Murino procedura trapianto renale
10 luglio 2009
Trapianto renale nei topi è una procedura tecnicamente impegnativo, che richiede un'attenta assistenza post-operatoria e terapia per il successo.
La procedura di trapianto renale nel topo inizia con il prelievo dell'organo donatore, durante il quale il rene sinistro viene asportato dal topo donatore e conservato sul ghiaccio. Il rene destro viene rimosso dal topo ricevente per fare spazio al rene donatore. Il rene donatore viene quindi prelevato dal ghiaccio e trapiantato nel topo ricevente.
Al topo è concesso un periodo di recupero di quattro giorni prima che il rene nativo residuo venga asportato. Dopo sette giorni, i livelli di creatinina vengono monitorati mediante un analizzatore clinico portatile I STAT per valutare la funzionalità del trapianto. Salve, sono Sarah Heimer del laboratorio del Dott. Greg Hadley e del Dipartimento di Chirurgia dei Trapianti della Ohio State University.
Oggi vi mostreremo una procedura per il trapianto renale nel topo. L'intervento chirurgico di trapianto renale che vedrete oggi sarà eseguito dalla nostra esperta neurochirurgo residente Jing Wing. Utilizzate questa procedura nel nostro laboratorio per studiare gli eventi immunologici del rigetto del trapianto, nonché le strategie per prevenire il rigetto.
Iniziamo. Per iniziare il prelievo dell'organo donatore, si esegue un test del pizzicotto per assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato; operando in un campo sterile e utilizzando strumenti sterilizzati, si pratica un'incisione mediana nel topo anestetizzato dallo sterno fino al pube ed si espone il rene sinistro spostando l'intestino lateralmente sul lato destro al fine di eseguire la perfusione del rene donatore. Si posizionano suture di seta TY 4-0 intorno all'aorta e alla vena cava inferiore al di sotto e al di sopra dell'arteria e della vena renale.
Perfuso lentamente in situ con soluzione di Ringer lattato eparinizzata fredda attraverso l'aorta infrarenale. Isolare il rene sinistro legando e sezionando i vasi surrenali e testicolari e alcuni rami lombari con un punto di seta 8-0. Successivamente, mobilizzare la giunzione tra l'aorta e la vena cava inferiore con l'arteria e la vena renale; posizionare quattro punti di seta 8-0 intorno all'aorta e alla vena cava inferiore al di sotto e al di sopra dell'arteria e della vena renale.
Per ridurre al minimo l'emorragia, legare prima l'aorta al di sotto del vaso renale. Quindi dissezionare l'uretere sinistro dall'ilo renale fino alla vescica. Esporre l'uretere alla giunzione con la vescica utilizzando la retrazione della cupola vescicale.
Assicurandosi di evitare l'uretere destro, escindere una piccola porzione ellittica della vescica contenente la giunzione vescico-ureterale sinistra. Questa porzione verrà utilizzata per la ricostruzione urinaria mediante un'anastomosi vescica-vescica. Quindi legare l'aorta al di sopra dell'arteria e della vena renale.
Perfondere lentamente l'innesto in situ con soluzione di Ringer lattato eparinizzata fredda attraverso l'aorta infrarenale. Dividere l'aorta obliquamente a circa due millimetri al di sotto dell'arteria renale. Infine, rimuovere il rene e il suo apporto vascolare con l'uretere attaccato alla porzione di vescica sul blocco.
Il rene deve essere conservato in soluzione di Ringer lattato su ghiaccio fino al momento del trapianto nell'ospite, quindi il topo donatore deve essere soppresso mediante dislocazione cervicale sotto anestesia. Come dimostrato in precedenza, il trapianto nel ricevente inizia con una pinzatura per verificare che l'animale sia completamente anestetizzato. Per iniziare l'intervento chirurgico, effettuare un'incisione mediana, coprire l'intestino con garza bagnata e retrarre con cura l'intestino sul lato sinistro.
Per completare con successo questo trapianto renale, deve essere eseguita un'anastomosi tra la cuffia aortica del donatore e l'aorta del ricevente. La vena renale del donatore deve essere anastomizzata alla vena cava inferiore del ricevente e la toppa vescicale del donatore alla vescica del ricevente. L'arteria e la vena renale del rene destro e l'uretere.
Rimuovere il rene dopo la legatura. Isolare con attenzione i rami lombari e clampare con due clip microvascolari da quattro millimetri l'aorta infrarenale e la vena cava inferiore. Inserire una sutura in nylon da 10 oh attraverso lo spessore completo dell'aorta e ritrarre per eseguire un'otomia aortica ellittica mediante un singolo taglio pari a circa un quinto del diametro del vaso.
Successivamente, eseguire un'incisione longitudinale sulla vena cava inferiore perforandola con un ago da 30 gauge ed estendendola in modo appropriato mediante forbici microchirurgiche. Irrigare sia l'aorta che la vena cava inferiore con soluzione salina eparinizzata per rimuovere il sangue intraluminale o i coaguli. Rimuovere il rene donatore dal ghiaccio e posizionarlo nel fianco destro del topo.
Posizionare due punti di sutura di sostegno all'apice prossimale e distale dell'otomia aortica del ricevente con il manicotto aortico del donatore. Eseguire un'anastomosi termino-laterale tra il manicotto aortico del donatore e la parete anteriore dell'otomia aortica del ricevente utilizzando da due a tre suture continue in nylon 10 oh all'esterno dell'aorta. Dopo aver posizionato il trapianto renale del donatore nel fianco sinistro del ricevente.
Ripetere la procedura precedente tra la cuffia aortica del donatore e la parete posteriore dell'aorta del ricevente. È importante ricordare che l'anastomosi della vena e dell'arteria deve essere completata entro 20 minuti. L'innesto deve inoltre essere risciacquato più volte con soluzione fisiologica fredda durante l'anastomosi.
Eseguire un'anastomosi termino-laterale tra la vena renale del donatore e la parete posteriore della vena cava inferiore del ricevente utilizzando quattro o cinque punti continui in nylon 10 oh all'interno della vena cava inferiore. Chiudere la parete anteriore della vena cava inferiore e la vena renale del donatore con quattro o cinque punti continui all'esterno della vena cava inferiore. Il passo successivo consiste nel dividere la cupola della vescica del ricevente.
Fermare l'emorragia con la cauterizzazione. Una volta completata l'immobilizzazione, praticare un piccolo taglio sulla cupola e posizionare due punti di sutura di nylon 10-0 per anastomizzare la piccola toppa vescicale del donatore con la cupola vescicale del ricevente; suturare ciascun lato dell'anastomosi con otto-dieci punti continui. Infine, chiudere l'addome in due strati con suture continue di vicryl sintetico assorbibile sterile 4-0.
Le cure postoperatorie iniziano somministrando una singola iniezione intramuscolare di penicillina. Al ricevente del trapianto viene inoltre somministrata buprenorfina a una dose di 0,05 milligrammi per chilogrammo per via intramuscolare al giorno zero e al giorno uno dopo l'intervento per il controllo del dolore, insieme a un'offerta continua di acqua contenente sulfa trim. Le prime 24 ore dopo l'intervento, l'animale viene mantenuto in un incubatore a temperatura controllata.
I punti di sutura cutanei vengono rimossi due settimane dopo l'intervento chirurgico. La rimozione del rene nativo residuo è essenziale per poter monitorare il declino della funzione del trapianto renale mediante la misurazione della creatinina sierica. Tale procedura viene generalmente eseguita da quattro a sette giorni dopo il trapianto iniziale del rene donatore e prevede i principali passaggi utilizzati durante l'escissione del rene dal topo donatore.
L'anestesia con isoflurano viene utilizzata per sedare l'animale ospite in modo da poter prelevare campioni di sangue. I livelli quantitativi di creatinina nel sangue intero retroorbitale sono utilizzati come indicatore per valutare la funzionalità del trapianto e vengono determinati mediante un analizzatore clinico portatile I stat. Le unità convenzionali vengono convertite in unità SI moltiplicando le unità convenzionali per 88,4.
La concentrazione di creatinina è espressa in micromoli per litro. Gli animali di solito si riprendono da due a tre ore dopo l'intervento chirurgico e mostreranno un comportamento normale da topo dopo la rimozione del rene nativo residuo. La sopravvivenza dell'animale dipende dalla funzionalità del trapianto renale, che può essere valutata mediante esami giornalieri dello stato di salute generale dell'animale e della creatinina.
Misurazione del sangue intero mediante un analizzatore clinico portatile i-STAT come riferimento. Un topo normale non trapiantato presenta un livello di creatinina vicino a 20 micromolare. La disfunzione del trapianto renale è considerata quando il topo mostra segni di malattia e il livello di creatinina è elevato, raggiungendo circa 100 micromolare.
Vi abbiamo appena mostrato la procedura per il trapianto renale nel topo. Sebbene questa procedura sia tecnicamente complessa, il nostro laboratorio ha ottenuto notevoli successi nel realizzarla. Questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Il trapianto renale nei topi è una procedura tecnicamente complessa che richiede un'attenta cura e terapia post-operatoria per avere successo. La procedura prevede l'asportazione del rene del donatore e il suo trapianto nel topo ricevente, seguiti dal monitoraggio della funzionalità del trapianto.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia del Trapianto
- Modelli Murini
- Cura Post-operatoria
Sfondo
- Il trapianto renale è una procedura fondamentale nella ricerca.
- Richiede tecniche chirurgiche precise e un attento monitoraggio.
- Comprendere la funzione dell'innesto è essenziale per il successo.
- I modelli murini sono comunemente utilizzati negli studi sul trapianto.
Scopo dello studio
- Dimostrare la procedura di trapianto renale nel topo.
- Evidenziare l'importanza delle cure post-operatorie.
- Valutare la funzionalità del trapianto mediante il monitoraggio dei livelli di creatinina.
Metodi Utilizzati
- Prelevare il rene sinistro dal topo donatore.
- Rimuovere il rene destro dal topo ricevente.
- Trapiantare il rene del donatore nel topo ricevente.
- Monitorare i livelli di creatinina utilizzando un analizzatore clinico portatile I STAT.
Risultati principali
- Il rene donatore viene trapiantato con successo nel topo ricevente.
- Il recupero post-operatorio viene monitorato per quattro giorni.
- I livelli di creatinina vengono valutati dopo sette giorni per verificare la funzionalità del trapianto.
- La procedura dimostra la fattibilità del trapianto renale nei topi.
Conclusioni
- Il trapianto renale nei topi è un modello valido per lo studio della funzione renale.
- Un attento monitoraggio post-operatorio è fondamentale per il successo.
- Questo modello può contribuire alla comprensione della biologia del trapianto.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La creazione di modelli murini affidabili di trapianto renale consente la riduzione meccanicistica dei rischi associati a candidati immunoterapici mirati alle vie del rigetto del trapianto. Questa procedura supporta la validazione preclinica di farmaci biologici e di molecole di piccole dimensioni fornendo un sistema rilevante per la malattia, utile per valutare la sopravvivenza e la funzionalità del trapianto. Il monitoraggio quantitativo della creatinina mediante analizzatori portatili fornisce un allineamento traslazionale con biomarcatori per prendere decisioni di avanzamento o interruzione nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi immunologiche nei modelli di rigetto del trapianto attraverso esiti controllati sulla sopravvivenza dell'innesto.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro chirurgico standardizzato con un tasso di successo superiore al 90%, riducendo la variabilità negli studi di validazione degli obiettivi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative della creatinina nel sangue intero mediante analizzatori I-STAT, per la valutazione della risposta dose-effetto di composti immunomodulatori.
- Valore operativo: Stabilisce protocolli riproducibili di assistenza postoperatoria, inclusa l'amministrazione di penicillina e sulfatrim, per un monitoraggio costante della funzionalità del trapianto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie consentendo la valutazione longitudinale della funzione del trapianto mediante misurazioni seriali della creatinina.
- Valore operativo: Facilita la continuità preclinica permettendo la nefrectomia nativa al giorno 4-7 per isolare la funzione del rene donatore e ridurre i rischi meccanicistici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio fino alla valutazione preclinica, fornendo metriche quantitative della funzione dell'innesto che guidano l'identificazione dei composti promettenti e il loro avanzamento con rischio calibrato.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su bersagli immunomodulatori mediante variazioni misurabili dei livelli di creatinina, che riflettono un danno o una protezione del trapianto.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio grazie a un controllo standardizzato della lesione da riperfusione e alla prevenzione della trombosi durante l'anastomosi.
- Analisi: Permette misurazioni quantitative della creatinina nel sangue intero in micromoli per litro, con una soglia di disfunzione prossima a 100 µmol/L.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica utilizzando la creatinina come biomarcatore traslazionale allineato alla valutazione clinica della funzionalità del trapianto.
- Riutilizzo aziendale: Configura la procedura come una piattaforma riutilizzabile per team di immunologia e nefrologia che studiano i meccanismi di rigetto in diverse modalità terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nell'immunologia del trapianto fornendo un modello validato con controlli definiti per il danno da riperfusione.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione attraverso la specifica del tipo di sutura (nylon 10-0) e i protocolli di perfusione con ringer lattato eparinizzato.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione del trapianto collegando l'aumento della creatinina alla disfunzione del trapianto, consentendo la cessazione precoce di candidati inefficaci.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio attraverso soglie oggettive di funzionalità del trapianto derivate dal monitoraggio seriale della creatinina.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze microchirurgiche nelle tecniche di anastomosi vascolare e ricostruzione ureterale.
- Richiede l'accesso ad analizzatori clinici portatili I-STAT per la quantificazione puntuale della creatinina.
- Necessita di protocolli postoperatori standardizzati, inclusa la profilassi antibiotica e il controllo del dolore.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse ceppi murini che influenzano le dimensioni vascolari e la gestione dei punti di sutura.
- È limitato da una finestra temporale di 20 minuti per il completamento dell'anastomosi, necessaria per prevenire la trombosi e garantire la vitalità del trapianto.
