Dendra2 Photoswitching attraverso la finestra Imaging mammaria

Questo video illustra un protocollo che inizia con l'iniezione di una linea cellulare tumorale esprimente una proteina fluorescente nel cuscinetto adiposo mammario del topo. Viene costruita una camera specializzata per l'imaging in vivo, che successivamente viene impiantata chirurgicamente nell'animale, permettendo così l'acquisizione dei dati di imaging. Ciao, sono il dottor Vic del laboratorio del dottor John Condi e del dottor Jeffrey Siegel del Biophotonics Center presso l'Albert Einstein College of Medicine.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'attivazione fotoindotta in vivo e l'immagine di cellule tumorali marcate con DRA due attraverso la finestra di imaging per memoria. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'influenza del microambiente tumorale sulla motilità delle cellule tumorali. Indossiamo quindi guanti in lattice e procediamo.

Iniziare la fabbricazione della finestra per imaging mammario, o MIW, riscaldando una piastra per colture di cinque-dieci centimetri e creando una superficie curva premendo un oggetto duro arrotondato, come una punta Dremel da un pollice, contro la piastra. Ritagliare il centro della piastra utilizzando una lametta riscaldata. Ora utilizzare una piccola punta conica Dremel per realizzare un foro dal diametro di sei-sette millimetri al centro della base di plastica a forma di cupola.

Rendere i bordi della base di plastica completamente lisci carteggiandoli con il Dremel e poi limandoli ulteriormente. Limare la parte superiore della base di plastica per creare una superficie piana per il coprioggetto di vetro. Il diametro della superficie piana ottenuta mediante limatura deve essere compreso tra nove e dieci millimetri.

Successivamente, incollare il copriletto circolare in vetro da otto millimetri. Farlo scivolare sulla superficie appiattita utilizzando colla istantanea e lasciarlo asciugare per 15 minuti. Utilizzando un ago caldo da 26 G, praticare otto fori per la sutura perforando dall'esterno verso l'interno della base; i fori devono essere distribuiti uniformemente attorno al copriletto.

Spostare di 0,5 fino a un millimetro dal bordo del vetrino coprioggetto. Lavare l'MIW con acqua deionizzata e quindi nuovamente con etanolo al 70%. Utilizzare un bastoncino di ovatta per pulire il vetro finché non diventa completamente trasparente.

Utilizzare l'acetone per rimuovere eventuali aloni residui causati dal vapore della colla. Infine, sterilizzare il MIW esponendolo alla luce ultravioletta per tre ore su ciascun lato. Prima di inserire il MIW, nell'area intorno al quarto capezzolo dovrebbe essersi sviluppato un piccolo tumore dal diametro di cinque-sette millimetri a seguito dell'iniezione delle cellule tumorali.

Nella prima parte, verificare che il tumore non sia visibilmente necrotico. L'area circostante dovrebbe presentare pelle integra con peli. Per iniziare, preparare un'area sterile per l'intervento chirurgico posizionando un pezzo di tessuto sterile all'interno di un'appa sterile.

Metti un pezzo di garza sterile al centro e raccogli gli strumenti necessari per l'intervento chirurgico. Avrai bisogno di un paio di forbici da dissezione piccole e un paio di forbici da dissezione grandi a molla, pinzette e pinze da microdissezione e un portaaighi. Dopo aver anestetizzato il topo con avertin al 2,5%, utilizza un rasoio per piccoli animali per rasare la zona sopra il tumore. Usa la crema depilatoria per rimuovere i peli residui e pulisci la pelle.

Utilizzando bastoncini di ovatta imbevuti di etanolo. Trasferire l'animale sulla garza sterile e applicare un unguento oftalmico sugli occhi per evitarne la disidratazione e l'insorgenza di infezioni. Sterilizzare la cute con Betadine e quindi detergerla con etanolo al 70%.

Con un telo chirurgico sterile e monouso, afferrare la pelle immediatamente mediale al capezzolo utilizzando pinze e praticare un'incisione di circa due millimetri. Separare il cuscinetto adiposo mammario sottostante dalla pelle mediante dissezione, forbici e pinze. Una volta separati, la pelle e il foro si allargano fino a una dimensione sufficiente per consentire l'inserimento del MIW.

Inserire l'MIW in modo che la pelle si trovi sopra la base dell'MIW e suturarlo al suo posto. Utilizzare un adesivo tissutale o cianoacrilato per riempire i fori di sutura e fissare l'MIW alla pelle. L'animale deve ora essere lasciato riposare per i successivi tre o quattro giorni prima che abbia luogo la prima sessione di imaging.

In previsione della sessione di imaging, possiamo descrivere la scatola di imaging per illustrarne l'utilizzo. Innanzitutto, anestetizzare l'animale con isoflurano e applicare un unguento oftalmico sugli occhi. Collegare lo scarico di isoflurano del macchinario per l'anestesia alla parte anteriore della scatola di imaging.

All'esterno del foro di ingresso. Collegare un secondo tubo al foro di uscita della scatola di imaging. Questo tubo deve essere collegato al filtro del gas e successivamente al vuoto.

Successivamente, posizionare l'animale in modo che il MIW sia rivolto verso il basso. Tenere la scatola e regolare le porte inferiori in modo che la base del MIW sia trattenuta e immobilizzata tra di esse. La base del MIW deve essere allo stesso livello delle porte della scatola di imaging.

Mentre il vetrino del MIW dovrebbe trovarsi a pochi millimetri al di sotto di questo livello, assicurarsi che il posizionamento del MIW tra le porte scorrevoli inferiori garantisca che il vetrino giaccia piatto e parallelo alle porte inferiori della scatola. Ciò permetterà un corretto fuoco, abbassando l'obiettivo del microscopio per creare lo spazio necessario per posizionare la scatola sopra il piano del microscopio. Regolare il piano in modo che il vetrino del MIW si trovi sopra l'obiettivo.

Ora possiamo mettere a fuoco l'obiettivo e iniziare l'acquisizione delle immagini. La procedura di acquisizione descritta qui si riferisce al microscopio confocale Leica SP five e deve essere utilizzata come guida per ottimizzare l'esperimento con il microscopio specifico in uso. Iniziare osservando il tumore attraverso l'oculare con un filtro fluorescente verde.

Individuare i vasi sanguigni principali che presentano un flusso visibile e giacciono piatti nello stesso piano focale. Posizionare uno dei vasi al centro del campo e passare al rilevamento PMT. Imposteremo l'acquisizione sequenziale delle immagini per due canali.

Un canale utilizza la linea laser a 488 nanometri e raccoglie la diffusione dalla matrice extracellulare e l'emissione dalla forma verde della dendra due. Il secondo canale utilizza la linea laser a 543 nanometri e raccoglie l'emissione dalla forma rossa della dendra due. Acquisire immagini 3D prima dell'interruttore fotoindotto.

Successivamente, utilizzare l'opzione di scansione della regione di interesse per attivare fotochimicamente una popolazione scelta di cellule mediante la linea laser a 405 nanometri. Raccogliere l'emissione dalla forma rossa della proteina al fine di monitorare l'attivazione. A questo punto, acquisire immagini 3D successive all'attivazione con lo stesso metodo utilizzato per acquisire le immagini precedenti all'attivazione.

Bene, quindi utilizzando una potenza laser del 20% nell'ultravioletto per attivare o convertire questa zona in una regione foto-commutabile, selezionare più di un'area nel tumore ed acquisire immagini attraverso gli oculari utilizzando una fotocamera digitale sia nel canale verde che in quello rosso. Questo aiuterà nell'orientamento durante le successive sessioni di acquisizione. In questa immagine, si osserva una regione foto-commutabile di forma rettangolare, orientata ortogonalmente rispetto al vaso sanguigno, che non presenta fluorescenza.

Le cellule non foto-commutabili appaiono verdi, mentre lo scattering proveniente dalla matrice extracellulare è viola. L'immagine è una proiezione di intensità massima di quattro immagini acquisite lungo l'asse Z. Vi abbiamo appena mostrato come foto-commutare e acquisire immagini di cellule marcate con RA tool attraverso la finestra di imaging della memoria.

L'utilizzo di questa procedura è fondamentale per confrontare i comportamenti delle cellule tumorali in diverse aree del tumore nel corso dei giorni. È tutto. Grazie per averci guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.