Un In Vitro Test di Irritazione (SIT) con l'epidermide umana ricostituita epidermica (RHE) Modello

Epiderm è un modello ricostruito in vitro dell'epidermide umana, derivato da cellule umane normali, sviluppato dalla Matt Tech Corporation. Il protocollo del test di irritazione cutanea Epiderm validato secondo i criteri EC VM sostituisce i tradizionali test su animali per prodotti come cosmetici, materie prime e agenti industriali che entreranno in contatto con la pelle umana. Questo test ha inizio al giorno zero, quando il kit per il test di irritazione cutanea e il tessuto Epiderm arrivano in laboratorio e vengono successivamente precondizionati in un mezzo di saggio, dopo un'incubazione notturna.

Nel primo giorno, la superficie atipica del tessuto epidermico viene esposta per un'ora a un composto irritante putativo, quindi l'irritante viene rimosso mediante un lavaggio il secondo giorno. Dopo un'incubazione di 24 ore, l'inserto di coltura viene trasferito in un mezzo fresco e il mezzo vecchio può essere utilizzato per l'analisi di citochine e chemochine rilasciate. Il tessuto viene trattato con un composto noto come MTT, che viene convertito dalla riduttasi mitocondriale in un sale viola scuro formazano.

Fornire un risultato sulla vitalità cellulare. L'assenza di colore viola scuro nel campione è un indicatore di ridotta vitalità. Quando il risultato colorimetrico per un composto in esame è inferiore al 50% di quello dei controlli negativi, il composto in esame può essere classificato come un irritante.

Ciao, sono Helena Kava della Matt Corporation. Oggi vi mostreremo il procedimento per il test di irritazione cutanea in vitro mediante un modello di epidermide umana ricostruita, epiderm. Questo procedimento, a seconda dei requisiti normativi, può essere utilizzato come sostituzione totale o parziale del test di irritazione cutanea rapida in vivo.

Questa nuova procedura in vitro può essere utilizzata per l'identificazione dei pericoli e l'etichettatura di sostanze chimiche e materiali cosmetici grezzi. Cominciamo dunque. Epiderm deriva da colture di cheratinociti epidermici umani per formare un modello tridimensionale, multistrato e altamente differenziato dell'epidermide umana.

I tessuti sono attivi mitoticamente e metabolicamente, riproducono in modo accurato i loro omologhi in vivo sia strutturalmente che biochimicamente, e lo fanno con riproducibilità garantita, proprio come l'epidermide umana. Epiderm è costituito da strati basali, spinosi e granulosi organizzati e da uno strato corneo multistratificato. Quest'ultimo contiene strati lipidici lamellari intercellulari di Miller disposti in schemi analoghi a quelli riscontrati in vivo.

Questi tessuti vengono coltivati in un mezzo privo di siero. Ogni tessuto cresce in un inserto per coltura cellulare individuale. Sono disponibili altre configurazioni, inclusa una versione ad alto rendimento in formato 96 pozzetti.

La produzione del tessuto richiede circa tre settimane per essere completata. In un punto specifico di questo processo, il tessuto viene sollevato all'interfaccia aria-liquido e tutto il liquido viene rimosso dalla superficie APIC del tessuto. I tessuti vengono nutriti esclusivamente attraverso la superficie basolaterale, che rimane a contatto con il mezzo di coltura proprietario di Mat Tech. Un kit Epiderm tipico contiene 24 tessuti, ciascuno di nove millimetri di diametro, inseriti in un proprio inserto per coltura tissutale, più il quantitativo sufficiente di mezzo per saggio per eseguire questo test di irritazione cutanea.

I 24 inserti sono posizionati saldamente su gel di agar al rosso di fenolo con mezzo, uno per ogni pozzetto di una piastra standard da 24 pozzetti; la spedizione avviene tramite corriere espresso a una temperatura di tre-quattro gradi centigradi, prima di iniziare i test con sostanze chimiche. Utilizzando il sistema di prova EPIDERM, preparare e sterilizzare tutti gli strumenti e gli utensili impiegati nel saggio come descritto nel protocollo scritto. Una parte dei materiali, come i bastoncini di cotone, deve essere fornita in confezionamento sterile oppure deve essere autoclavata.

Per sterilizzare strumenti come pinze si deve utilizzare etanolo al 70%, mentre per sterilizzare le bottiglie per lavaggi si deve ricorrere all'irradiazione UV o gamma. Due soluzioni fondamentali utilizzate nel saggio devono essere preparate in anticipo: DPBS e una soluzione al 5% di SDS. Nel saggio verranno utilizzati circa due litri di DPBS sterile a pH sette in acqua distillata, con un kit che contiene 24 tessuti epidermici.

Il DPBS sterile funge da controllo negativo e come soluzione di lavaggio. Il 5% SDS deve essere preparato e utilizzato come controllo positivo. Il saggio di irritazione cutanea inizia al ricevimento del kit EPIDERM EPI 200 SIT.

Assicurarsi di controllare l'integrità di tutti i componenti del kit e contattare immediatamente la società Mat Tech in caso di problemi; se tutto è presente, procedere al passaggio successivo. Per iniziare il test, lasciare che il mezzo di saggio fornito con il kit raggiunga la temperatura ambiente. Non preriscaldare nell'armadio a flusso laminare.

Preparare una piastra sterile a sei pozzetti per ogni tre inserti di tessuto epidermico e pipettare 0,9 millilitri di mezzo di saggio in ciascun pozzetto in condizioni sterili. Aprire il sacchetto di plastica contenente la piastra a 24 pozzetti con i tessuti epidermici in flusso sterile. Rimuovere la garza sterile e utilizzare pinze sterili per estrarre con attenzione ciascun inserto contenente il tessuto epidermico.

Rimuovere delicatamente su garza sterile o carta filtrante qualsiasi residuo di aros aderente ai lati esterni dell'inserzione. Successivamente, posizionare i tessuti in una piastra sterile da 24 pozzetti vuota entro i successivi cinque minuti. Ispezionare visivamente le inserzioni.

Registrare eventuali difetti del tessuto e un eccesso di umidità sulla superficie. Non utilizzare tessuti difettosi o tessuti completamente ricoperti di liquido.

Inserzioni di tessuto ottimali. Devono avere una superficie asciutta e essere prive di distacchi, parti irregolari o eccesso di liquido sulla superficie. Successivamente, utilizzando un bastoncino sterile con estremità in cotone, asciugare con cura la superficie dei tessuti.

Cerchi di non toccare direttamente il tessuto. Gli effetti capillari sono sufficienti per rimuovere l'umidità dalla superficie dopo l'essiccazione. Trasferisca tre tessuti alla riga superiore di ogni sei.

Piastra a pozzetti pre-riempita con 0,9 millilitri di mezzo per saggio. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate sotto gli inserti. Successivamente, posizionare le piastre a sei pozzetti contenenti gli inserti nell'incubatore per un'ora.

Preincubazione a 37 gradi Celsius. Al termine del primo periodo di preincubazione, trasferire gli inserti dai pozzetti superiori ai pozzetti inferiori della piastra a sei pozzetti. Rimettere le piastre nell'incubatore per una preincubazione notturna.

Collocare il resto del mezzo per il saggio in frigorifero. Dopo la pre-incubazione notturna, i composti da testare possono essere applicati agli inserti di tessuto epidermico. Prima di iniziare il saggio di esposizione ai composti, posizionare tutti i dispositivi necessari, le soluzioni e i composti da testare a temperatura ambiente.

Nell'ambiente sterile, pulire con etanolo al 70% tutti i flaconi di materiale non sterile prima di posizionarli all'interno della cappa. All'interno della cappa vanno posti anche il controllo negativo DPBS sterile, il controllo positivo al 5% di SDS e l'acqua distillata, tutti a temperatura ambiente. Va predisposto un flacone di grandi dimensioni per lo smaltimento dei rifiuti.

Preparare una piastra a sei pozzetti per ogni sostanza chimica riempiendo solo la fila superiore con 0,9 millilitri di mezzo di saggio per pozzetto. Etichettare ogni piastra con il numero del tessuto e il nome della sostanza chimica.

Circa cinque minuti prima dell'esposizione programmata ai prodotti chimici, rimuovere le piastre a sei pozzetti contenenti i tessuti precondizionati dall'incubatrice. Quindi valutare visivamente la superficie dei tessuti.

Rimuovere qualsiasi umidità utilizzando bastoncini di cotone sterili senza premere sulla superficie del tessuto. Infine, etichettare i coperchi della piastra a sei pozzetti con i codici o i nomi dei materiali in prova. Non testare più di sei sostanze chimiche, compresi i controlli negativi e positivi, ciascuno in triplice replicato, in un singolo ciclo di prova.

Utilizzare un'applicazione chimica e un intervallo di lavaggio di un minuto per la manipolazione di sostanze test note. Seguire le istruzioni riportate nella scheda di dati di sicurezza del materiale o MSDS per campioni codificati o sconosciuti. Rispettare le linee guida per la sicurezza chimica e utilizzare una cappa ventilata.

Indossare guanti e proteggere occhi e viso. Applicare i tessuti con sostanze chimiche a intervalli di tempo di un minuto per facilitare il risciacquo dei composti in prova dopo l'esposizione; mantenere le piastre con i tessuti da trattare all'interno della cappa a flusso laminare fino a quando l'ultimo tessuto non è stato trattato. Una pipetta con estremità a bulbo verrà utilizzata durante tutta la procedura per manipolare il tessuto e i composti in prova. La fiamma del becco Bunsen può essere utilizzata per creare la punta a forma di bulbo per testare sostanze chimiche liquide.

Distribuire 30 microlitri del campione liquido direttamente sulla superficie del tessuto e avviare immediatamente il cronometro in modo che conti in avanti. Posizionare la maglia di nylon sulla superficie del tessuto. Quando il cronometro raggiunge un minuto, aggiungere il secondo composto liquido. Utilizzare tre tessuti per ogni sostanza chimica da testare, ricordando di aggiungere ciascun composto a intervalli di un minuto.

Per testare sostanze semisolide, utilizzare una pipetta a spostamento positivo per dispensare 30 microlitri direttamente sulla superficie del tessuto. Se necessario, distribuire il prodotto chimico con una pipetta Pasteur in modo da coprire interamente l'area del tessuto. Poco prima dell'applicazione della sostanza solida, inumidire la superficie del tessuto con 25 microlitri di DPBS sterile per migliorare il contatto tra la superficie del tessuto e il prodotto chimico da testare; riempire quindi un cucchiaino applicatore da 25 milligrammi con il materiale da test finemente polverizzato.

Applicare il prodotto chimico solido in prova sulla superficie del tessuto. Se necessario, utilizzare una pipetta sterile con bulbo per svuotare completamente il cucchiaino. Agitare delicatamente gli inserti per favorire la distribuzione del solido sulla superficie.

È possibile utilizzare anche la punta a bulbo della pipetta per adattarsi alla dimensione del tessuto. Non premere sulla superficie del tessuto. Infine, applicare DPBS come controllo negativo e 5% SDS come controllo positivo agli inserti di tessuto, anch'essi in triplicato, dopo aver somministrato l'ultimo tessuto, quindi trasferire tutte le piastre in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per 35 minuti più o meno uno.

Durante questa incubazione, assicurarsi di posizionare tutti i materiali necessari per i passaggi di lavaggio nella cappa. Al termine dell'incubazione di 35 minuti, rimuovere tutte le piastre dall'incubatore. Posizionarle nella cappa sterile e attendere un periodo di 60 minuti affinché l'esposizione chimica sia completata per il tessuto della prima dose.

Successivamente, iniziare la procedura di lavaggio. Risciacquare i tessuti con DPBS sterile per 15 volte. Per rimuovere qualsiasi residuo del materiale in prova, riempire l'inserto del tessuto utilizzando un flusso costante di DPBS erogato a 1,5 centimetri dalla superficie del tessuto e quindi svuotarlo.

Assicurarsi che il flusso di DPBS non sia troppo debole, altrimenti la sostanza in esame non verrà rimossa. Ricordare di mantenere l'intervallo di tempo di un minuto per il lavaggio di quattro inserti con una rete in nylon, lavando cinque volte e rimuovendo con cura la rete con pinzette appuntite. Proseguire quindi con i restanti 10 lavaggi dopo il 15°, risciacquando con la bottiglia per lavaggi completamente immersa l'inserto tre volte con 150 millilitri di DPBS e agitando per rimuovere il residuo del materiale in esame.

Infine, risciacquare il tessuto. Inserire una volta dall'interno e una volta dall'esterno con DPBS sterile. Rimuovere l'eccesso di DPBS dal tessuto agitando delicatamente l'inserzione e tamponandola sulla carta da filtro sterile.

Successivamente, trasferire i supporti con i tessuti trasferiti sulla membrana nella nuova piastra a sei pozzetti precedentemente riempita con il mezzo per il saggio. Ricordare ancora una volta che tutti questi passaggi devono essere eseguiti entro l'intervallo di un minuto per mantenere il tempo di esposizione di 60 minuti per ciascun campione esposto. Dopo aver risciacquato l'ultimo tessuto, asciugare attentamente la superficie di ciascun tessuto con un bastoncino sterile con estremità di cotone.

Se tracce della sostanza chimica sono ancora presenti sulla superficie, provare a rimuoverle utilizzando il bastoncino di cotone sterile. Infine, incubare i tessuti nell'incubatrice per le successive 24 ore. Registrare l'ora di inizio dell'incubazione sul foglio di documentazione dei metodi.

Registrare anche tutte le diverse applicazioni nel foglio di documentazione del metodo. Allegare la procedura operativa standard fornita dalla Mat Tech Corporation per lo spostamento delle piastre nella cappa. Trasferire l'inserto nella parte inferiore della piastra a sei pozzetti precedentemente riempita con 0,9 millilitri di mezzo.

Raccogliere il mezzo dalla fila superiore e trasferirlo in una piastra a 24 pozzetti pre-etichettata, che verrà quindi posta a meno 20 gradi Celsius. L'analisi delle citochine e/o chemochine rilasciate nel mezzo di coltura è un passaggio facoltativo da eseguire prima dell'analisi. Proseguire con l'incubazione per altre 18 più o meno tre ore per il saggio MTT; etichettare 2 piastre a 24 pozzetti con i nomi chimici o i codici.

Ricordare che l'MTT è tossico, quindi indossare guanti protettivi durante la manipolazione. Preparare la soluzione di MTT scongelando il concentrato e diluendolo con il diluente per MTT.

Proteggere dalla luce poiché il MTT è sensibile alla luce e utilizzarlo entro due o tre ore. Poiché il MTT si degrada nel tempo, pipettare 300 microlitri di mezzo MTT in ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Rimuovere ora le piastre a 6 pozzetti dall'incubatore.

Asciugare delicatamente il fondo degli inserti su carta da filtro e trasferirli nella piastra a 24 pozzetti precedentemente riempita con MTT. Posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore e incubare per tre ore. Ricordare di registrare l'orario di inizio dell'incubazione con MTT nel MDS e rispettare rigorosamente il tempo di incubazione di tre ore per evitare letture diverse di MTT. Al termine dell'incubazione con MTT, utilizzare una pompa da vuoto con trappola per rifiuti tossici per aspirare delicatamente il mezzo contenente MTT da tutti i pozzetti.

Riempire nuovamente le pozzette con DPBS ed aspirare. Ripetere nuovamente questo risciacquo altre due volte e assicurarsi che i tessuti siano asciutti dopo l'ultima aspirazione. Dopo i lavaggi, trasferire gli inserti in una nuova piastra a 24 pozzette e immergere gli inserti pipettando delicatamente due millilitri di soluzione estrattiva in ciascun inserto.

Il livello salirà al di sopra dei bordi superiori dell'inserzione, coprendo così completamente i tessuti da entrambi i lati. Sigillare la piastra a 24 pozzetti utilizzando un sigillatore termico o parafilm per inibire l'evaporazione dell'estratto. Registrare l'orario di inizio dell'estrazione sul foglio di documentazione delle metodiche ed eseguire l'estrazione per almeno due ore a temperatura ambiente con agitazione delicata su un agitatore per piastre. Al termine del periodo di estrazione, perforare gli inserti con un ago da iniezione o con la punta a bulbo della pipetta e lasciare che l'estratto defluisca nel pozzetto da cui è stato prelevato l'inserzione.

Scartare gli inserti perforati e pipettare la soluzione nel pozzetto su e giù tre volte fino a quando non è omogenea. Per ogni tessuto si può utilizzare anche un agitatore per piastre impostato a 120 giri al minuto. Trasferire due aliquote da 200 microlitri della soluzione di formazano blu in una piastra microtitolatrice a 96 pozzetti con fondo piatto.

Trasferire le duplicazioni seguendo lo schema fisso della piastra indicato nel foglio di calcolo allegato a questo protocollo video per i bianchi. Utilizzare isopropanolo, leggere la densità ottica (OD) con uno spettrofotometro per piastre a 96 pozzetti utilizzando una lunghezza d'onda di 570 nanometri, senza impiegare un filtro di riferimento. Inserire i risultati nel foglio di calcolo per il calcolo automatico degli stessi.

Tenere conto delle correzioni dovute all'interferenza del prodotto chimico in esame come indicato nel protocollo allegato; un prodotto chimico in esame viene classificato come irritante. Se la percentuale di vitalità del tessuto è inferiore o uguale al 50% a seguito dell'analisi spettrofotometrica, l'OD a 570 dei tessuti NC è maggiore o uguale a 1 e minore o uguale a 2,5, e la vitalità media dei tessuti PC espressa come percentuale rispetto ai tessuti del controllo negativo è inferiore al 20%, e la deviazione standard (SD) calcolata dalle singole percentuali di vitalità tessutale di tre replicati trattati in modo identico è inferiore all'18%, i composti che producono valori di vitalità cellulare inferiori al 50% possono essere considerati irritanti.

È stato appena illustrato come eseguire il test di irritazione cutanea validato di 60 minuti e 42 ore utilizzando il modello di cute umana ricostruita Epiderm. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che la maggior parte del test viene effettuata in condizioni sterili o asettiche. Se si rende necessaria una modifica del metodo o se è richiesta una spiegazione più dettagliata di uno qualsiasi dei passaggi della procedura, non esitare a contattarci per ottenere aiuto e consulenza.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.