Name: Un In Vitro Test di Irritazione (SIT) con lepidermide umana ricostituita epidermica (RHE) Modello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-13T21:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 16 s
Description: Scopri il test di irritazione cutanea EpiDerm in vitro con epidermide umana ricostruita per valutare la sicurezza di cosmetici e farmaci. Questo metodo validato sostituisce i test animali con risultati riproducibili.

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Gli autori desiderano ringraziare per ZEBET al BfR (Germania), BASF SE (Germania), IIVS Inc. (USA), Zet-LSL (Austria) per la partecipazione in studio multicentrico di validazione internazionale della EpiDerm Modified SIT (5 ).

I. condizionamento del tessuto - Giorno 0 <ol><li> Una volta ricevuta la EPI-200-SIT kit EpiDerm, controllare tutti i componenti del kit per l'integrità (per i dettagli vedi tabella kit di reagenti e attrezzature specifiche). </li><li> Per ogni tre tessuti EpiDerm, preparare uno sterile 6 pozzetti pre-riempite con 0,9 ml di terreno di coltura. </li><li> In condizioni sterili, aprire il sacchetto di plastica contenente il 24 pozzetti contenenti i tessuti EpiDerm e rimuovere la garza sterile. </li><li> Usa pinza sterile per rimuovere ogni inserto contenente il tessuto EpiDerm e posto l'inserto nel vuoto a 24 pozzetti. Durante questa fase, rimuovere qualsiasi residuo di spedizione agarosio che aderisce ai lati esterni della inserto assorbente da dolci su carta da filtro sterile. </li><li> Entro i prossimi 5 minuti, ispezionare visivamente i tessuti. Non utilizzare tessuti difettosi o tessuti che sono completamente coperti di liquido. </li><li> Utilizzando un tampone sterile punta del cotone, accuratamente asciugare la superficie dei tessuti. Cerca di non toccare il tessuto direttamente - effetti capillari sono sufficienti per eliminare l'umidità dalla superficie del tessuto. </li><li> Dopo l'essiccazione la superficie del tessuto, il trasferimento di tre tessuti alla riga superiore del 6-pozzetti pre-riempite con 0,9 ml di terreno di coltura. Fuoriuscire eventuali bolle d'aria intrappolate sotto gli inserti. </li><li> Luogo il 6-pozzetti contenenti gli inserti in incubatore per 60 ± 5 minuti di pre-incubazione a 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% RH (umidità relativa). </li><li> Alla fine del ± 60 5 minuti pre-periodo di incubazione, trasferire gli inserti dai pozzetti superiori nei pozzi inferiore del 6 pozzetti. Posizionare le piastre di nuovo nel incubatore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% UR) per una notte di pre-incubazione (18 ± 3 ore). </li><li> Mettere il resto del terreno di coltura in frigorifero (5 ± 3 ° C). Dopo la notte di pre-incubazione, sostanze chimiche in esame può essere applicata ai tessuti EpiDerm. Nota: La procedura di pre-incubazione può essere abbreviato in caso di consegna tardiva dei tessuti (ad esempio se i tessuti arriva il Mercoledì, invece di Martedì). </li></ol> II. Esposizione chimica - Giorno 1 <ol><li> Preparare un 6 pozzetti per composto chimico in esame, compilando la riga superiore solo con 0,9 ml per pozzetto di terreno di coltura. </li><li> Circa 5 minuti prima della prevista esposizione a sostanze chimiche, rimuovere il 6-pozzetti contenenti la pre-condizione tessuti dal termostato. </li><li> Valutare la superficie dei tessuti e rimuovere l'umidità con punte di cotone sterile. </li><li> Etichettare tutti i 6 e coperchi piastra con i codici del materiale di prova o di nomi. </li><li> Dose i tessuti con i prodotti chimici prova a intervalli di 1 minuto per facilitare il risciacquo delle sostanze chimiche di prova dopo l'esposizione. Mantenere le piastre con i tessuti dosato nel cappuccio sterile, fino a quando il tessuto ultima è dosato. </li><li> Per testare sostanze chimiche liquide, dispensare 30 microlitri della soluzione direttamente in cima al tessuto e posizionare la rete di nylon sulla superficie dei tessuti. Se necessario, delicatamente posizione la maglia con il bulbo di vetro a capo pipetta Pasteur. Non premere sulla superficie del tessuto. </li><li> Per semisolidi prova, utilizzare una pipetta spostamento positivo per erogare 30 microlitri direttamente sopra il tessuto. Se necessario diffondere la chimica con pipetta Pasteur per coprire la superficie del tessuto il più possibile. </li><li> Per i materiali solidi, poco prima applicazione della sostanza in esame, inumidire la superficie del tessuto con 25 ml di DPBS sterile. Ciò permetterà di migliorare il contatto della superficie del tessuto con la sostanza chimica di prova. Riempire un cucchiaio 25 mg calibrato applicazione vivi (o qualsiasi altro strumento appropriato) con circa 25 mg di materiale finemente prova a terra. Applicare la chimica solida prova sulla superficie del tessuto. Se necessario, utilizzare una lampadina a capo pipetta Pasteur di svuotare completamente il cucchiaio. Agitare delicatamente gli inserti di migliorare la diffusione del solido sulla superficie. </li><li> Per le sostanze test con consistenza cerosa, cercare di formare un "cookie come" piatto pezzo di circa 8 mm di diametro e metterlo in cima al tessuto, che è stato precedentemente bagnato con DPBS sterile. Per migliorare il contatto tra la sostanza di prova e dei tessuti, appesantire il "cookie" con un acciaio inossidabile o di un aiuto di plastica. </li><li> Applicare DPBS come il controllo negativo e il 5% SDS come controllo positivo ai tessuti di controllo. </li><li> Dopo la somministrazione del tessuto scorso, il trasferimento di tutti i piatti per 35 ± 1 minuti alla umidificata incubatore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% di UR). </li><li> Dopo il 35 ± 1 minuti di incubazione a 37 ° C togliere tutti i piatti dal termostato. Posizionare le piastre all'interno della cappa sterile e attendere un periodo di 60 minuti di esposizione chimica è completata per il tessuto prima dosato. </li><li> Successivamente avviare la procedura di lavaggio utilizzando il un inserto per intervallo di tempo minuto (per assicurazionee che il tempo di esposizione totale per ogni inserto è di 60 minuti). </li><li> Utilizzare una bottiglia di lavaggio per lavare i tessuti con DPBS sterile. Riempire il tessuto inserire 15 volte utilizzando un flusso costante di DPBS e svuotarlo (Nota:. Per i tessuti con una maglia di nylon, lavare la superficie del tessuto 5 volte e rimuovere la rete accuratamente con la punta, pinze taglienti In seguito, proseguono con gli altri 10 lavaggi). </li><li> Dopo il 15 risciacquare con la bottiglia di lavaggio, completamente immergere il 3 volte inserto in 150 DPBS ml e agitare per rimuovere il resto del materiale di prova. </li><li> Infine, sciacquare l'inserto tessuto una volta dal di dentro e una volta dall'esterno con DPBS sterile. </li><li> Rimuovere l'eccesso di DPBS dal tessuto agitando delicatamente l'inserto, e assorbente che sulla carta assorbente sterile. </li><li> Trasferire gli inserti di tessuto cancellati per la nuova piastra a 6 e in precedenza pre-riempite con terreno di coltura. Tutti questi passaggi (14-18) deve essere effettuata entro 1 minuto per ogni inserto. </li><li> Dopo l'ultima tessuto è risciacquato accuratamente asciugare la superficie di ogni tessuto con un tampone di cotone sterile con punta. </li><li> Incubare i tessuti nell'incubatrice per i prossimi 24 ± 2 ore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% di UR). Nota: Ogni tecnico saggio non dovrebbe testare più di 6 sostanze in esame inclusi i controlli negativi e positivi in una corsa di prova singola (set), per poter seguire il protocollo come descritto di seguito </li></ol> III. Mezzo di scambio - Giorno 2 <ol><li> Dopo il 24 ± 2 ore post-incubazione, trasferire gli inserti nella parte inferiore del 6 pozzetti, pre-riempita con 0,9 ml di media. Media da file superiori possono essere raccolti per l'analisi degli endpoint addizionale (citochine, chemochine, ecc.) Analisi degli endpoint secondario è facoltativo. </li><li> Continuare con la post-incubazione (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% UR) per un altro 18 ± 3 ore. </li></ol> IV. MTT Assay Fattibilità - Giorno 3 <ol><li> Etichettare due piastre da 24 pozzetti con i nomi chimici o codici. Una piastra servirà per l'incubazione del tessuto con MTT e l'altra per la fase di estrazione. </li><li> Preparare la soluzione MTT da scongelamento il concentrato MTT (5 mg / ml) e diluire con il diluente MTT. Concentrazione finale della soluzione MTT è di 1 mg / ml. </li><li> Pipettare 300 ml di soluzione MTT in ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti. </li><li> Rimuovere il 6-pozzetti da incubatore, asciugare la parte inferiore degli inserti su una carta assorbente, e trasferirli in 24 pozzetti pre-riempite con MTT. </li><li> Posizionare il 24 pozzetti in incubatrice (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% UR) e incubare per 3 ore ± 5 min. Rispettare rigorosamente le 3 ore ± 5 minuti il ​​tempo di incubazione per evitare di scostamento tra MTT letture diverse. </li><li> Quando l'incubazione MTT è completo, utilizzare una pompa di aspirazione per aspirare delicatamente il medium MTT da tutti i pozzi. </li><li> Riempire i pozzetti con DPBS ed aspirare di nuovo. Ripetere questa lavaggio due volte di più e fare in modo che i tessuti sono a secco dopo l'aspirazione ultima. </li><li> Dopo il trasferimento lava gli inserti di un nuovo 24-pozzetti. Immergere gli inserti pipettando gentilmente 2 ml di soluzione estraente (isopropanolo) in ogni inserto. Il livello si alzerà sopra il bordo superiore dell'inserto, così completamente sommergere i tessuti. </li><li> Sigillare il 24 pozzetti (per esempio con Parafilm o con borsa di tenuta) per inibire l'evaporazione estraente. Estrarre il MTT dai tessuti per almeno 2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente su un agitatore (~ 120 rpm). Estrazione durante la notte senza agitazione può anche essere usato. </li><li> Dopo il periodo di estrazione è completa, perforare gli inserti con un ago da iniezione o bulbo perline pipetta Pasteur e consentire l'estratto a correre nel pozzo da cui ha tratto l'inserto. </li><li> Scartare l'inserto forato e pipetta la soluzione nel bene su e giù per tre volte fino a quando non è omogenea. </li><li> Per ogni tessuto, trasferire due aliquote 200 microlitri della soluzione viola formazano in un piatto fondo piatto da 96 pozzetti per microtitolazione. Trasferire i duplicati secondo il disegno piastra fissa dato nel foglio di calcolo che accompagna questo protocollo video. Per spazi vuoti, usare isopropanolo. </li><li> Leggere la densità ottica (OD) degli estratti MTT in uno spettrofotometro piastra a 96 pozzetti utilizzando una lunghezza d'onda di 570 nm (540-580), senza un filtro di riferimento. </li><li> Inserire i risultati nel foglio di calcolo per il calcolo automatico dei risultati (Figura 1). </li><li> Una sostanza in esame è etichettato 'irritante' (R38 o categoria GHS 2) la vitalità del tessuto percentuale determinata mediante test MTT è &lt;50% rispetto al controllo negativo. Nota: MTT è tossico, quindi assicuratevi di indossare guanti protettivi quando si maneggia. Proteggere MTT e il suo modolutions dalla luce, dal momento che MTT è sensibile alla luce. Usare la soluzione MTT poche ore dopo la preparazione perché si degrada nel tempo. </li></ol> Qualità saggio V. Controlli <ul><li> EpiDerm EPI-200-SIT kit Criteri di accettazione: Modelli in vitro RHE dovrebbero fornire dati coerenti, di alta qualità nel tempo, non solo durante il processo di convalida (8). Linee guida consigliate per assicurare a lungo termine la riproducibilità del test e le prestazioni sono "caratterizzazione completa di cellule o tessuti, il campionamento di ciascun lotto ... per le prestazioni e l'uso regolare dei controlli e prodotti chimici di riferimento per fornire garanzia di costanza di rendimento saggio" (9) . Oltre a criteri di accettazione del test descritta di seguito, ogni lotto di produzione di EpiDerm è il controllo di qualità testati dal produttore nei confronti di un prodotto chimico di riferimento aggiuntivo (1% Triton X-100). Il tempo di esposizione necessario per ridurre la vitalità del tessuto al 50% (ET-50) per il Triton X-100 è determinata. Per EpiDerm, media annua ET-50 i valori hanno spaziato da 5,9 ore a 7,5 ore. Il lotto di CV molto per tessuti di controllo negativo (cioè la variabilità della redditività di base) è stato in media sotto il 7,5% per ogni anno dal 1996. Il ET50 valore di ogni lotto di produzione deve rientrare nel 2 deviazioni standard rispetto alla media storica Triton X-100 ET50 fondata nel 1996 (cioè ET-50 = 6.7 ore, limite inferiore = 4.8h accettazione; limite di accettazione superiore = 8.7h), al fine per essere rilasciato per l'utilizzo da parte del fabbricante. </li><li> EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 1: controllo negativo: L'OD assoluto del controllo negativo (NC), tessuti (trattati con DPBS sterili) nel MTT-test è un indicatore della vitalità del tessuto ottenuto in laboratorio di test dopo la spedizione e l'archiviazione delle procedure e in particolari condizioni di utilizzo. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la media OD 570 di tessuti NC è ≥ 1,0 e ≤ 2,5. </li><li> EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 2: controllo positivo Una soluzione al 5% SDS (in H 2 O) è usato come controllo positivo (PC) e testato in concomitanza con le sostanze chimiche di prova. Significa Concurrent che il PC deve essere testato in ogni test, ma non più di un PC di test è richiesto per giorno. Vitalità del controllo positivo dovrebbe essere entro l'intervallo di confidenza al 95% dei dati storici. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la vitalità dei tessuti PC media espressa come% del tessuto di controllo negativo è del 20%. </li><li> EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 3: Deviazione Standard (SD) L'irritazione cutanea è previsto dalla vitalità medio determinato il 3 singoli tessuti e quindi la variabilità delle repliche di tessuto devono essere accettabilmente basso. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la SD calcolato Viabilità singoli tessuti% dei 3 identicamente trattati replica è &lt;18%. </li></ul> Rappresentante Risultati <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Figura 1"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Figura 2"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Figura 3"> </div> Figura 1 I risultati ottenuti per 6 articoli di prova, CN e controllo da PC -. Parte del foglio di calcolo automatico per il calcolo dei risultati. Test di prodotti chimici che hanno ridotto la vitalità del tessuto al di sotto del 50% riferito a NC sono classificate come irritanti. Il test è ottimizzato per fornire risultati che sono sufficientemente lontano dalla classificazione cut-off (50% vitalità), aumentando così la robustezza del test. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Materiale </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Elencare le materie">

<ol><li>Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li>
<li>Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li>
<li>Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Skin+Irritation+Test%3A+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation%3A+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li>
<li>Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).</li>
<li>United Nations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labeling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS)</a>. , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).</li>
<li>ESAC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Statement+on+the+Scientific+Validity+of+In-Vitro+Tests+for+Skin+Irritation+Testing%22">Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing</a>. , ESAC. (2008).</li>
<li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Issues+and+answers%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li>
<li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Current+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li>
</ol>

Gli autori sono dipendenti della MatTek Corporation, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

In questo video, abbiamo dimostrato il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) sviluppato e validato per i test di irritazione cutanea in vitro di sostanze chimiche, tra cui ingredienti cosmetici e farmaceutici. Quando si esegue questo metodo, è importante lavorare in condizioni asettiche e di seguire rigorosamente il protocollo validato, in quanto deviazione dal protocollo possono causare risultati diversi. Alcune modifiche del test sono possibili, tuttavia, le modifiche al protocollo dovrebbero essere discusse direttamente con gli autori. L&#39;unica limitazione di questo metodo è una possibile interferenza della sostanza in esame con l&#39;endpoint MTT. Una sostanza colorata o quella che riduce direttamente MTT (e mima quindi deidrogenasi dei mitocondri cellulari) possono interferire con l&#39;endpoint MTT. Tuttavia, queste sostanza in esame sono un problema solo se al momento del test MTT (ossia 42 ore dopo l&#39;esposizione della sostanza in esame), una quantità sufficiente di sostanza in esame sono ancora presenti sul (o nel) tessuti. Nel caso di questa eventualità, il (vero) riduzione MTT metabolica e il contributo di un materiale di prova o di colore (false) riduzione MTT diretto da parte del materiale in esame può essere quantificata mediante una procedura descritta in dettaglio nella procedura standard di funzionamento del test forniti da MatTek Corp.

un in vitro</empelle> test di irritazione (sit) con l&#39;epidermide umana ricostituita epidermica (rhe) modello

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

Il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) è stato sviluppato<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; E convalidato<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Per<em&gt; In vitro</em&gt; Test di irritazione cutanea di sostanze chimiche, tra cui ingredienti cosmetici e farmaceutici. Il SIT EpiDerm utilizza il 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Ricostruito epidermico umano (RHE) EpiDerm modello. La procedura descritta in questo protocollo permette di discriminazione tra gli irritanti di categoria GHS 2 e non irritanti<sup&gt; (6)</sup&gt;. Il test viene eseguito nel corso di un periodo di tempo 4 giorni, composto di pre-incubazione, 60 minuti di esposizione, 42 ore di post-incubazione e vitalità saggio MTT. Dopo aver ricevuto i tessuti e pernottamento pre-incubazione (giorno 0), i tessuti hanno argomenti esposti a sostanze chimiche in esame (giorno 1), che può essere liquido, semi-solidi, solidi o cera. Tre i tessuti sono utilizzati per ogni sostanza chimica di prova, così come per il controllo positivo (5% aq. Soluzione SDS), e un controllo negativo (DPBS). L&#39;esposizione chimica dura 60 minuti, 35 minuti di cui sono conservati i tessuti in un incubatore a 37 ° C. Le sostanze in esame vengono poi rimossi dalla superficie del tessuto da una procedura di lavaggio estesa. Gli inserti di tessuto sono cancellati e trasferiti a mezzo fresco. Dopo un periodo di 24 ore di incubazione (Giorno 2), il mezzo è scambiata. Il mezzo può essere salvate per ulteriori analisi delle citochine o di altri endpoint di interesse. Dopo lo scambio di media, i tessuti vengono incubate per altre 18 ore. Al termine della 42h intero post-incubazione (giorno 3), i tessuti vengono trasferiti in soluzione MTT giallo e incubate per 3 ore. La risultante viola-blu sale formazan, formato principalmente attraverso il metabolismo mitocondriale, viene estratto per 2 ore con isopropanolo. La densità ottica del formazan estratto è determinato utilizzando uno spettrofotometro. Una sostanza chimica è classificato come un irritante la vitalità del tessuto rispetto al controllo negativo tessuti trattati è ridotta sotto il 50%. Questa procedura può essere utilizzata come sostituzione completa dei test di irritazione cutanea coniglio vivo per la identificazione dei pericoli e di etichettatura dei prodotti chimici in linea con le normative UE<sup&gt; (7)</sup&gt;.

In questo video, dimostriamo il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) sviluppato e validato per<em&gt; In vitro</em&gt; Test di irritazione cutanea di sostanze chimiche, tra cui ingredienti cosmetici e farmaceutici.

Un In Vitro</emPelle> Test di Irritazione (SIT) con l&#39;epidermide umana ricostituita epidermica (RHE) Modello

Il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) è stato sviluppato (1,2,3) e validato (4,5) per il test di irritazione cutanea in vitro di sostanze chimiche, tra cui...

Epiderm è un modello ricostruito in vitro dell'epidermide umana, derivato da cellule umane normali, sviluppato dalla Matt Tech Corporation. Il protocollo del test di irritazione cutanea Epiderm validato secondo i criteri EC VM sostituisce i tradizionali test su animali per prodotti come cosmetici, materie prime e agenti industriali che entreranno in contatto con la pelle umana. Questo test ha inizio al giorno zero, quando il kit per il test di irritazione cutanea e il tessuto Epiderm arrivano in laboratorio e vengono successivamente precondizionati in un mezzo di saggio, dopo un'incubazione notturna.Nel primo giorno, la superficie atipica del tessuto epidermico viene esposta per un'ora a un composto irritante putativo, quindi l'irritante viene rimosso mediante un lavaggio il secondo giorno. Dopo un'incubazione di 24 ore, l'inserto di coltura viene trasferito in un mezzo fresco e il mezzo vecchio può essere utilizzato per l'analisi di citochine e chemochine rilasciate. Il tessuto viene trattato con un composto noto come MTT, che viene convertito dalla riduttasi mitocondriale in un sale viola scuro formazano.Fornire un risultato sulla vitalità cellulare. L'assenza di colore viola scuro nel campione è un indicatore di ridotta vitalità. Quando il risultato colorimetrico per un composto in esame è inferiore al 50% di quello dei controlli negativi, il composto in esame può essere classificato come un irritante.Ciao, sono Helena Kava della Matt Corporation. Oggi vi mostreremo il procedimento per il test di irritazione cutanea in vitro mediante un modello di epidermide umana ricostruita, epiderm. Questo procedimento, a seconda dei requisiti normativi, può essere utilizzato come sostituzione totale o parziale del test di irritazione cutanea rapida in vivo.Questa nuova procedura in vitro può essere utilizzata per l'identificazione dei pericoli e l'etichettatura di sostanze chimiche e materiali cosmetici grezzi. Cominciamo dunque. Epiderm deriva da colture di cheratinociti epidermici umani per formare un modello tridimensionale, multistrato e altamente differenziato dell'epidermide umana.I tessuti sono attivi mitoticamente e metabolicamente, riproducono in modo accurato i loro omologhi in vivo sia strutturalmente che biochimicamente, e lo fanno con riproducibilità garantita, proprio come l'epidermide umana. Epiderm è costituito da strati basali, spinosi e granulosi organizzati e da uno strato corneo multistratificato. Quest'ultimo contiene strati lipidici lamellari intercellulari di Miller disposti in schemi analoghi a quelli riscontrati in vivo.Questi tessuti vengono coltivati in un mezzo privo di siero. Ogni tessuto cresce in un inserto per coltura cellulare individuale. Sono disponibili altre configurazioni, inclusa una versione ad alto rendimento in formato 96 pozzetti.La produzione del tessuto richiede circa tre settimane per essere completata. In un punto specifico di questo processo, il tessuto viene sollevato all'interfaccia aria-liquido e tutto il liquido viene rimosso dalla superficie APIC del tessuto. I tessuti vengono nutriti esclusivamente attraverso la superficie basolaterale, che rimane a contatto con il mezzo di coltura proprietario di Mat Tech. Un kit Epiderm tipico contiene 24 tessuti, ciascuno di nove millimetri di diametro, inseriti in un proprio inserto per coltura tissutale, più il quantitativo sufficiente di mezzo per saggio per eseguire questo test di irritazione cutanea.I 24 inserti sono posizionati saldamente su gel di agar al rosso di fenolo con mezzo, uno per ogni pozzetto di una piastra standard da 24 pozzetti; la spedizione avviene tramite corriere espresso a una temperatura di tre-quattro gradi centigradi, prima di iniziare i test con sostanze chimiche. Utilizzando il sistema di prova EPIDERM, preparare e sterilizzare tutti gli strumenti e gli utensili impiegati nel saggio come descritto nel protocollo scritto. Una parte dei materiali, come i bastoncini di cotone, deve essere fornita in confezionamento sterile oppure deve essere autoclavata.Per sterilizzare strumenti come pinze si deve utilizzare etanolo al 70%, mentre per sterilizzare le bottiglie per lavaggi si deve ricorrere all'irradiazione UV o gamma. Due soluzioni fondamentali utilizzate nel saggio devono essere preparate in anticipo: DPBS e una soluzione al 5% di SDS. Nel saggio verranno utilizzati circa due litri di DPBS sterile a pH sette in acqua distillata, con un kit che contiene 24 tessuti epidermici.Il DPBS sterile funge da controllo negativo e come soluzione di lavaggio. Il 5% SDS deve essere preparato e utilizzato come controllo positivo. Il saggio di irritazione cutanea inizia al ricevimento del kit EPIDERM EPI 200 SIT.Assicurarsi di controllare l'integrità di tutti i componenti del kit e contattare immediatamente la società Mat Tech in caso di problemi; se tutto è presente, procedere al passaggio successivo. Per iniziare il test, lasciare che il mezzo di saggio fornito con il kit raggiunga la temperatura ambiente. Non preriscaldare nell'armadio a flusso laminare.Preparare una piastra sterile a sei pozzetti per ogni tre inserti di tessuto epidermico e pipettare 0,9 millilitri di mezzo di saggio in ciascun pozzetto in condizioni sterili. Aprire il sacchetto di plastica contenente la piastra a 24 pozzetti con i tessuti epidermici in flusso sterile. Rimuovere la garza sterile e utilizzare pinze sterili per estrarre con attenzione ciascun inserto contenente il tessuto epidermico.Rimuovere delicatamente su garza sterile o carta filtrante qualsiasi residuo di aros aderente ai lati esterni dell'inserzione. Successivamente, posizionare i tessuti in una piastra sterile da 24 pozzetti vuota entro i successivi cinque minuti. Ispezionare visivamente le inserzioni.Registrare eventuali difetti del tessuto e un eccesso di umidità sulla superficie. Non utilizzare tessuti difettosi o tessuti completamente ricoperti di liquido.Inserzioni di tessuto ottimali. Devono avere una superficie asciutta e essere prive di distacchi, parti irregolari o eccesso di liquido sulla superficie. Successivamente, utilizzando un bastoncino sterile con estremità in cotone, asciugare con cura la superficie dei tessuti.Cerchi di non toccare direttamente il tessuto. Gli effetti capillari sono sufficienti per rimuovere l'umidità dalla superficie dopo l'essiccazione. Trasferisca tre tessuti alla riga superiore di ogni sei. Piastra a pozzetti pre-riempita con 0,9 millilitri di mezzo per saggio. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate sotto gli inserti. Successivamente, posizionare le piastre a sei pozzetti contenenti gli inserti nell'incubatore per un'ora.Preincubazione a 37 gradi Celsius. Al termine del primo periodo di preincubazione, trasferire gli inserti dai pozzetti superiori ai pozzetti inferiori della piastra a sei pozzetti. Rimettere le piastre nell'incubatore per una preincubazione notturna.Collocare il resto del mezzo per il saggio in frigorifero. Dopo la pre-incubazione notturna, i composti da testare possono essere applicati agli inserti di tessuto epidermico. Prima di iniziare il saggio di esposizione ai composti, posizionare tutti i dispositivi necessari, le soluzioni e i composti da testare a temperatura ambiente.Nell'ambiente sterile, pulire con etanolo al 70% tutti i flaconi di materiale non sterile prima di posizionarli all'interno della cappa. All'interno della cappa vanno posti anche il controllo negativo DPBS sterile, il controllo positivo al 5% di SDS e l'acqua distillata, tutti a temperatura ambiente. Va predisposto un flacone di grandi dimensioni per lo smaltimento dei rifiuti.Preparare una piastra a sei pozzetti per ogni sostanza chimica riempiendo solo la fila superiore con 0,9 millilitri di mezzo di saggio per pozzetto. Etichettare ogni piastra con il numero del tessuto e il nome della sostanza chimica.Circa cinque minuti prima dell'esposizione programmata ai prodotti chimici, rimuovere le piastre a sei pozzetti contenenti i tessuti precondizionati dall'incubatrice. Quindi valutare visivamente la superficie dei tessuti.Rimuovere qualsiasi umidità utilizzando bastoncini di cotone sterili senza premere sulla superficie del tessuto. Infine, etichettare i coperchi della piastra a sei pozzetti con i codici o i nomi dei materiali in prova. Non testare più di sei sostanze chimiche, compresi i controlli negativi e positivi, ciascuno in triplice replicato, in un singolo ciclo di prova.Utilizzare un'applicazione chimica e un intervallo di lavaggio di un minuto per la manipolazione di sostanze test note. Seguire le istruzioni riportate nella scheda di dati di sicurezza del materiale o MSDS per campioni codificati o sconosciuti. Rispettare le linee guida per la sicurezza chimica e utilizzare una cappa ventilata.Indossare guanti e proteggere occhi e viso. Applicare i tessuti con sostanze chimiche a intervalli di tempo di un minuto per facilitare il risciacquo dei composti in prova dopo l'esposizione; mantenere le piastre con i tessuti da trattare all'interno della cappa a flusso laminare fino a quando l'ultimo tessuto non è stato trattato. Una pipetta con estremità a bulbo verrà utilizzata durante tutta la procedura per manipolare il tessuto e i composti in prova. La fiamma del becco Bunsen può essere utilizzata per creare la punta a forma di bulbo per testare sostanze chimiche liquide.Distribuire 30 microlitri del campione liquido direttamente sulla superficie del tessuto e avviare immediatamente il cronometro in modo che conti in avanti. Posizionare la maglia di nylon sulla superficie del tessuto. Quando il cronometro raggiunge un minuto, aggiungere il secondo composto liquido. Utilizzare tre tessuti per ogni sostanza chimica da testare, ricordando di aggiungere ciascun composto a intervalli di un minuto.Per testare sostanze semisolide, utilizzare una pipetta a spostamento positivo per dispensare 30 microlitri direttamente sulla superficie del tessuto. Se necessario, distribuire il prodotto chimico con una pipetta Pasteur in modo da coprire interamente l'area del tessuto. Poco prima dell'applicazione della sostanza solida, inumidire la superficie del tessuto con 25 microlitri di DPBS sterile per migliorare il contatto tra la superficie del tessuto e il prodotto chimico da testare; riempire quindi un cucchiaino applicatore da 25 milligrammi con il materiale da test finemente polverizzato.Applicare il prodotto chimico solido in prova sulla superficie del tessuto. Se necessario, utilizzare una pipetta sterile con bulbo per svuotare completamente il cucchiaino. Agitare delicatamente gli inserti per favorire la distribuzione del solido sulla superficie.È possibile utilizzare anche la punta a bulbo della pipetta per adattarsi alla dimensione del tessuto. Non premere sulla superficie del tessuto. Infine, applicare DPBS come controllo negativo e 5% SDS come controllo positivo agli inserti di tessuto, anch'essi in triplicato, dopo aver somministrato l'ultimo tessuto, quindi trasferire tutte le piastre in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per 35 minuti più o meno uno.Durante questa incubazione, assicurarsi di posizionare tutti i materiali necessari per i passaggi di lavaggio nella cappa. Al termine dell'incubazione di 35 minuti, rimuovere tutte le piastre dall'incubatore. Posizionarle nella cappa sterile e attendere un periodo di 60 minuti affinché l'esposizione chimica sia completata per il tessuto della prima dose.Successivamente, iniziare la procedura di lavaggio. Risciacquare i tessuti con DPBS sterile per 15 volte. Per rimuovere qualsiasi residuo del materiale in prova, riempire l'inserto del tessuto utilizzando un flusso costante di DPBS erogato a 1,5 centimetri dalla superficie del tessuto e quindi svuotarlo.Assicurarsi che il flusso di DPBS non sia troppo debole, altrimenti la sostanza in esame non verrà rimossa. Ricordare di mantenere l'intervallo di tempo di un minuto per il lavaggio di quattro inserti con una rete in nylon, lavando cinque volte e rimuovendo con cura la rete con pinzette appuntite. Proseguire quindi con i restanti 10 lavaggi dopo il 15°, risciacquando con la bottiglia per lavaggi completamente immersa l'inserto tre volte con 150 millilitri di DPBS e agitando per rimuovere il residuo del materiale in esame.Infine, risciacquare il tessuto. Inserire una volta dall'interno e una volta dall'esterno con DPBS sterile. Rimuovere l'eccesso di DPBS dal tessuto agitando delicatamente l'inserzione e tamponandola sulla carta da filtro sterile.Successivamente, trasferire i supporti con i tessuti trasferiti sulla membrana nella nuova piastra a sei pozzetti precedentemente riempita con il mezzo per il saggio. Ricordare ancora una volta che tutti questi passaggi devono essere eseguiti entro l'intervallo di un minuto per mantenere il tempo di esposizione di 60 minuti per ciascun campione esposto. Dopo aver risciacquato l'ultimo tessuto, asciugare attentamente la superficie di ciascun tessuto con un bastoncino sterile con estremità di cotone.Se tracce della sostanza chimica sono ancora presenti sulla superficie, provare a rimuoverle utilizzando il bastoncino di cotone sterile. Infine, incubare i tessuti nell'incubatrice per le successive 24 ore. Registrare l'ora di inizio dell'incubazione sul foglio di documentazione dei metodi.Registrare anche tutte le diverse applicazioni nel foglio di documentazione del metodo. Allegare la procedura operativa standard fornita dalla Mat Tech Corporation per lo spostamento delle piastre nella cappa. Trasferire l'inserto nella parte inferiore della piastra a sei pozzetti precedentemente riempita con 0,9 millilitri di mezzo.Raccogliere il mezzo dalla fila superiore e trasferirlo in una piastra a 24 pozzetti pre-etichettata, che verrà quindi posta a meno 20 gradi Celsius. L'analisi delle citochine e/o chemochine rilasciate nel mezzo di coltura è un passaggio facoltativo da eseguire prima dell'analisi. Proseguire con l'incubazione per altre 18 più o meno tre ore per il saggio MTT; etichettare 2 piastre a 24 pozzetti con i nomi chimici o i codici.Ricordare che l'MTT è tossico, quindi indossare guanti protettivi durante la manipolazione. Preparare la soluzione di MTT scongelando il concentrato e diluendolo con il diluente per MTT.Proteggere dalla luce poiché il MTT è sensibile alla luce e utilizzarlo entro due o tre ore. Poiché il MTT si degrada nel tempo, pipettare 300 microlitri di mezzo MTT in ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Rimuovere ora le piastre a 6 pozzetti dall'incubatore.Asciugare delicatamente il fondo degli inserti su carta da filtro e trasferirli nella piastra a 24 pozzetti precedentemente riempita con MTT. Posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore e incubare per tre ore. Ricordare di registrare l'orario di inizio dell'incubazione con MTT nel MDS e rispettare rigorosamente il tempo di incubazione di tre ore per evitare letture diverse di MTT. Al termine dell'incubazione con MTT, utilizzare una pompa da vuoto con trappola per rifiuti tossici per aspirare delicatamente il mezzo contenente MTT da tutti i pozzetti.Riempire nuovamente le pozzette con DPBS ed aspirare. Ripetere nuovamente questo risciacquo altre due volte e assicurarsi che i tessuti siano asciutti dopo l'ultima aspirazione. Dopo i lavaggi, trasferire gli inserti in una nuova piastra a 24 pozzette e immergere gli inserti pipettando delicatamente due millilitri di soluzione estrattiva in ciascun inserto.Il livello salirà al di sopra dei bordi superiori dell'inserzione, coprendo così completamente i tessuti da entrambi i lati. Sigillare la piastra a 24 pozzetti utilizzando un sigillatore termico o parafilm per inibire l'evaporazione dell'estratto. Registrare l'orario di inizio dell'estrazione sul foglio di documentazione delle metodiche ed eseguire l'estrazione per almeno due ore a temperatura ambiente con agitazione delicata su un agitatore per piastre. Al termine del periodo di estrazione, perforare gli inserti con un ago da iniezione o con la punta a bulbo della pipetta e lasciare che l'estratto defluisca nel pozzetto da cui è stato prelevato l'inserzione.Scartare gli inserti perforati e pipettare la soluzione nel pozzetto su e gi&ugrave; tre volte fino a quando non &egrave; omogenea. Per ogni tessuto si pu&ograve; utilizzare anche un agitatore per piastre impostato a 120 giri al minuto. Trasferire due aliquote da 200 microlitri della soluzione di formazano blu in una piastra microtitolatrice a 96 pozzetti con fondo piatto.Trasferire le duplicazioni seguendo lo schema fisso della piastra indicato nel foglio di calcolo allegato a questo protocollo video per i bianchi. Utilizzare isopropanolo, leggere la densità ottica (OD) con uno spettrofotometro per piastre a 96 pozzetti utilizzando una lunghezza d'onda di 570 nanometri, senza impiegare un filtro di riferimento. Inserire i risultati nel foglio di calcolo per il calcolo automatico degli stessi.Tenere conto delle correzioni dovute all'interferenza del prodotto chimico in esame come indicato nel protocollo allegato; un prodotto chimico in esame viene classificato come irritante. Se la percentuale di vitalità del tessuto è inferiore o uguale al 50% a seguito dell'analisi spettrofotometrica, l'OD a 570 dei tessuti NC è maggiore o uguale a 1 e minore o uguale a 2,5, e la vitalità media dei tessuti PC espressa come percentuale rispetto ai tessuti del controllo negativo è inferiore al 20%, e la deviazione standard (SD) calcolata dalle singole percentuali di vitalità tessutale di tre replicati trattati in modo identico è inferiore all'18%, i composti che producono valori di vitalità cellulare inferiori al 50% possono essere considerati irritanti.È stato appena illustrato come eseguire il test di irritazione cutanea validato di 60 minuti e 42 ore utilizzando il modello di cute umana ricostruita Epiderm. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che la maggior parte del test viene effettuata in condizioni sterili o asettiche. Se si rende necessaria una modifica del metodo o se è richiesta una spiegazione più dettagliata di uno qualsiasi dei passaggi della procedura, non esitare a contattarci per ottenere aiuto e consulenza.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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