Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Dissezioniamo i larvi afferrando le estremità posteriore e anteriore, quindi tirando le pinze in direzioni opposte. Il tessuto in eccesso viene rimosso utilizzando forbici finissime. Questo permetterà di evidenziare i due emisferi dei dischi immaginali cerebrali larvali.

Il cordone nervoso ventrale e gli uncini boccali. Il complesso occhio-cervello della larva viene trasferito in una camera di coltura. Separiamo il lobo cerebrale dal peduncolo ottico per visualizzare la migrazione delle cellule gliali all'interno di un disco immaginale oculare di tipo selvatico.

Per osservare le cellule gliali arrestate nell'abbozzo ottico di un mutante, lasciamo il lobo cerebrale attaccato all'abbozzo ottico. Salve, sono Patrick Cafferty del Laboratorio di Vanessa Als del Dipartimento di Zoologia dell'Università della British Columbia. Ciao, sono Rin.

Oggi vi mostreremo un procedimento per visualizzare le cellule gliali in migrazione nell'occhio in via di sviluppo di drosophila. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare lo sviluppo delle cellule gliali. Cominciamo dunque.

Una settimana prima dell'inizio dell'esperimento, le mosche vengono incrociate per generare larve che esprimono GFP sotto il controllo di un promotore specifico per le cellule gliali. Questo esperimento prevede la visualizzazione di GFP marcato con una sequenza di localizzazione nucleare, espresso nelle cellule gliali. Utilizzando il promotore a polarità invertita, preparare almeno un giorno prima le coprioggetti rotonde da 18 millimetri immergendole per 10 minuti in una soluzione di poli-L-lisina al 1%, quindi lasciandole asciugare all'aria durante la notte precedente l'esperimento.

Pulire una camera di coltura magnetica a catena smontata immergendone le componenti per tutta la notte in etanolo al 70% il giorno dell'esperimento. Utilizzare tecniche asettiche per preparare il mezzo di coltura. Aggiungere siero fetale bovino, soluzione di penicillina e streptomicina e insulina a 10 millilitri di mezzo per insetti di Schneider.

Lasciare asciugare all'aria il pozzetto magnetico pulito in un'incubatrice per colture cellulari prima di rimuovere l'etanolo residuo lavando con il mezzo di coltura preparato. Una volta effettuate queste preparazioni, si può iniziare la dissezione del complesso oculare e cerebrale di drosophila. Per iniziare questa procedura, selezionare una larva di terzo stadio vagante dal lato di un contenitore per moscerini e posizionarla in una goccia di mezzo di coltura freddo su una piastra di Petri posta sul ghiaccio per alcuni minuti di raffreddamento.

Si consiglia di raffreddare le larve per rallentare le contrazioni peristaltiche del corpo e facilitare la dissezione. Successivamente, posizionare le larve raffreddate in una goccia di mezzo di coltura su una piastra rivestita con sard sotto un microscopio stereoscopico; utilizzare un paio di pinzette fini Dumont per afferrare saldamente la larva. A circa un terzo della distanza rispetto all'estremità posteriore, attendere finché la larva non estrude i suoi uncini boccali dall'estremità anteriore e, quando gli uncini boccali sono completamente estesi, afferrarli con un secondo paio di pinzette.

Per dissezionare le larve, tirare lentamente le due paia di pinzette in direzioni opposte. Il complesso occhio-cervello, insieme alle ghiandole salivari, ai corpi adiposi e ai tessuti immaginali, si staccherà dal corpo della larva. Non tirare troppo velocemente gli uncini boccali, altrimenti si strapperanno dal complesso iBrain.

Rimuovere le ghiandole salivari, i corpi adiposi e i dischi immaginali. Utilizzando forbici da microchirurgia, i due emisferi del cervello e i dischi oculari rimarranno attaccati al cordone nervoso ventrale e agli uncini boccali. Successivamente, posizionare un coprioggetto da 18 millimetri su un vetrino, lasciando un bordo del coprioggetto sporgente rispetto al bordo del vetrino. Per poter sollevare successivamente il coprioggetto, aggiungere una goccia di mezzo di coltura sul coprioggetto.

Afferrare i ganci boccali con pinzette e trasferire il complesso iBrain nel mezzo di coltura sul vetrino. Una volta trasferito il complesso occhio-cervello sul vetrino, utilizzare una dissezione fine. Utilizzare forbici per rimuovere i ganci boccali dal complesso occhio-cervello.

La rimozione degli uncini boccali è importante per l'immagine in tempo reale, poiché gli uncini boccali continueranno a contrarsi nel mezzo di coltura causando movimenti del tessuto durante la microscopia. Per visualizzare il GL all'interno del peduncolo ottico, mantenere intatti il peduncolo ottico del cervello e il disco immaginale dell'occhio. Per visualizzare la migrazione gliale all'interno del disco immaginale dell'occhio, tagliare con attenzione il peduncolo ottico, il tessuto sottile che collega il cervello e il disco oculare, quindi spostare o scartare il cervello.

Infine, prendere il coprioggetto con una pinzetta e tracciare un cerchio al di sotto intorno al tessuto di interesse utilizzando un pennarello indelebile. Questo cerchio aiuterà a localizzare il tessuto per la successiva microscopia. Ora il disco immaginale dell'occhio è pronto per essere montato in una camera di coltura magnetica.

Per montare il disco immaginale dell'occhio in una camera magnetica per colture, utilizzare una pinzetta per afferrare il bordo sporgente del coprioggetto e trasferire il coprioggetto sulla piastra inferiore della camera magnetica a catena senza disturbare il tessuto in coltura. Successivamente, posizionare l'anello di silicone a forma di O sul corpo principale della camera a catena. Installare con attenzione il corpo principale sulla piastra inferiore.

Aggiungere il mezzo di coltura nella camera. Non aggiungere il mezzo di coltura troppo rapidamente, altrimenti il tessuto verrà disturbato, consentendo lo scambio gassoso sotto il coperchio. Non riempire completamente la camera; posizionare delicatamente il coperchio invisibile sulla camera contrassegnata dalla linea tratteggiata.

Per visualizzare le cellule gliali in migrazione, posizionare la camera di coltura sul piatto di un microscopio confocale o a fluorescenza. Individuare il campione utilizzando il cerchio sul vetrino come riferimento, con un ingrandimento basso. Mettere a fuoco il campione utilizzando un obiettivo 40 volte.

Lasciare sedimentare il tessuto e acquisire immagini del disco oculare o del peduncolo ottico ogni 10-15 minuti per un periodo di tre o quattro ore, se l'esperimento viene eseguito correttamente. Questo protocollo produrrà una serie di immagini di cellule gliali marcate con GFP che migrano dal peduncolo ottico verso il disco immaginale oculare. Mentre l'analisi in tempo reale per un periodo di 60 minuti è risultata sufficiente per osservare i cambiamenti nella posizione dei nuclei gliali in un disco immaginale oculare di tipo selvatico, i nuclei gliali in un mutante per un gene necessario alla migrazione delle cellule gliali non sono stati in grado di abbandonare completamente il peduncolo ottico.

Abbiamo coltivato complessi occhio-cervello per periodi fino a 240 minuti prima di osservare un deterioramento del tessuto coltivato. Dopo il punto temporale di 240 minuti, iniziamo a osservare cellule positive per GFP nel mezzo di coltura che circonda i complessi occhio-cervello. Inoltre, la GFP si accumulerà in punti diffusi all'interno dei tessuti, suggerendo una compromissione dell'integrità tissutale.

Abbiamo appena mostrato come coltivare i dischi immaginali al fine di studiare la migrazione delle cellule gliali. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.