Name: Quantificare cronologica Span lievito Life di conseguenza di cellule invecchiate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Scopri un metodo ad alto rendimento per quantificare la durata della vita cronologica del lievito, misurando la perdita di vitalità cellulare nella fase stazionaria. Questa tecnica facilita studi su larga scala sull'invecchiamento.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH di Grant 1R21AG031965-01A1. MK è una Ellison Medical Foundation Scholar Nuove invecchiamento.

Parte 1: Preparazione delle colture invecchiamento <ol><li> Ceppi striscia di interesse da parte scorte congelate su piastre di agar YEPD (1 estratto di lievito%, 2% bacto-peptone, 2% agar, 2% di glucosio). </li><li> Incubare le cellule a 30 ˚ C per 48 ore o fino a singole colonie appaiono. </li><li> Scegli singole colonie e inoculare in 5 ml di liquido YEPD (1 estratto di lievito%, 2% bacto-peptone, 2% di glucosio) in provetta. </li><li> Grow culture notte a 30 ˚ C, mantenendo costante agitazione utilizzando uno shaker o Rullo. </li><li> Inoculare 5 ml di sintesi completa (SC), medio (Tabella 1) con 50 microlitri della cultura durante la notte. Generalmente tre culture SC sono preparati per ogni sforzo per assicurare la replica biologico triplice copia delle analisi ciclo di vita per ogni ceppo in esame. </li><li> Mantenere le culture a 30 ˚ C con agitazione costante su un rullo di tamburo per l&#39;intero esperimento (in genere 2 o più settimane). </li></ol> Parte 2: Facendo una vitalità età-punto Dopo due giorni di cultura in SC mezzi di comunicazione, le cellule devono essere in fase stazionaria e la prima età punto è pronto per essere preso. Successive età punti dovrebbero essere prese ogni 2-3 giorni per un minimo di due settimane. Per ogni punto di età: <ol><li> Preparare il Bioscreen piatti a nido d&#39;ape 100-bene per l&#39;inoculazione, compilando tutti i pozzetti con 145 ml di YEPD. Assicurarsi di lasciare almeno un pozzetto riempito solo YEPD e non le cellule per l&#39;analisi dei dati in seguito. </li><li> Rimuovere le culture invecchiamento dal termostato. </li><li> Mescolare brevemente nel vortex la prima cultura ad essere inoculato nella piastra a nido d&#39;ape, facendo attenzione a non versare della cultura. </li><li> Prelevare 5 ml di cultura mista e pipetta in primo pozzo della piastra a nido d&#39;ape. Fiamma la bocca di ogni provetta prima e dopo la rimozione dei 5 aliquota microlitri. </li><li> Ripetere questa procedura per ogni cultura invecchiamento avendo cura di notare la posizione e corrispondenti a ciascuna cultura. Posizioni identiche bene dovrebbe essere utilizzato per ogni successiva età-point durante l&#39;intero esperimento. </li><li> Sostituire le culture nel 30 ˚ C incubatore al termine con la vaccinazioni. </li></ol> Parte 3: Caricamento del Bioscreen C macchina MBR <ol><li> Esporre il vano incubatore sollevando il coperchio e rimuovere il coperchio per il vassoio campione. </li><li> Inserire la nuova piastra inoculata a nido d&#39;ape nel vassoio del campione (usare lo slot di sinistra se siete solo leggendo una piastra). </li><li> Sostituire il coperchio per il vassoio campione e abbassare il coperchio del vano incubatrice. </li><li> Verificare che il fluido termovettore è superiore al livello minimo di riempimento. Se basso, aggiungere più di 1000 con pipetta microlitri con il fluido termovettore in dotazione. </li><li> Utilizzando il software Bioscreen &quot;EZExperiment&quot;, impostare i seguenti parametri per ottenere curve di crescita adatto per Saccharomyces cerevisiae: <ul><li> Numero di campioni: Inserire il numero di pozzi con i media o 200 </li><li> Filtro: 420-580nm, a banda larga </li><li> Temperatura: 30 ˚ C </li><li> Esperimento Durata: 1 giorno, 0 ore, 0 secondi </li><li> Intervallo di misura: 30 minuti </li><li> Agitazione: On, scuotendo continuo, ad alta </li></ul></li><li> Fare clic su &quot;Start&quot; per iniziare la lettura. </li></ol> Parte 4: Analisi dei dati Solitamente, a sei anni-punti sono presi nel corso di due settimane. L&#39;età punti sono prese a giorni 2, 4, 6, 9, 11 e 13. A seconda del disegno sperimentale e le tensioni in fase di sperimentazione, può essere opportuno tenere età punti più o meno frequentemente o per più di 2 settimane. E &#39;importante caricare la piastra a nido d&#39;ape nello stesso ordine per ogni età-point in modo tale che ogni cultura invecchiamento corrisponde alla stessa posizione e ad ogni età-punto, perché in questo modo l&#39;analisi dei dati molto più facile. <ol><li> Ottenere i file di output dalla macchina Bioscreen C MBR. Il &quot;EZExperiment&quot; software visualizzerà i dati Bioscreen come un file delimitato da tabulazioni che è compatibile con Microsoft Excel e altri software. La prima colonna indica a che ora la misura OD è stata presa durante l&#39;esperimento, con le successive colonne rappresentano ciascun pozzetto nelle piastre Bioscreen a nido d&#39;ape (Figura 1). </li><li> Eliminare la prima lettura OD da ogni colonna. Questa lettura è &quot;rumore&quot;. </li><li> Normalizzare i dati sottraendo il valore OD del bene con YEPD solo da tutti i valori di OD in ogni colonna. Questo rimuove l&#39;assorbanza di fondo da parte dei media. </li><li> Tracciare la curva escrescenza. Le curve si sposterà in funzione dell&#39;età (Figura 2). Per esempio, tracciando le curve escrescenza dalla colonna 1 (e 1 del piatto a nido d&#39;ape) oltre i sei punti del tempo, c&#39;è uno spostamento verso destra distinta delle curve nel tempo. </li><li> Calcolare il tempo di raddoppio (δ) per ogni bene in base alla cinetica di crescita del giorno 2 età-point. L&#39;equazione utilizzata per calcolare il tempo di raddoppio is: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="Equazione" /> dove OD OD 1 e 2 rappresentano successive misurazioni OD e t 1 e t 2 è il tempo tra le misurazioni. Calcola il raddoppio volte solo tra i valori OD di 0,2 a 0,5. La media di questi valori è il tempo di raddoppio per quel bene. Calcola il raddoppio volte solo tra i valori OD di 0,2 a 0,5. La media di questi valori è il tempo di raddoppio per quel bene. La maggior parte dei ceppi wild-type lievito dovrebbe dare un valore tempo di raddoppio tra 85 a 90 minuti. </li><li> Per ogni età-punto, calcolare il tempo di spostamento (At) nelle curve escrescenza relativi ai primi anni-punto (giorno 2). Un modo semplice per farlo è quello di determinare la differenza nella lunghezza del tempo impiegato per ogni bene per raggiungere un diametro di 0,3 tra il punto iniziale per età e ogni successiva età-point. Il tempo che un particolare così raggiunto un diametro di 0,3 può essere calcolato con l&#39;equazione di regressione lineare corrispondente alla ln (OD) in funzione del tempo tra le due parentesi OD tempo-punti = 0,3. </li><li> Calcolare la frazione di sopravvissuti ad ogni età-point al fine di generare una curva di sopravvivenza (Figura 3). Definire il punto iniziale per età (giorno 2) di essere al 100% vitalità. Per ogni successivo all&#39;età punto calcolare la percentuale di sopravvivenza con l&#39;equazione: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="Equazione secondo" width="245" height="115" /> dove s n è la percentuale di sopravvivenza, Dt n è il turno di tempo, e δ n è il tempo di raddoppio. </li><li> Generare le curve di sopravvivenza (Figura 3B) come desiderato per ciascun bene (o pozzi replica) tracciando la frazione (o percentuale) di cellule vitali in funzione dell&#39;età. </li><li> Calcolare la sopravvivenza integrale (SI) per ogni bene. SI è definita come l&#39;area sotto la curva di sopravvivenza e può essere stimato con la formula: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="Equazione 3" width="400" height="79" /> in cui l&#39;età è l&#39;età n-punto (per esempio 2, 4, 6, 9, 11 e 13) e s n è il valore di sopravvivenza a quell&#39;età-point. </li><li> Determinare parametri statistici di pozzi replicare dai dati SI e la sopravvivenza. Comuni parametri statistici di interesse: media, mediana e varianza per ogni set di replica biologico. Una t-test o analisi simile può essere utilizzato per il confronto a coppie di SI a fini sperimentali e gruppi di controllo. Può anche essere auspicabile per generare le curve di sopravvivenza, come descritto in 4.8 da media biologici replica. </li></ol> Parte 5: risultati Rappresentante Al termine dell&#39;esperimento, si dovrà tracciare la curva di sopravvivenza ed eseguito l&#39;analisi dei dati sufficienti per determinare il potenziale di invecchiamento cronologico per diversi ceppi diversi o condizioni. Se eseguita correttamente, la crescita curve ottenute dalla macchina Bioscreen C MBR dovrebbe essere simile a quelli mostrati nella Figura 2 e le curve di sopravvivenza risultante dovrebbe essere simile a quelli mostrati nella figura 3. In generale, wild-type cellule coltivate nelle condizioni descritte qui avrà una durata di vita media per ordine cronologico di 7 giorni. Sostanziale variazione nella sopravvivenza si osserva in diversi ceppi e sotto alcune condizioni, come la crescita in media del glucosio 0,05%, la sopravvivenza mediana può superare i 30 giorni. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> Figura 1. Uscita dati dal Bioscreen programma &quot;EZExperiment&quot;. Una colonna visualizza l&#39;ora in cui è stata presa una lettura di assorbanza. Colonne successive rappresentano la pozzetti della piastra a nido d&#39;ape inoculati con cellule prelevate da culture invecchiamento. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> Figura 2. Curve escrescenza da un singolo replicare biologico nel corso di un esperimento. C&#39;è uno spostamento distinto nelle curve nel tempo come le cellule nella cultura invecchiamento perdono vitalità. Il periodo di tempo tra il punto di tempo iniziale (giorno 2) e un punto di tempo successivi determina la vitalità a questa età particolare. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> Figura 3. A) Una curva di sopravvivenza generato utilizzando i dati escrescenza dalla Figura 1. I 2 punti di giorno è impostato come punto di vitalità del 100%. B), curve di sopravvivenza finale di due ceppi testati nello stesso esperimento. Queste curve di sopravvivenza Viabilità rappresentano la media di tre biologici repliche per ogni ceppo. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard all&#39;interno biologici replica. L&#39;area ombreggiata sotto la curva di sopravvivenza rappresenta la sopravvivenza integrale (SI) per il ceppo 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tabella 1. Sintetico di media definite utilizzate per cronologica Studi Invecchiamento (ceppo backgrou° BY4743) </td></tr><tr><td> Componente </td><td> Concentrazione (g / L) </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Lievito di base di azoto (-AA/AS) </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-Arginina </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-acido aspartico </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-acido glutammico </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Istidina </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Leucina </td><td> 0,3 </td></tr><tr><td> L-lisina </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-metionina </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Fenilalanina </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-Serina </td><td> 0,375 </td></tr><tr><td> L-treonina </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> L-triptofano </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-tirosina </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-Valina </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> Uracile </td><td> 0,1 </td></tr></tbody></table> Nota: Questa ricetta spiega auxotrophies diploidi BY4743 ceppo. Auxotrophies aminoacido deve essere compensata con l&#39;aggiunta di una concentrazione 5X finale al terreno sintetico completo.

<ol><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29(2008).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73(2003).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113(2008).</li>
<li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055(2004).</li>
</ol>

L&#39;high-throughput vita saggio arco cronologico qui descritto è un metodo efficace per quantificare il potenziale di invecchiamento di un gran numero di ceppi con elevata accuratezza e precisione. L&#39;anticipo principale di questo metodo rispetto ai metodi classici per stabilire la sopravvivenza contando unità formanti colonie (ad esempio vedi 3) è l&#39;uso di un dispositivo di lettura shaker / incubatore / piastra, come la macchina Bioscreen C MBR di ottenere alta risoluzione curve di crescita a ogni e...

<table><tbody><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito Bacto</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>Agar Difco</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Base di azoto per lieviti senza A.A. e A.S.</td><td>Reagente</td><td>MidSci</td><td>J630-500G</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Reagente</td><td>Spectrum</td><td>AM185</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio Bioscreen C MBR</td><td>Strumento</td><td>Growth Curves USA</td><td>5101370</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Honeycomb da 100 pozzetti Bioscreen</td><td>Strumento</td><td>Growth Curves USA</td><td>9502550</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificare cronologica span lievito life di conseguenza di cellule invecchiate

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Il lievito in erba<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Ha dimostrato di essere un organismo modello importante nel campo della ricerca sull&#39;invecchiamento<sup&gt; 1</sup&gt;. La replicazione e la durata della vita cronologico sono due paradigmi stabiliti utilizzato per studiare l&#39;invecchiamento nel lievito. Invecchiamento replicativo è definito come il numero di cellule figlie una sola cellula madre lievito produce prima di senescenza, invecchiamento cronologico è definito dalla lunghezza delle cellule tempo può sopravvivere in un non-divisione, quiescenza stato simile<sup&gt; 2</sup&gt;. Abbiamo sviluppato un elevato throughput metodo per la misurazione quantitativa della durata cronologica. Questo metodo comporta l&#39;invecchiamento delle cellule in un mezzo definito sotto agitazione ea temperatura costante. Ad ogni età-point, una sotto-popolazione di cellule viene rimosso dalla cultura invecchiamento e inoculati in terreno di coltura ricco. Ad alta risoluzione curva di crescita è quindi ottenuto per questa sotto-popolazione di cellule invecchiate con una macchina Bioscreen C MBR. Un algoritmo viene poi applicata per determinare la percentuale relativa di cellule vitali in ogni sub-popolazione basata sulla cinetica di crescita ad ogni età-point. Questo metodo richiede meno tempo e risorse rispetto ad altri saggi cronologico durata della vita, pur mantenendo la riproducibilità e precisione. L&#39;high-throughput natura di questo test dovrebbe consentire schermi genetiche e chimiche su larga scala per identificare i modificatori longevità romanzo per ulteriori test in organismi più complessi.

Invecchiamento cronologico di lievito si riferisce alla perdita di vitalità cellulare associato con il tempo in fase stazionaria. Qui si descrivono un elevato throughput metodo per determinare quantitativamente la durata della vita cronologico lievito.

Quantificare cronologica Span lievito Life di conseguenza di cellule invecchiate

Il lievito a gemma Saccharomyces cerevisiae si è dimostrato un importante organismo modello nel campo della ricerca sull'invecchiamento 1. La replicativa e...

Le colture in invecchiamento vengono mantenute in provette a 30 gradi Celsius con agitazione costante. Bio, A, un'aliquote di cellule da ciascuna coltura in invecchiamento viene inoculata in una pozzetta di una piastra honeycomb per bio screen contenente mezzo YEPD. La macchina bio screen CMBR incuba e agita la piastra honeycomb per 24 ore misurando contemporaneamente la densità ottica di ogni pozzetta.Ogni 30 minuti, è possibile generare curve di crescita dai dati prodotti dal bioscreen, che possono essere utilizzati per calcolare la vitalità di ciascuna coltura invecchiata. Dopo l'incubazione di 24 ore, le densità cellulari nella piastra a favo possono variare a seconda della vitalità della coltura invecchiata originale. Ciao, sono Chris Murakami del laboratorio del Dott. Matt Capline e del Dipartimento di Anatomia Patologica qui all'Università di Washington.Oggi vi mostreremo il procedimento per quantificare la durata della vita cronologica delle cellule di lievito mediante l'analisi della crescita delle cellule senescenti. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare come fattori genetici e ambientali influenzino la longevità del lievito. Cominciamo dunque.Per preparare colture in invecchiamento, innanzitutto effettuare un’isolazione su piastre di agar YEPD partendo da ceppi di lievito conservati congelati, quindi incubare le cellule a 30 gradi Celsius per 48 ore o fino a quando compaiono colonie singole. Una volta comparse le colonie singole, selezionarle e inocularle in cinque millilitri di mezzo liquido YEPD.In provette, coltivare le culture per tutta la notte a 30 gradi Celsius in un tamburo rotante per mantenere un'agitazione costante; dopo l'incubazione notturna, utilizzare 50 microlitri di ciascuna cultura per inoculare cinque millilitri di mezzo sintetico completo. Generalmente vengono preparate tre culture SC per ogni ceppo, al fine di ottenere una triplice replica biologica dell'analisi della durata della vita per ciascun ceppo esaminato. Mantenere le culture a 30 gradi Celsius con agitazione costante su un tamburo rotante per l'intero esperimento, che dura generalmente due settimane o più dopo due giorni di coltura.In un mezzo SC, le cellule dovrebbero trovarsi in fase stazionaria e il primo punto temporale è pronto per essere prelevato. I punti temporali successivi devono essere prelevati ogni due o tre giorni per un minimo di due settimane. Per iniziare questa procedura, preparare lo schermo biologico.Piastre alveolari da 100 pozzetti per l'inoculo, riempiendo ogni pozzetto con 145 microlitri di YEPD. Assicurarsi di lasciare almeno un pozzetto contenente solo YEPD e nessuna cellula per l'analisi successiva dei dati. Rimuovere le colture invecchiate dall'incubatore.In breve, agitare con vortice la prima coltura da inoculare nella piastra honeycomb. Avere cura di non versare alcuna parte della coltura. Flambare l'imboccatura del tubo da saggio ed estrarre cinque microlitri della coltura, trasferendoli con pipetta nel primo pozzetto della piastra honeycomb.Non dimenticare di passare l'imboccatura del tubo di prova alla fiamma. Dopo aver prelevato l'aliquota di cinque microlitri, ripeti questa procedura di inoculo per ciascuna coltura in invecchiamento. Assicurati di annotare con precisione la posizione del pozzetto corrispondente a ciascuna coltura.Le posizioni delle pozzette devono essere utilizzate per ciascun successivo punto temporale per tutta la durata dell'esperimento. Reintrodurre le colture nell'incubatore a 30 gradi Celsius. Al termine delle inoculazioni, dopo che le colture sono state inoculate nella piastra honeycomb, la piastra viene inserita nell'apparecchio Bio Screen CMBR.Per fare ciò, esporre il comparto dell'incubatore sollevando il coperchio. Quindi rimuovere la copertura del vassoio del campione. Inserire la piastra esagonale appena inoculata nel vassoio del campione.Utilizzare lo slot a sinistra. Se si sta leggendo una sola piastra, rimettere il coperchio al vassoio del campione e abbassare il coperchio del comparto dell'incubatore. È importante assicurarsi che il liquido per il trasferimento di calore sia al di sopra del livello minimo di riempimento.Se non lo è, aggiungere ulteriore fluido di trasferimento termico utilizzando una pipetta da 1000 microlitri. Utilizzando il software Easy experiment del bio screen, impostare i seguenti parametri per ottenere curve di crescita adatte per croce visi. Per il numero di campioni, inserire il numero di pozzetti con mezzo oppure 200, impostare il filtro su una banda larga da 420 a 580 nanometri.Impostare la temperatura a 30 gradi Celsius. La durata dell'esperimento deve essere di un giorno, zero ore, zero secondi. L'intervallo di misurazione deve essere di 30 minuti.Infine, impostare l'agitazione su agitazione continua e fare clic su "start" per iniziare le letture. Ottenere i file di output dalla macchina Bio Screen CMBR. Il software Easy Experiment esporterà i dati del Bio Screen in un file delimitato da tabulazioni, compatibile con Microsoft Excel e altri software.La prima colonna, colonna A, mostra il tempo in cui è stata effettuata la misurazione dell'OD durante l'esperimento. Le colonne successive rappresentano ciascun pozzetto della piastra bio screen, le piastre a favo inoculate con cellule provenienti dalle colture invecchiate. Eliminare la prima lettura dell'OD da ogni colonna poiché questa lettura costituisce un rumore di fondo.Normalizzare i dati sottraendo il valore di densità ottica del pozzetto contenente solo YEPD dai valori di densità ottica di ogni colonna. Questo elimina l'assorbanza di fondo dovuta al mezzo di coltura. Le curve di accrescimento.Le curve si sposteranno in funzione dell'età; ad esempio, tracciando le curve di crescita dalla colonna uno, pozzetto uno della piastra alveolare nei sei punti temporali, si osserva uno spostamento netto verso destra delle curve nel tempo. La durata tra il punto temporale iniziale, giorno due, e un punto temporale successivo determina la vitalità a quell'età specifica. Calcolare il tempo di raddoppio per ogni pozzetto in base alla cinetica di crescita del punto temporale al giorno due.L'equazione utilizzata per calcolare il tempo di raddoppio è la seguente, in cui OD uno e OD due rappresentano misurazioni successive della densità ottica e T uno e T due sono il tempo trascorso tra le misurazioni. Calcolare i tempi di raddoppio solo tra valori di OD compresi tra 0,2 e 0,5. La media di questi valori corrisponde al tempo di raddoppio per quello specifico caso.Beh, la maggior parte dei ceppi di lievito di tipo selvatico dovrebbe presentare un tempo di raddoppio compreso tra 85 e 90 minuti per ogni punto d'età. Calcolare lo spostamento temporale delta T nelle curve di accrescimento rispetto al punto d'età iniziale, ovvero il giorno due. Un modo semplice per farlo consiste nel determinare la differenza di tempo necessario affinché ciascun pozzetto raggiunga un valore di OD di 0,3 tra il punto d'età iniziale e ciascun punto d'età successivo.Il tempo necessario affinché una determinata pozzetta raggiungesse un OD di 0,3 può essere calcolato a partire dall'equazione della regressione lineare corrispondente al logaritmo naturale della densità ottica. Calcolare la frazione di sopravvivenza per ciascun punto d'età al fine di generare una curva di sopravvivenza, utilizzando il punto d'età iniziale del secondo giorno, che rappresenta la vitalità al 100% per ciascun punto d'età successivo. Calcolare la percentuale di sopravvivenza utilizzando la seguente equazione.Dove SN è la percentuale di sopravvivenza. Delta TN è lo spostamento temporale e Sigma N è il tempo di raddoppio. Generare le curve di sopravvivenza come desiderato per ciascuno.Tramite la rappresentazione grafica della frazione di cellule vitali in funzione dell'età, calcolare l'integrale di sopravvivenza per ogni pozzetto; l'SI è definito come l'area sottesa alla curva di sopravvivenza e può essere stimato mediante questa formula, in cui l'età N rappresenta il punto temporale e SN è il valore di sopravvivenza a quel determinato punto d'età; determinare i parametri statistici dei pozzetti replicati a partire dai dati di SI e di sopravvivenza. I parametri statistici comunemente considerati includono media, mediana e varianza per ciascun insieme di repliche biologiche. Un test T o un'analisi simile possono essere utilizzati per il confronto a coppie dell'SI tra diversi gruppi sperimentali e di controllo.Potrebbe inoltre essere utile generare curve di sopravvivenza a partire dalla media dei replicati biologici. Al termine dell'esperimento, si sarà tracciata la curva di sopravvivenza ed effettuata un'analisi dati sufficiente per determinare il potenziale di invecchiamento cronologico di diverse ceppi o condizioni. Se eseguito correttamente, le curve di crescita ottenute dal dispositivo Bio Screen CMBR dovrebbero essere simili a questa curva. In generale, le cellule di tipo selvatico coltivate nelle condizioni qui descritte avranno una durata media di vita cronologica dell'ordine di sette giorni.Si osserva una notevole variabilità nella sopravvivenza tra diversi ceppi e in alcune condizioni, come la crescita in un mezzo contenente 0,05% di glucosio, in cui la sopravvivenza mediana può superare i 30 giorni. Vi abbiamo appena mostrato un metodo ad alto rendimento per determinare quantitativamente la durata della vita cronologica del lievito. Croce visier.È importante ricordare che, durante l'esecuzione di questa procedura, la manutenzione regolare dello strumento bio screen CMBR è fondamentale per ottenere dati riproducibili e accurati. Questo è tutto. Buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per la produzione di chip microfluidici e la configurazione degli esperimenti microfluidici per misurare la durata di vita e fenotipi cellulari delle singole cellule di lievito.

Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

Presentiamo un metodo per quantificare i fenotipi di crescita delle singole cellule di lieviti in quanto crescono in colonie su supporti solidi utilizzando la microscopia a tempo scaduto denominata "Valutazione doppia di una sola cellula vivente di lievito" (ODELAY). L'eterogeneità delle popolazioni di cellule geneticamente identiche in colonie può essere direttamente osservata e quantificata.

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Qui presentiamo un protocollo per stimare il metabolismo respiratorio e fermentativo inserendo la crescita esponenziale di Saccharomyces cerevisiae per l'equazione di crescita esponenziale. Calcolo dei parametri cinetici permette per lo screening delle influenze di sostanze/composti sulla fermentazione o respirazione mitocondriale.

Saccharomyces cerevisiae Cinetica di crescita esponenziale nella cultura di Batch per analizzare il metabolismo fermentativo e respiratorio

Qui, presentiamo un'implementazione MATLAB di rilevamento automatico e descrizione quantitativa delle goccioline lipidiche nelle immagini di microscopia a fluorescenza di fissione e cellule di lievito in erba.

Analisi del contenuto delle goccioline lipidi in Fissione e lieviti in forati utilizzando l'elaborazione automatizzata delle immagini

Ecco un protocollo per identificare le interazioni genetiche attraverso uno schermo soppressore numero di copie aumentato in Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo consente ai ricercatori di identificare, clonare e testare i soppressori in mutanti di lievito di breve durata. Testiamo l'effetto dell'aumento del numero di copie di SIR2 sulla durata della vita in un mutante nullo autofagi.

Uno schermo soppressore per la caratterizzazione dei collegamenti genetici che regolano la durata cronologica in Saccharomyces cerevisiae

In questo articolo vi presentiamo un protocollo generale per la misurazione della durata di nematodi mantenuto su un supporto solido con UV ucciso cibo batterica.

Misura Caenorhabditis elegans Life Span su terreni solidi

Scopri un metodo ad alto rendimento per quantificare la durata della vita cronologica del lievito, misurando la perdita di vitalità cellulare nella fase stazionaria. Questa tecnica facilita studi su larga scala sull'invecchiamento.

Quantificare cronologica Span lievito Life di conseguenza di cellule invecchiate

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