Name: Isolamento di protoplasti da tessuti di 14-giorni di età piantine di Arabidopsis thaliana /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Impara l'isolamento di protoplasti intatti da piantine di Arabidopsis thaliana di 14 giorni. Questo metodo utilizza digestione enzimatica e gradiente di densità per ottenere cellule vitali per almeno 96 ore.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Experiment Station Cornell University agricolo (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant e Cornell Start-Up sovvenzione concessa a OKV

Parte 1. Preparazione del terreno solido per le piante in crescita. Noi di solito le piante sulla cultura concentrato Murasige e Skoog (MS) media integrato con 1% di saccarosio e lo 0,7% agar. Esso contiene tutti gli ingredienti necessari per mantenere le piante sane. Per preparare 1L di MS, media pH 5,7 <ol><li> Aggiungere 2,15 g di MS polvere in 800 ml di acqua in bottiglia da 1,5 2.0L autoclavabile. </li><li> Posizionare un bar mescolando nella bottiglia e si dissolvono in polvere MS agitando medio su un piatto mescolando. </li><li> Mescolando, aggiungere, goccia a goccia, KOH 1N per aggiustare il pH medio di MS a 5,7. </li><li> Aggiungere 10 g di saccarosio, continuare a mescolare. </li><li> Aggiungono 7 g di agar *. </li><li> Regolare il volume finale del terreno preparato a 1000 ml e sterilizzare in autoclave .* </li><li> Luogo autoclave medio su un piatto mescolando e raffreddarlo mescolando, in modo che agar non precipitare sul fondo della bottiglia. Raffreddare medio ~ 60 ° C. * </li><li> Versare 100 millimetri piastre Petri. Tenere le piastre a 4 ° C. </li></ol> * Suggerimento 1: Non tentare di sciogliere agar. Si solubilizzano durante la sterilizzazione in autoclave. * Suggerimento 2: Tenere la barra mescolando in una bottiglia durante la sterilizzazione, ne avrete bisogno in seguito. * Suggerimento 3: Se potete tenervi le mani sulla bottiglia in autoclave per 10 s, significa che il mezzo si raffreddi e si può cominciare a diffondere piatti. Parte 2. Materiale vegetale e condizioni di crescita. <ol><li> Sterilizzare i semi di Arabidopsis thaliana <ol><li> Mettere 100 mg di semi in provette da microcentrifuga eppendorf e aggiungere 1 ml di etanolo al 70%. Mescolare bene e incubare per 2 minuti. Spin semi giù, aspirare il sopranatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di candeggina al 1,8% * contenente 0,1% di Tween-20. Mescolare per 10 min. Spin down semi e soluzione di candeggina aspirare. </li><li> Questo passo deve essere fatto in una cappa a flusso laminare. Aggiungere 1 ml di acqua sterile per i semi, mescolare bene. Spin down semi, aspirare l&#39;acqua. Ripetere questa operazione per 5 volte. </li></ol></li><li> Diffondere i semi sul preparato nella fase 1 piastre (100 semi / piastra). </li><li> Conservare le piastre seminate per 24-48 ore a 4 ° C al buio per la stratificazione. </li><li> Coltivare piante per 14 giorni nella camera di crescita con 8 h light/16 h scuro fotoperiodo (con una densità di fotosintesi flusso di fotoni di 250 mmol m -2 s -1) a 23 / ​​19 ° C, luce / buio regime di temperatura e il 75% rispetto umidità. </li></ol> * Suggerimento 1: soluzione di Bleach è composto da una famiglia di diluizione Clorox, contenente ipoclorito di sodio al 6% e l&#39;aggiunta di Tween-20 a una concentrazione finale di 0,1%. Parte 3. Isolamento di protoplasti da piantine di Arabidopsis. <ol><li> Fetta 2 g di 14-giorno-vecchio piantine con una lama di rasoio fresco in 15 ml di soluzione sterilizzata per filtrazione, TVL. Noi tagliare materiale vegetale in piatti monouso sterili Petri. </li><li> Trasferimento tessuti tagliati in 200 ml bicchiere, aggiungere 20 ml di soluzione enzimatica, sterilizzata per filtrazione, agitare il bicchiere per far mescolare tessuti con soluzione enzimatica, coprire con parafilm e foglio di alluminio. </li><li> Agitare tessuti vegetali a 35 giri al buio a temperatura ambiente per 16-18 h. </li><li> Raccogliere la protoplasti rilasciata nel tubo da 50 ml Falcon mediante setacciatura a 8 strati di telo, pre-umido in W5 soluzione. </li><li> Protoplasti setaccio dal formaggio panno ancora una volta con il lavaggio il panno con 15 ml di soluzione W5. </li><li> Attentamente protoplasti sovrapposizione con 10 ml di soluzione W5, non disturbare il gradiente di zucchero; centrifugare per 7 minuti a 100 g. </li><li> Raccogliere 10 ml di protoplasti a livello di interfaccia di soluzione enzimatica e W5 Soluzione (Fig. 1B) e trasferirli in un nuovo tubo da 50 ml Falcon. </li><li> Aggiungere 15 ml di soluzione W5, centrifugare per 5 min a 60 g. Rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare protoplasti privi di soluzione enzimatica da risospendere protoplasti in 15ml di soluzione W5, centrifugare per 5 min a 60 g </li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere protoplasti pellet in 1-3ml W5 soluzione. </li><li> Valutare resa protoplasti da cellule contando con un emocitometro. </li></ol> Parte 4. Reagenti: TVL: 0,3 M sorbitolo; 50 mM CaCl 2 Filtro-sterilizzare e conservare a -20 ° C. Enzima Soluzione: 0,5 M saccarosio, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM CaCl 2, 40 mM KCl, 1% Cellulase (Onozuka R-10), 1% Macerozyme (R10). Filtro-sterilizzare e appena uso. W5 Soluzione: 0,1% (w / v) di glucosio, 0,08% (w / v) KCl, 0,9% (w / v) di NaCl, 1,84% (w / v) CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5.7. Filtro-sterilizzare e conservare a temperatura ambiente. Parte 5: Risultati Rappresentante: Utilizzando condizioni di coltura Arabidopsis descritti nelle parti 1 e 2 piantine rende sani, adatti per isolare protoplasti (Fig. 1A). Protoplasti sono purificati dai gradienti di densità di saccarosioENT centrifugazione e raccolti a livello di interfaccia di W5 e soluzioni di enzimi (Fig. 1B). Utilizzando l&#39;isolamento di protoplasti procedura descritta nella parte 3 abbiamo raccolto tipicamente 5-10 ottobre 6 di protoplasti intatti (Fig. 1C) da un grammo di piantine fresche. <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Isolamento di protoplasti da piantine di Arabidopsis. A, tessuti dal 14-giorni di età piantine di Arabidopsis sono stati raccolti e convertiti in protoplasti con una procedura modificata (Chen e Halkier, 2000). B, protoplasti sono stati purificati mediante centrifugazione gradiente di densità di saccarosio e raccolti a livello di interfaccia della soluzione enzimatica e W5 Uffer (frecce bianche). C, luminoso-campo della microscopia protoplasti. Microfotografie sono stati raccolti utilizzando una camera CCD raffreddata interfacciato con il Axioscope Zeiss 2 plus microscopio.

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

Il brevetto provvisorio che descrive la procedura per il suo utilizzo in analisi funzionali di geni della pianta è stato depositato presso la Cornell Center For Enterprise Technology e commercializzazione (CCTEC), giugno 2008. Docket Nessun 50341/015001: Vatamaniuk, OK e Zhai, Metodo Z. per una rapida analisi funzionali di geni della pianta.

Per garantire l&#39;alto rendimento di protoplasti intatti, è molto importante per start-up con piante sane. Utilizzare un filtro-sterilizzare le soluzioni per l&#39;isolamento protoplasti. Ricordate che protoplasti sono fragili. Pertanto, quando si sono movimentazione protoplasti, non si mescolano, o vortice pipettare vigorosamente perché li freni. Invece, mescolare protoplasti lentamente ruotando o con nastro adesivo il tubo di centrifuga. La procedura descritta protoplasti resa intatta che sono vitali per almeno 96 h...

<table><tbody><tr><td>Miscela di Sali Basali Murashige e Skoog (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri (100x15 mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>Cellulasi (Onozuka R&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>Macerozima (R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>Garze di tela di cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>LabRotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Allegra X&amp;#8208;15R</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Axioskop 2 Plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di protoplasti da tessuti di 14-giorni di età piantine di arabidopsis thaliana</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasti sono cellule vegetali che hanno avuto le loro pareti cellulari enzimaticamente rimosso. Isolamento di protoplasti dai tessuti vegetali diversi per la prima volta segnalato più di 40 anni fa<sup&gt; 1</sup&gt; E da allora è stato adattato per studiare una serie di processi cellulari, come la localizzazione subcellulare di proteine, l&#39;isolamento di organelli intatti e mirata gene-inattivazione con un doppio filamento di RNA interference (RNAi)<sup&gt; 2-5</sup&gt;. La maggior parte dei protocolli di isolamento del protoplasti utilizzare tessuti foglia di Arabidopsis maturi (per esempio 35 giorni di età delle piante)<sup&gt; 2-4</sup&gt;. Abbiamo modificato i protocolli esistenti con l&#39;impiego di 14 giorni di età piantine di Arabidopsis. In questa procedura, un grammo di 14-giorno-vecchie piantine prodotto 5 10<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt; Protoplasti che rimangono intatte, almeno 96 ore. La resa di protoplasti da piantine è paragonabile con i preparati da foglie di Arabidopsis maturo, ma invece di 35-36 giorni, l&#39;isolamento di protoplasti si completa in 15 giorni. Ciò consente di diminuire il tempo e lo spazio camera di crescita che sono necessari per isolare protoplasti quando le piante mature sono utilizzati, e accelera gli studi a valle che richiedono protoplasti intatti.

Questo video mostra una procedura per isolare protoplasti intatti da tessuti di 14-giorno-vecchie piantine di Arabidopsis. Dato che il protoplasti isolati rimangono intatte per almeno 96 ore e sono isolati da piantine invece di piante mature di un mese-vecchia, questa procedura accelera i test che richiedono protoplasti intatti.

Isolamento di protoplasti da tessuti di 14-giorni di età piantine di Arabidopsis thaliana</em

I protoplasti sono cellule vegetali a cui è stata rimossa enzimaticamente la parete cellulare. L'isolamento di protoplasti da diversi tessuti vegetali è stato per la prima volta...

Questa procedura inizia seminando i semi di arabidopsis su agar MS al giorno 14. Dopo la germinazione dei semi, le piantine vengono raccolte e tagliate. Il materiale vegetale viene quindi digerito in una soluzione enzimatica che degrada la parete cellulare.La miscela risultante viene filtrata attraverso una garza per separare i protoplasti dall'altro materiale vegetale. I protoplasti raccolti vengono ulteriormente purificati su un gradiente di densità di saccarosio stratificandoli con la soluzione W cinque. I protoplasti si concentrano all'interfaccia tra l'enzima e la soluzione W cinque.Vengono raccolti e lavati prima degli esperimenti. Ciao, sono Jang Ja del laboratorio di Lina Wauk del Dipartimento di Scienze delle Colture e del Suolo della Cornell University. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento di fotografie integre da TH di aro Ana di 14 giorni.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la localizzazione subcellulare delle proteine di interesse, per l'isolamento di organelli intatti e per l'analisi funzionale dei geni mediante interferenza con RNA a doppio filamento. Cominciamo. Iniziamo la procedura preparando piastre MS 0,5 volte, supplementate con 1% di saccarosio e 0,7% di agar per un litro di mezzo.Pesare 2,15 grammi di polvere MS. Aggiungere in 800 millilitri di acqua in una bottiglia autoclavabile da 1,5 litri contenente una bacchetta magnetica, e mescolare il mezzo su una piastra magnetica per sciogliere la polvere mentre si mescola. Aggiungere goccia a goccia idrossido di potassio 1 N per aggiustare il pH a 5,7.Continuare a mescolare e aggiungere 10 grammi di saccarosio. Successivamente, aggiungere sette grammi di agar, che non si scioglie subito, ma si solubilizzerà in seguito durante l'autoclavatura. Infine, portare il volume a 1000 millilitri.Sterilizzare il mezzo MS mediante autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti. Lasciare la barretta magnetica all'interno della bottiglia dopo l'autoclavatura. Mescolare il mezzo su una piastra magnetica per raffreddarlo fino a circa 60 gradi Celsius.Mescolare durante il raffreddamento impedisce all'agar di precipitare sul fondo della bottiglia. Se si riesce a tenere le mani sulla bottiglia per 10 secondi, il mezzo si è raffreddato sufficientemente e le piastre possono essere versate. Procedere nella cappa per versare il mezzo in piastre di Petri da 150 per 15 millimetri.90 millilitri per piastra. Conservare le piastre a quattro gradi Celsius. Ora che le piastre sono in crescita, le piante sono pronte.Prepariamo i semi di Arabidopsis. Iniziare la coltivazione delle piante sterilizzando i semi di Arabidopsis per la semina su una piastra di Petri. Mettere i semi in una microprovetta da centrifuga einor in una quantità equivalente a 50 microlitri di volume.Prima sterilizzare con etanolo aggiungendo un millilitro di etanolo al 70% e mescolando. Incubare accuratamente con l'etanolo per due minuti, durante i quali i semi si depositeranno. Rimuovere con una pipetta la maggior quantità possibile di etanolo, quindi procedere alla sterilizzazione con candeggina aggiungendo un millilitro di soluzione di candeggina con tween e mescolare per 10 minuti, vorticosando ogni due o tre minuti.Per facilitare la rimozione della soluzione di candeggina, centrifugare brevemente i semi ed eliminare con una pipetta la maggior quantità possibile di soluzione. L'ultimo passaggio di sterilizzazione viene effettuato in una cappa a flusso laminare. Aggiungere un millilitro di acqua sterile ai semi e mescolare accuratamente.Dare ai semi una breve centrifugazione e aspirare l'acqua. Ripetere questo lavaggio con acqua altre quattro volte. Ora che i semi sono sterilizzati, distribuirli sulla piastra di MS.Dopo aver distribuito i semi, mantenere le piastre seminate per 24 ore a quattro gradi Celsius al buio per la stratificazione. Trascorse le 24 ore di incubazione, trasferire le piante in condizioni di crescita e farle crescere per 14 giorni. Con un fotoperiodo di otto ore di luce e 16 ore di buio, le piantine di 14 giorni saranno pronte per la raccolta.Ora che le piantine sono cresciute per due settimane, è il momento di preparare i protoplasti nella cappa. Utilizzare una lametta fresca per affettare due grammi di piantine in 15 millilitri di soluzione TVL sterilizzata per filtrazione in una piastra di Petri. Successivamente, trasferire i tessuti tritati in un becher da 200 millilitri avvolto nella carta d'alluminio.Aggiungere 20 millilitri di soluzione enzimatica appena preparata e sterilizzata mediante filtrazione per degradare la parete cellulare vegetale. Ruotare delicatamente il becher per mescolare e coprire con pellicola biologica e carta d'alluminio per mantenere il tessuto al buio. Procedere quindi agitando i tessuti vegetali nella soluzione enzimatica per 16 ore a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione con la soluzione enzimatica, raccogliere i protoplasti rilasciati in una provetta falcon da 50 millilitri filtrando la miscela attraverso otto strati di garza precedentemente inumiditi con soluzione W cinque; recuperare i protoplasti rimanenti lavando delicatamente la garza con 10 millilitri di soluzione W cinque. I protoplasti sono ora raccolti nella provetta falcon. Sovrapporre con attenzione ai protoplasti cinque millilitri di soluzione WW cinque.Attenzione a non disturbare il gradiente di zucchero formato dall'aggiunta della soluzione W cinque. Successivamente centrifugare i protoplasti per sette minuti a 100 G. I protoplasti si accumulano all'interfaccia tra la soluzione enzimatica e la soluzione W cinque. Raccogliere 10 millilitri di liquido all'interfaccia.Trasferire i protoplasti raccolti in un nuovo tubo falcon da 50 millilitri e aggiungere 15 millilitri di soluzione W cinque. Centrifugare quindi per cinque minuti a 60 gs. Al termine della centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere i protoplasti in 15 millilitri di soluzione W cinque.Centrifugare nuovamente i protoplasti per cinque minuti a 60 gs. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante e il resus. Sospendere i protoplasti pellettizzati in uno o due millilitri di soluzione W5.Infine, valutare il rendimento dei protoplasti mediante conteggio cellulare con un emocitometro al microscopio. La procedura di coltura qui descritta produce piantine sane di Arabidopsis adatte all'isolamento dei protoplasti dopo digestione e separazione su gradiente di densità. La raccolta di un grammo di piantine fresche fornisce tipicamente da cinque a dieci volte 10 alla sesta protoplasti integri.Abbiamo mostrato come isolare protoplasti dal soffitto di aosis di 14 giorni. Quando si esegue questa procedura, è molto importante ricordare che il successo dipende da piante sane. Pertanto, è fondamentale mantenere un rapporto foglia-piatto adeguato e specificato in questo protocollo per net mills, ms.Mezzo per piastra. Infine, ricordare che i port-plus sono molto fragili. Una volta rimossa la cellula, manipolare il bus con attenzione mescolando delicatamente mediante inversione invece che vortexando, e preparando su e giù.È tutto. Grazie per aver guardato. Buona fortuna con il tuo esperimento.

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