Name: Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Impara a visualizzare la migrazione delle cellule gliali nel disco immaginale dell'occhio di Drosophila mediante imaging in vivo con marcatura GFP. Questo protocollo consente lo studio dinamico dello sviluppo del sistema nervoso.

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Patrick Cafferty è supportato da una borsa di studio post-dottorato dalla Multiple Sclerosis Society of Canada.

Parte 1: Pre-set-up sperimentale. <ol><li> Una settimana di anticipo, compagno vola a generare larva che esprimono GFP sotto il controllo di un gliali specifico promotore. Per il nostro esperimento abbiamo visualizzato GFP taggati con una sequenza di localizzazione nucleare espressi nelle cellule gliali con la polarità invertita (pronti contro termine) promotore (3, 4). </li><li> Preparare copertura scivola almeno un giorno di anticipo da una immersione 18 millimetri coprioggetto tondo per 10 minuti in 1% di poli-L-lisina soluzione e aria secca durante la notte. </li><li> Il giorno prima dell&#39;esperimento, pulire una camera Chamlide cultura magnetico immergendo i componenti durante la notte nel 70% di etanolo. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, preparare un terreno di coltura con l&#39;aggiunta di siero fetale bovino, penicillina-streptomicina soluzione, e l&#39;insulina a 10 ml di terreno insetti Schneider con tecnica asettica. Le concentrazioni di lavoro sono: 1X siero fetale bovino; 100U/ml penicillina, streptomicina 0.1mg/ml e 0,2 mg / ml di insulina nel medio insetti Schneider (modificato da (5)). </li><li> Lasciare che la camera di cultura ad asciugare in una cappa di coltura cellulare. Lavare etanolo residua dalla camera di cultura lavando con terreno di coltura preparato. </li></ol> Parte 2: Preparazione del occhio-cervello complesso Drosophila. <ol><li> Selezionare un terzo instar larva errante dal lato di una fiala mosca e posto in una goccia di terreno di coltura fresco su una piastra di Petri in ghiaccio per diversi minuti. Agghiacciante la larva si consiglia di rallentare le contrazioni peristaltiche del corpo per facilitare la dissezione. </li><li> Posizionare la larva raffreddato in una goccia di terreno di coltura su un piatto rivestito Sylgard al microscopio di dissezione. </li><li> Sotto il microscopio dissezione, usare un paio di pinze Dumont fine per afferrare saldamente la larva circa un terzo della distanza dalla fine posteriore. Attendere che la larva estrude la sua bocca ganci a partire dalla fine anteriore. Afferrare la bocca ganci con un secondo paio di pinze sulla piena estensione. A sezionare la larva, tirare lentamente le due coppie di pinze in direzioni opposte. L&#39;occhio-cervello complesso, insieme con le ghiandole salivari, corpi grassi, e il tessuto immaginale, tirerà fuori dal corpo larvale. Non tirare la bocca ganci troppo in fretta altrimenti si strappano l&#39;occhio-cervello complesso. </li><li> Troncare ghiandole salivari, corpi grassi, e dischi immaginale ultra-sottile forbici clipper. I due emisferi del cervello e degli occhi-dischi sarà attaccato al cordone nervoso ventrale e ganci bocca. </li><li> Inserire un vetrino 18 mm su un vetrino. Lasciare un bordo del vetrino appeso fuori dal bordo della diapositiva in modo da raccogliere dopo il vetrino. Aggiungere una goccia di terreno di coltura sul slittamento 18 millimetri di copertura. Trasferire la occhio-cervello complesso nel terreno di coltura afferrando i ganci bocca con una pinza. Non cogliere l&#39;occhio-cervello complesso direttamente con il forcipe o il tessuto sarà danneggiato. </li><li> Dissezione con forbici bene, tagliare la bocca ganci da occhio-cervello complesso e scartare. La rimozione dei ganci bocca è importante per l&#39;imaging vivere come i ganci bocca continuerà a contrarsi nel terreno di coltura che causa il tessuto di muoversi durante la microscopia. </li><li> Per visualizzare la migrazione gliale all&#39;interno del disco occhio immaginale, accuratamente tagliato il gambo ottica, il tessuto sottile che collega il cervello e il disco occhi e allontanare o scartare il cervello (vedi figura 1A). Per visualizzare glia all&#39;interno del fusto ottica, lasciare il cervello, gambo di ottica, e il disco immaginale occhio intatto (vedi figura 1E). </li><li> Sollevare il coprioggetto con pinze e disegnare un cerchio intorno sotto il tessuto di interesse con un pennarello indelebile. Questo cerchio aiuterà a localizzare il tessuto per microscopia nella parte 4. </li></ol> Parte 3: Montaggio del disco immaginale occhio in una camera di cultura magnetico. <ol><li> Utilizzando pinze, afferrare il bordo impiccagione del vetrino. Trasferire il vetrino per la piastra inferiore della camera di Chamlide magnetico senza disturbare il tessuto in coltura. </li><li> Mettere il silicone O-ring sul corpo principale della camera Chamlide. Installare il corpo principale sopra la piastra inferiore. </li><li> Aggiungere lentamente terreno di coltura alla camera. Non aggiungere il terreno di coltura troppo in fretta o il tessuto di interesse saranno disturbati. Non riempire completamente la camera per consentire lo scambio di gas sotto il coperchio. </li><li> Posizionare con delicatezza il coperchio invisibile sulla parte superiore della camera di Chamlide. </li></ol> Parte 4: Visualizzazione di migrazione di cellule gliali nel disco occhi. <ol><li> Posizionare la camera di cultura sul palcoscenico di un microscopio confocale o fluorescenza. Individuare l&#39;esempio utilizzando il cerchio sul vetrino come riferimento il basso ingrandimento. </li><li> Focus sul campione utilizzando un obiettivo 40x. Lasciare che il tessuto al depositarsi sui coprioggetti. Catturare le immagini del disco ottico dell&#39;occhio o perseguitare ogni 10-15min in 3-4 ore. Il tessuto può contrarsi e spostarsi fuori fuoco. Messa a fuoco manuale il tessuto prima di acquisizione delle immagini allevierà °è un problema. </li></ol> Parte 5: risultati Rappresentante: Eseguita correttamente, il nostro protocollo ci ha permesso di raccogliere una serie di immagini di GFP-tagged cellule gliali che migrarono dal gambo ottica nel disco occhio immaginale (Figura 1 BD). Mentre immagini dal vivo per un periodo di 60 minuti è stato sufficiente a osservare i cambiamenti nelle posizioni dei nuclei gliali in un disco selvaggio occhio tipo immaginale, nuclei gliali in un mutante di un gene necessario per la migrazione delle cellule gliali completamente non è riuscito a uscire dal gambo di ottica (frecce Figura 1 FH). Abbiamo colto occhio-cervello complessi per periodi fino a 240 minuti prima di osservare il deterioramento del tessuto coltura. In seguito i 240 minuti di tempo-punto si comincia a osservare le cellule GFP positive nel terreno di coltura circostante colto occhio-cervello complessi (freccia Figura 2 C). Inoltre in GFP si accumula nei punti diffuso in tutto il tessuto che suggerisce una rottura dell&#39;integrità dei tessuti. <img src="/files/ftp_upload/1155/figure1.png" alt="" width="589" height="241" /> Figura 1: immagini dal vivo di GFP-tagged nuclei gliali del tipo di sviluppo selvaggio e mutante sistemi visivi. A, E) delle immagini scattate con contrasto interferenziale differenziale (DIC) microscopio di colture di tipo selvatico e mutante occhio-immaginale dischi (ED). Nel tipo selvatico, le cellule gliali sono nato e migrano dal gambo ottica (OS) nell&#39;occhio-disco. Il cervello è stata rimossa per facilitare l&#39;appiattimento e l&#39;imaging del disco occhio immaginale. BD) microscopia a fluorescenza del tipo selvatico disco occhio colto immaginale in (A) a 0, 30 e 60 punti tempo minuscolo rivela GFP-tagged nuclei gliali migrare all&#39;interno del disco occhio. FH) microscopia a fluorescenza del mutante occhio-cervello complesso (E) a 0, 30 e 60 punti dimostra un tempo minuscolo stallo di GFP-tagged nuclei gliali entro il gambo ottica (freccia). Il cervello (BR) è stato lasciato attaccato al peduncolo ottico per facilitare l&#39;imaging della glia all&#39;interno del gambo. <img src="/files/ftp_upload/1155/Figure_2.png" alt="" width="600" height="156" /> Figura 2: immagini dal vivo di GFP-tagged membrane gliali in un disco selvaggio occhio tipo immaginale. Abbiamo colto con successo occhio-cervello complessi per 240 minuti a periodi. Tessuto colto più di 240 minuti inizia a crollare. Il terreno di coltura che circonda il disco immaginale occhio (ED), pedinare ottica (OS), e del lobo cerebrale (BR) a 0 (A) e 150 minuti (B), rispetto al minuto 300 time-point (C), è libero di cellule GFP-positive, indicato da una freccia.

<ol><li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li>
<li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+migration+in+the+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li>
<li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

In questo protocollo si descrivono osservazione della migrazione delle cellule gliali nel disco occhio immaginale usando la microscopia dal vivo. Nel nostro esempio wild-type (figura 1 dC), abbiamo utilizzato un marcatore nucleare GFP per osservare il movimento delle cellule gliali nel disco occhio nel corso di un&#39;ora. In un mutante di un gene candidato necessaria per la migrazione delle cellule gliali attualmente allo studio nel nostro laboratorio, abbiamo osservato uno stallo dei nuclei delle cellule glia...

<table><tbody><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo per insetti di Schneider&amp;rsquo;s</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di insulina da pancreas bovino</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Camera magnetica Chamlide</td><td>Strumento</td><td>Live cell Instrument</td><td>CM-R-10</td><td>Camera tipo piastra da 35 mm per coprislip da 18 mm</td></tr><tr><td>Forbici da trinciatura ultrafini</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont n. 5</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Qualsiasi sistema di imaging a fluorescenza dotato dei filtri e dell'eccitazione necessari per GFP può essere utilizzato.</td></tr></tbody></table>

vivere imaging della migrazione cellule gliali nella eye disco drosophila immaginale

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Cellule gliali di entrambi gli organismi vertebrati e invertebrati devono migrare verso le regioni obiettivo finale per ensheath e supportare i neuroni associati. Anche se i recenti progressi sono stati fatti per descrivere la migrazione live delle cellule gliali nell&#39;ala sviluppo pupale (1), gli studi di<em&gt; Drosophila</emLa migrazione delle cellule&gt; gliali sono in genere impegnati l&#39;esame di tessuto fissato. Vivono analisi al microscopio delle cellule mobili offre la possibilità di esaminare il comportamento cellulare durante tutto il processo migratorio, ivi compresa la determinazione del tasso di cambi di direzione e di crescita. In coppia con l&#39;uso di strumenti genetici, immagini dal vivo possono essere utilizzati per determinare i ruoli più precisi per i geni specifici nel processo di sviluppo. Precedenti lavori Silies<em&gt; Et al.</em&gt; (2) ha descritto la migrazione di cellule gliali provenienti dal gambo ottica, una struttura che collega l&#39;occhio e il cervello in via di sviluppo, nel disco occhio immaginale in tessuto fissato. Qui delineare un protocollo per l&#39;esame della migrazione live delle cellule gliali nella<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco occhio immaginale. Ci avvaliamo di una linea di Drosophila che esprime GFP in cellule gliali di sviluppo per seguire la progressione delle cellule gliali di tipo negli animali selvatici e mutanti.

Qui descriviamo un protocollo per esaminare la migrazione delle cellule gliali in un occhio lo sviluppo di Drosophila mediante l&#39;analisi microscopica vivono in coppia con tag GFP cellule gliali.

Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Le cellule gliali sia degli organismi vertebrati che di quelli invertebrati devono migrare verso le regioni target finali per poter rivestire e supportare i neuroni associati. Mentre...

Dissezioniamo i larvi afferrando le estremità posteriore e anteriore, quindi tirando le pinze in direzioni opposte. Il tessuto in eccesso viene rimosso utilizzando forbici finissime. Questo permetterà di evidenziare i due emisferi dei dischi immaginali cerebrali larvali.Il cordone nervoso ventrale e gli uncini boccali. Il complesso occhio-cervello della larva viene trasferito in una camera di coltura. Separiamo il lobo cerebrale dal peduncolo ottico per visualizzare la migrazione delle cellule gliali all'interno di un disco immaginale oculare di tipo selvatico.Per osservare le cellule gliali arrestate nell'abbozzo ottico di un mutante, lasciamo il lobo cerebrale attaccato all'abbozzo ottico. Salve, sono Patrick Cafferty del Laboratorio di Vanessa Als del Dipartimento di Zoologia dell'Università della British Columbia. Ciao, sono Rin.Oggi vi mostreremo un procedimento per visualizzare le cellule gliali in migrazione nell'occhio in via di sviluppo di drosophila. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare lo sviluppo delle cellule gliali. Cominciamo dunque.Una settimana prima dell'inizio dell'esperimento, le mosche vengono incrociate per generare larve che esprimono GFP sotto il controllo di un promotore specifico per le cellule gliali. Questo esperimento prevede la visualizzazione di GFP marcato con una sequenza di localizzazione nucleare, espresso nelle cellule gliali. Utilizzando il promotore a polarità invertita, preparare almeno un giorno prima le coprioggetti rotonde da 18 millimetri immergendole per 10 minuti in una soluzione di poli-L-lisina al 1%, quindi lasciandole asciugare all'aria durante la notte precedente l'esperimento.Pulire una camera di coltura magnetica a catena smontata immergendone le componenti per tutta la notte in etanolo al 70% il giorno dell'esperimento. Utilizzare tecniche asettiche per preparare il mezzo di coltura. Aggiungere siero fetale bovino, soluzione di penicillina e streptomicina e insulina a 10 millilitri di mezzo per insetti di Schneider.Lasciare asciugare all'aria il pozzetto magnetico pulito in un'incubatrice per colture cellulari prima di rimuovere l'etanolo residuo lavando con il mezzo di coltura preparato. Una volta effettuate queste preparazioni, si può iniziare la dissezione del complesso oculare e cerebrale di drosophila. Per iniziare questa procedura, selezionare una larva di terzo stadio vagante dal lato di un contenitore per moscerini e posizionarla in una goccia di mezzo di coltura freddo su una piastra di Petri posta sul ghiaccio per alcuni minuti di raffreddamento.Si consiglia di raffreddare le larve per rallentare le contrazioni peristaltiche del corpo e facilitare la dissezione. Successivamente, posizionare le larve raffreddate in una goccia di mezzo di coltura su una piastra rivestita con sard sotto un microscopio stereoscopico; utilizzare un paio di pinzette fini Dumont per afferrare saldamente la larva. A circa un terzo della distanza rispetto all'estremità posteriore, attendere finché la larva non estrude i suoi uncini boccali dall'estremità anteriore e, quando gli uncini boccali sono completamente estesi, afferrarli con un secondo paio di pinzette.Per dissezionare le larve, tirare lentamente le due paia di pinzette in direzioni opposte. Il complesso occhio-cervello, insieme alle ghiandole salivari, ai corpi adiposi e ai tessuti immaginali, si staccherà dal corpo della larva. Non tirare troppo velocemente gli uncini boccali, altrimenti si strapperanno dal complesso iBrain.Rimuovere le ghiandole salivari, i corpi adiposi e i dischi immaginali. Utilizzando forbici da microchirurgia, i due emisferi del cervello e i dischi oculari rimarranno attaccati al cordone nervoso ventrale e agli uncini boccali. Successivamente, posizionare un coprioggetto da 18 millimetri su un vetrino, lasciando un bordo del coprioggetto sporgente rispetto al bordo del vetrino. Per poter sollevare successivamente il coprioggetto, aggiungere una goccia di mezzo di coltura sul coprioggetto.Afferrare i ganci boccali con pinzette e trasferire il complesso iBrain nel mezzo di coltura sul vetrino. Una volta trasferito il complesso occhio-cervello sul vetrino, utilizzare una dissezione fine. Utilizzare forbici per rimuovere i ganci boccali dal complesso occhio-cervello.La rimozione degli uncini boccali è importante per l'immagine in tempo reale, poiché gli uncini boccali continueranno a contrarsi nel mezzo di coltura causando movimenti del tessuto durante la microscopia. Per visualizzare il GL all'interno del peduncolo ottico, mantenere intatti il peduncolo ottico del cervello e il disco immaginale dell'occhio. Per visualizzare la migrazione gliale all'interno del disco immaginale dell'occhio, tagliare con attenzione il peduncolo ottico, il tessuto sottile che collega il cervello e il disco oculare, quindi spostare o scartare il cervello.Infine, prendere il coprioggetto con una pinzetta e tracciare un cerchio al di sotto intorno al tessuto di interesse utilizzando un pennarello indelebile. Questo cerchio aiuterà a localizzare il tessuto per la successiva microscopia. Ora il disco immaginale dell'occhio è pronto per essere montato in una camera di coltura magnetica.Per montare il disco immaginale dell'occhio in una camera magnetica per colture, utilizzare una pinzetta per afferrare il bordo sporgente del coprioggetto e trasferire il coprioggetto sulla piastra inferiore della camera magnetica a catena senza disturbare il tessuto in coltura. Successivamente, posizionare l'anello di silicone a forma di O sul corpo principale della camera a catena. Installare con attenzione il corpo principale sulla piastra inferiore.Aggiungere il mezzo di coltura nella camera. Non aggiungere il mezzo di coltura troppo rapidamente, altrimenti il tessuto verrà disturbato, consentendo lo scambio gassoso sotto il coperchio. Non riempire completamente la camera; posizionare delicatamente il coperchio invisibile sulla camera contrassegnata dalla linea tratteggiata.Per visualizzare le cellule gliali in migrazione, posizionare la camera di coltura sul piatto di un microscopio confocale o a fluorescenza. Individuare il campione utilizzando il cerchio sul vetrino come riferimento, con un ingrandimento basso. Mettere a fuoco il campione utilizzando un obiettivo 40 volte.Lasciare sedimentare il tessuto e acquisire immagini del disco oculare o del peduncolo ottico ogni 10-15 minuti per un periodo di tre o quattro ore, se l'esperimento viene eseguito correttamente. Questo protocollo produrrà una serie di immagini di cellule gliali marcate con GFP che migrano dal peduncolo ottico verso il disco immaginale oculare. Mentre l'analisi in tempo reale per un periodo di 60 minuti è risultata sufficiente per osservare i cambiamenti nella posizione dei nuclei gliali in un disco immaginale oculare di tipo selvatico, i nuclei gliali in un mutante per un gene necessario alla migrazione delle cellule gliali non sono stati in grado di abbandonare completamente il peduncolo ottico.Abbiamo coltivato complessi occhio-cervello per periodi fino a 240 minuti prima di osservare un deterioramento del tessuto coltivato. Dopo il punto temporale di 240 minuti, iniziamo a osservare cellule positive per GFP nel mezzo di coltura che circonda i complessi occhio-cervello. Inoltre, la GFP si accumulerà in punti diffusi all'interno dei tessuti, suggerendo una compromissione dell'integrità tissutale.Abbiamo appena mostrato come coltivare i dischi immaginali al fine di studiare la migrazione delle cellule gliali. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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