurons+from+P0+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats.</a> J Vis Exp. 19, (2008).</li>
<li>Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+view+of+life+within+100+nm+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+vesicle+fusion+from+lysis+to+monitor+calcium-triggered+lysosomal+exocytosis+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).</li>
<li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signalling+between+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic signalling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li>
<li>Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLIA%3A+listening+and+talking+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GLIA: listening and talking to the synapse.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+excites+interneurons+and+astrocytes+to+increase+synaptic+inhibition+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks.</a> J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+ATP+is+the+predominant+cause+of+intercellular+calcium+waves+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes.</a> J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).</li>
<li>Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li>
<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
<li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
</ol>

E &#39;ben dimostrato che gli astrociti visualizzare prospetti del calcio intracellulare. Questi si verificano spontaneamente, può essere attivato da un&#39;attività neuronale o mediante l&#39;applicazione di agonisti per attivare i recettori sulla superficie astrociti 11. Un tema importante e controverso è se astrociti prospetti del calcio intracellulare può innescare il rilascio di molecole di segnalazione che attivano i recettori sui neuroni 11, 12. Questo è controversa perché c&#39;è stata la prova a favore e contr...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; Micro Cover Slips, Tondi, No. 1</td><td>Strumento</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Idrobromuro di poli-D-lisina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Laminina da membrana basale di sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Salina Bilanciata di Earle&amp;rsquo;s (EBSS) (1X), liquida</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo Minimo Essenziale (MEM) (1X), liquido, contenente sali di Earle&amp;rsquo;s, ma senza L-glutammina né rosso fenolo</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione liquida di Penicillina-Streptomicina</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di piruvato di sodio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di HEPES 1 M</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Integratore N-2 (100X), liquido</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Suero equino, inattivato termicamente</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>Reagente</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo Neurobasal&amp;#8482; (1X) Liquido senza Rosso Fenolo</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Integratore Senza Siero B-27 (50X), liquido</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina-200 mM (100X), liquida</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per cellule</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Multipozzetto BD Falcon a Fondo Piatto con Coperchio, Sterili</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio esaidrato CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Acido HEPES libero</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM 1 mM in soluzione DMSO</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione al 20% di Pluronic&amp;#174; F-127 in DMSO</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Olio di immersione TIPO DF</td><td>Microscopio</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>Camera aperta per coprioggetti tondi da 25 mm, volume 100 &amp;mu;l</td><td>Strumento</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma P-2 per camere Serie 20, senza riscaldamento</td><td>Strumento</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres microsfere modificate con gruppi carbossilici, 0,1 &amp;mu;m, fluorescenti giallo-verdi (505/515), 2% solidi</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

misura vicino membrana plasmatica e global dynamics calcio intracellulare negli astrociti

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Il cervello contiene cellule gliali. Astrociti, un tipo di cellule gliali, sono da tempo noti per fornire un ruolo passivo di supporto ai neuroni. Tuttavia, una crescente evidenza suggerisce che gli astrociti possono anche partecipare attivamente nella funzione del cervello attraverso le interazioni funzionali con i neuroni. Tuttavia, molti aspetti fondamentali della biologia astrociti rimangono controversi, chiari e / o sperimentale inesplorati. Una questione importante è la dinamica dei transitori calcio intracellulare negli astrociti. Questo è importante perché il calcio è così affermato come un importante messaggero secondo e perché è stato proposto che elevazioni di calcio astrociti possono innescare il rilascio di trasmettitori da astrociti. Tuttavia, non vi è stata alcuna descrizione dettagliata e soddisfacente di calcio vicino a membrana plasmatica di segnalazione negli astrociti. Fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia è un potente strumento per analizzare gli eventi di segnalazione fisiologicamente rilevanti all&#39;interno di circa 100 nm della membrana plasmatica delle cellule vive. Qui, usiamo microscopia TIRF e descrivono come monitor vicino membrana plasmatica e globale dinamiche di calcio intracellulare quasi simultaneamente. L&#39;ulteriore perfezionamento e l&#39;applicazione sistematica di questo approccio ha il potenziale per informare sui dettagli precisi della segnalazione calcio astrociti. Una comprensione dettagliata delle dinamiche di calcio astrociti possono fornire una base per capire se, come, quando e perché astrociti e neuroni subiscono interazioni funzionali calcio-dipendente.

Noi descriviamo come misurare vicino a membrana e globale dinamiche di calcio intracellulare negli astrociti in coltura utilizzando riflessione interna totale e epifluorescenza.

Misura Vicino membrana plasmatica e Global Dynamics calcio intracellulare negli astrociti

Il cervello contiene cellule gliali. Gli astrociti, un tipo di cellula gliale, sono noti da tempo per svolgere un ruolo di supporto passivo verso i neuroni. Tuttavia, ...

Nella prima parte di questo video, illustreremo come preparare la coltura cellulare mista di astrociti e neuroni. Per fare ciò, diversi ippocampi di ratti P1 vengono raccolti in un tubo, digeriti con proteasi, dissociati mediante agitazione e quindi seminati su coprivetrini. La seconda sezione mostrerà come misurare la dinamica del calcio intracellulare negli astrociti, procedura che prevede il caricamento del colorante indicatore del calcio fluo-4 negli astrociti e la misurazione della dinamica globale del calcio mediante microscopia epifluorescenza e della dinamica del calcio vicina alla membrana mediante microscopia TIRF.Cambiando automaticamente e rapidamente l'illuminazione, è possibile osservare quasi simultaneamente il calcio globale e quello prossimale alla membrana. Ciao, sono Aji omi, ricercatore postdottorato del laboratorio Budget COS del Dipartimento di Fisiologia dell'Università della California di Los Angeles. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'imaging del calcio negli astociti.Utilizziamo questa procedura nel nostro studio di laboratorio per analizzare la dinamica del calcio vicino alla membrana e quella globale in un osteocita. Modificando rapidamente ed automaticamente l'eliminazione, possiamo risolvere il calcio globale e quello vicino alla membrana. Quasi contemporaneamente, mostrerò come applichiamo un TP per indurre un aumento del calcio nell'astrocita.Concluderò quindi con un riassunto e una discussione sulla barriera con il metodo per lo studio degli astrociti. Cominciamo lo studio. Per avviare la coltura di astrociti, rimuovere la pelle e il cranio dalla testa di un ratto neonato decapitato.Posizionare il cervello in una piastra di Petri riempita con mezzo di dissezione freddo, dissezionare entrambi gli emisferi e rimuovere le meningi. Successivamente, dissezionare gli ippocampi. Tagliare gli ippocampi in pezzi di circa un millimetro per un millimetro.Digerire nella soluzione Pappa a 37 gradi Celsius per 11-13 minuti. Rimuovere il tessuto dissezionato dall'incubatore. Una volta che i pezzi di tessuto si sono depositati, rimuoverli con attenzione dalla digestione in propano e aggiungere cinque millilitri di mezzo ippocampale per lavare i pezzi tritati di hippo Campi.Ripetere questo passaggio e infine risospendere nel mezzo ippocampale. Pipettare le cellule circa cinque volte con tre pipette progressivamente più piccole, levigate alla fiamma. Una volta terminato, far passare le cellule attraverso un filtro cellulare con una dimensione dei pori di 70 micrometri e aggiungere quattro millilitri di mezzo al filtro.Contare le cellule in 10 microlitri di sospensione. Regolare il volume del mezzo ippocampale in modo da ottenere 400.000 cellule per millilitro. Preparare ora le lamelle per la semina della sospensione cellulare aspirando la laminina dalle lamelle, che sono state esposte a una soluzione di laminina durante la notte.Prima che le lamelle si asciughino, piastrare 200 microlitri di sospensione cellulare per ogni lamella. Lasciarle aderire per 60 minuti nell'incubatore. Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri di mezzo ippocampale per pozzetto.Il giorno successivo aspirare il vecchio mezzo ippocampale per rimuovere le cellule morte e i detriti e aggiungere due millilitri di mezzo ippocampale fresco preriscaldato. La manutenzione del mezzo per colture co-colturali di astrociti e neuroni deve iniziare quattro giorni dopo il seeding, aggiungendo un millilitro di mezzo neurobasale fresco due volte alla settimana. Assicurarsi di pre-incubare i mezzi per circa 30 minuti nell'incubatrice in un matraccio ventilato, in modo da equilibrare temperatura e anidride carbonica.Prima di studiare gli astrociti, è utile osservare delle microsfere fluorescenti nano per ottimizzare l'angolo del laser per la tecnica TURF. Per fare ciò, aggiungere 200 microlitri di acqua nella piastra di Petri e un microlitro di microsfere fluorescenti da 100 nanometri, mescolare e osservare le microsfere mediante microscopia a fluorescenza in epifluorescenza. Successivamente, osservare le microsfere mediante microscopia TURF.Per l'immagine del calcio, posizionare la coltura in una pozzetta di una piastra a sei pozzette riempita con due millilitri di buffer di registrazione ippocampale contenente 2,5 micromoli di flu oh 4:00 AM e 0,05% F1 27, soluzione al 20% in DMSO e incubare a temperatura ambiente per 10-30 minuti, ricordandosi di coprire la piastra per evitare lo sbiancamento del fluorocromo. Quattro, rimuovere la soluzione di flu oh quattro e lavare le lamelle tre volte con buffer di registrazione ippocampale. Incubare le lamelle lavate a temperatura ambiente per 30 minuti.Posizionare il vetrino coprioggetto nella camera, pulire l'altro lato del vetrino coprioggetto con liquido per la pulizia delle lenti e aggiungere 200 microlitri di buffer ippocampale. Mettere una piccola goccia di olio di immersione sull'obiettivo e posizionare la camera sul palchetto del microscopio. Osservare le cellule utilizzando la luce trasmessa per mettere a fuoco e verificare l'aspetto delle cellule.Successivamente, illuminare le cellule con 488 nanometri da una sorgente monocromatica e determinare se il segnale fluorescente di flu oh four è uniforme e rilevabile. Negli astrociti, utilizzare l'illuminazione epi e turf per misurare il calcio negli astrociti. Qui, le microsfere fluorescenti vengono osservate mediante illuminazione epi.Oltre a produrre fluorescenza di fondo, mostrano anche un significativo moto browniano in relazione all'angolo di illuminazione. Quando il laser si avvicina all'angolo critico, il fascio laser viene totalmente riflesso dall'interfaccia vetro-acqua. Questa riflessione totale genera un campo elettromagnetico chiamato campo evanescente.Questo presenta una profondità all'interno della cellula con indice di rifrazione inferiore di circa 100 nanometri. È possibile eccitare i fluorocromi in questo sottile strato sulla superficie del campione. Qui sono mostrate delle perle fluorescenti osservate mediante illuminazione in campo chiaro in confronto all'illuminazione in epifluorescenza.Il rapporto segnale-rumore dell'illuminazione aumenta significativamente quando si riduce l'angolo. Il fascio del laser non si riflette sulla superficie e attraversa direttamente il coprioggetto per colpire le perle fluorescenti. È possibile osservare una notevole fluorescenza di fondo.Ora aumentiamo l'angolo. Ancora una volta, il rumore di fondo diminuisce notevolmente e si possono vedere le perle fluorescenti vicino alla superficie del coprioggetto. Queste immagini mostrano astrociti e neuroni caricati con flu oh quattro.Gli astrociti sono cellule piatte con prolungamenti fini, mentre i neuroni presentano corpi cellulari rotondi e dendriti spessi e lunghi. Sia gli astrociti che i neuroni appaiono sani e carichi di flu. Oh quattro correttamente.L'osservazione degli astrociti mediante microscopia epifluorescente o confocale è utile per verificare se gli astrociti sono sani e se gli indicatori del calcio sono stati correttamente caricati negli astrociti. Nelle regioni degli astrociti più vicine al vetrino, definite impronta, si osserva che un potenziale trifasico provoca un aumento del calcio in prossimità della membrana plasmatica. È noto che gli astrociti ippocampali esprimono recettori puramente anergici e che l'applicazione in bagno di un potenziale trifasico può indurre un rilascio globale di calcio.Abbiamo appena mostrato come preparare una coltura di osteociti ippocampali e come misurare il livello di calcio in un osteocita sia a livello globale che nelle vicinanze della membrana plasmatica. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare l'angolo del laser; il modo migliore per assicurarsene al microscopio è osservare il comportamento di flussi a velocità di 100 millimetri al secondo. La registrazione simultanea dei livelli di calcio globale e di calcio vicino alla membrana ci fornirà non solo una descrizione dettagliata del segnale del calcio, ma anche nuove informazioni sui meccanismi di regolazione del calcio nell'astrocita.Ci è inoltre venuto in mente che l'approccio qui descritto è utile per misurare i livelli di calcio intracellulare vicino alla membrana e quelli globali in altri campi eccitabili sconosciuti. È tutto. Grazie per averci seguito e buona fortuna con il vostro esperimento.

measuring-near-plasma-membrane-global-intracellular-calcium-dynamics

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

La preparazione di fettine cerebrali acute di ippocampo isolato, così come le registrazioni elettrofisiologiche simultanee di astrociti e neuroni...

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Fonte: Bannai, H., et. al., Dissezione dei segnali locali di Ca2+ in cellule coltivate mediante indicatori di Ca2+ mirati alla membrana. J. Vis. Exp. (2019)Il video mostra l'imaging a fluorescenza per osservare la dinamica spontanea del calcio specifica del compartimento negli astrociti, monitorando in sequenza le proteine sensibili al calcio localizzate sulla membrana plasmatica e sul reticolo endoplasmatico.

Imaging spontaneo del calcio per la dinamica compartimentale specifica negli astrociti

Qui si descrive un adattamento dei protocolli usati per indurre plasticità omeostatica nei neuroni per lo studio della plasticità dei recettori accoppiati a proteina G astrociti. Utilizzati di recente per esaminare i cambiamenti nel gruppo astrociti I mGluRs nei topi giovani, il metodo può essere applicato per misurare il ridimensionamento di diversi GPCR astrocitiche, in tessuto dai topi adulti in situ e in vivo, e di ottenere un migliore apprezzamento della sensibilità dei recettori...

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Le proprietà e le funzioni dei segnali intracellulari Ca2+ degli astrociti nello striato rimangono inesplorate. Descriviamo i metodi per esprimere indicatori di calcio geneticamente codificati negli astrociti striatali utilizzando virus adeno-associati del sierotipo 2/5 (AAV2/5), nonché le procedure per visualizzare in modo affidabile i segnali Ca2+ all'interno degli astrociti striatali in situ.

Imaging intracellulare Ca 2+ Segnali di striatale astrociti da topi adulti utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificate

Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

Ha dimostrato qui sono protocolli per isolamento (1) appena endothelial cerebrali intatti "tubi" e misure (2) simultanee di calcio endoteliale e potenziale durante endotelio-derivato hyperpolarization della membrana. Inoltre, questi metodi consentono per la sintonizzazione farmacologico di calcio delle cellule endoteliali e segnali elettrici come variabili sperimentali individuali o interattive.

Misurazioni simultanee di calcio intracellulare e potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale Mouse appena isolato ed intatto

Qui presentiamo un protocollo per Ca2 + imaging in neuroni e cellule gliali, che consente la dissezione di Ca2 + segnali a risoluzione subcellulare. Questo processo è applicabile a tutti i tipi di cellulari che permettono l'espressione di codificato geneticamente indicatori di Ca2 + .

Dissezione del locale Ca2 + segnali in cellule coltivate di targeting per membrana Ca2 + indicatori

Qui descriviamo un metodo in vitro di imaging dal vivo per visualizzare il trasporto intracellulare di organelli e il traffico di proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. Questo protocollo presenta anche una metodologia di analisi delle immagini per determinare gli itinerari e la cinetica nel trasporto merci.

Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti

Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l'imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca2+ in astrociti e neuroni.

Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI)

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Questo protocollo fornisce una descrizione completa di un metodo per la registrazione simultanea dei segnali di calcio provenienti da neuroni e astrociti attraverso molteplici regioni cerebrali legate alla memoria e ne dimostra l'applicazione durante un paradigma di apprendimento e comportamento della memoria.

Un metodo di fotometria a fibre a doppio colore per registrare l'attività degli astrociti-neuroni in più regioni cerebrali durante l'apprendimento e i comportamenti di memoria

Scopri come misurare la dinamica del calcio globale e vicino alla membrana plasmatica negli astrociti utilizzando la microscopia a fluorescenza e a riflessione totale interna. Questo metodo permette di osservare simultaneamente i segnali calcici in colture miste astrociti-neuroni.

Misura Vicino membrana plasmatica e Global Dynamics calcio intracellulare negli astrociti

Esplora altri video